Inducción de periodontitis mediante una combinación de ligadura e inyección de lipopolisacáridos en un modelo de rata

Resumen

En este estudio, un modelo de rata de inducción de periodontitis se presenta a través de una combinación de ligadura retentiva e inyecciones repetitivas de lipopolisacárido derivado de Porphyromonas gingivalis, durante 14 días alrededor de los primeros molares maxilares. Las técnicas de ligadura e inyección de LPS fueron efectivas para inducir peridontitis, lo que resultó en pérdida ósea alveolar e inflamación.

Resumen

La periodontitis (EP) es una enfermedad inmunoinflamatoria crónica altamente prevalente del periodonto, que resulta en una pérdida de tejido blando gingival, ligamento periodontal, cemento y hueso alveolar. En este estudio, se describe un método simple de inducción de EP en ratas. Proporcionamos instrucciones detalladas para la colocación del modelo de ligadura alrededor de los primeros molares maxilares (M1) y una combinación de inyecciones de lipopolisacárido (LPS), derivado de Porphyromonas gingivalis en el lado mesio-palatino del M1. La inducción de periodontitis se mantuvo durante 14 días, promoviendo la acumulación de biofilm bacteriano y la inflamación. Para validar el modelo animal, la IL-1β, un mediador inflamatorio clave, se determinó mediante un inmunoensayo en el líquido crevicular gingival (GCF), y la pérdida ósea alveolar se calculó mediante tomografía computarizada de haz cónico (CBCT). Esta técnica fue efectiva para promover la recesión gingiva, la pérdida ósea alveolar y un aumento en los niveles de IL-1β en el GCF al final del procedimiento experimental después de 14 días. Este método fue eficaz para inducir la EP, pudiendo así ser utilizado en estudios sobre mecanismos de progresión de la enfermedad y posibles tratamientos futuros.

Introducción

La periodontitis (EP) es la sexta condición de salud pública más prevalente a nivel mundial, afectando aproximadamente al 11% de la población total, siendo una forma avanzada, irreversible y destructiva de enfermedad periodontal ^1,2. La EP es un proceso inflamatorio que afecta los tejidos gingival y periodontal, lo que resulta en recesión gingiva, migración apical del epitelio de unión con desarrollo de bolsas y pérdida de hueso alveolar³. Además, la EP está asociada a varias enfermedades sistémicas, como enfermedades cardiovasculares, obesidad, diabetes y artritis reumatoide, para las cuales los factores ambientales y específicos del huésped juegan un papel significativo ^4,5.

Por lo tanto, la EP es una enfermedad multifactorial iniciada principalmente por la acumulación de placa microbiana - resultante de la disbiosis de las comunidades microbianas - y por una respuesta inmune exagerada del huésped a los patógenos periodontales, que conduce a la descomposición del tejido periodontal ^4,6. Entre varias bacterias periodontales, la bacteria gramnegativa anaerobia Porphyromonas gingivalis es uno de los patógenos clave en la EP⁴. P. gingivalis contiene un complejo lipopolisacárido (LPS) en sus paredes, una molécula conocida por inducir infiltración de leucocitos polimorfonucleares y dilatación vascular en tejidos periodontales inflamados⁷. Esto resulta en la producción de mediadores inflamatorios, como la interleucina 1 (IL-1), IL-6 e IL-8, factor de necrosis tumoral (TNF) o prostaglandinas, con una posterior activación de osteoclastos y resorción ósea, lo que lleva a la destrucción del tejido y la pérdida final de dientes³.

Entre las diferentes ventajas de los modelos animales destacan la capacidad de imitar complejidades celulares como en humanos, o de ser más precisos que los estudios in vitro , que se realizan sobre superficies plásticas con tipos celulares limitados⁸. Para modelar la EP experimentalmente in vivo, se han utilizado diferentes especies animales, como primates no humanos, perros, cerdos, hurones, conejos, ratones y ratas⁹. Sin embargo, las ratas son el modelo animal más ampliamente estudiado para la patogénesis de la EP porque son baratas y fáciles de manejar¹⁰. Su tejido gingival dental tiene características estructurales similares al tejido gingival humano, con un surco gingival poco profundo y epitelio de unión unido a la superficie del diente. Además, como en los humanos, el epitelio de unión facilita el paso de bacterias, materiales extraños y exudados de células inflamatorias ⁹.

Uno de los modelos experimentales más reportados de inducción de EP en ratas es la colocación de ligaduras alrededor de los dientes, que es técnicamente desafiante pero confiable¹⁰. La colocación de la ligadura facilita la placa dental y la acumulación bacteriana, generando una disbiosis en los surcos gingivales, que causa inflamación y destrucción del tejido periodontal¹¹. La pérdida de la inserción periodontal y la reabsorción del hueso alveolar podrían ocurrir en 7 días en este modelo de rata⁸.

Otro modelo animal para la EP consiste en la inyección de LPS en el tejido gingival. Como resultado, se estimulan la osteoclastogénesis y la pérdida ósea. Las características histopatológicas de este modelo son similares a la EP establecida en humanos, caracterizada por niveles más altos de citoquinas proinflamatorias, degradación del colágeno y resorción ósea alveolar ^6,8.

Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue describir un modelo simple de rata de EP experimental basado en las técnicas de inyecciones de P. gingivalis-LPS (Pg-LPS), combinadas con la colocación de ligaduras alrededor de los primeros molares maxilares (M1). Se trata de un modelo con características similares a las observadas en la enfermedad de EP humana, que podría ser utilizado en el estudio de los mecanismos de progresión de la enfermedad y futuros posibles tratamientos.

Protocolo

NOTA: El protocolo experimental del estudio fue aprobado por el Comité Ético de Experimentación Animal del Instituto de Investigación Sanitaria de las Islas Baleares (CEEA-UIB; número de referencia 163/03/21).

1. Anestesia animal y preparación del procedimiento

1. Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos (mordazas bucales de aluminio, explorador dental, lanza de diamante, tijeras quirúrgicas, alicates microquirúrgicos, un portaagujas, un tallador de hollenback, un elevador microquirúrgico perióstico y tijeras microquirúrgicas) (5 min a 135 °C) antes de la cirugía.
2. Preparar todas las soluciones necesarias para el procedimiento en condiciones estériles, como se describe:
   1. Prepare una mezcla de ketamina (60 mg / ml) y xilazina (8 mg / ml) mezclando 1.6 ml de ketamina con 1 ml de xilazina diluida en solución tampón de fosfato (PBS) / solución salina. Conservar el caldo a 4 °C.
   2. Diluir atipamezol a una concentración final de 0,25 mg/ml en PBS/solución salina. Conservar el caldo a 4 °C.
   3. Diluir la buprenorfina a una concentración final de 0,03 mg/ml en PBS/solución salina. Conservar el caldo a 4 °C.
   4. Prepare 1 ml de Pg-LPS (1 mg/ml) en solución salina estéril. Conservar el caldo a -20 °C.
3. Para el experimento, use ratas Wistar hembras y machos, de 12 semanas de edad y con un peso de 210-350 g en el momento de la cirugía. Mantener a los animales alojados en grupos en el ambiente apropiado y en condiciones constantes (20-24 °C, 12 h por día ciclos de luz-oscuridad), con alimentos y agua estándar, ofrecidos ad libitum.
4. Para inducir la anestesia, pesar la rata y administrar la mezcla de ketamina/xilazina a una concentración de 80/10 mg/kg por vía intraperitoneal (IP), utilizando una aguja hipodérmica estéril de 25 g y una jeringa de 1 ml.
5. Después de anestesiar a la rata, coloque al animal boca arriba en una plataforma quirúrgica calentada; Durante el procedimiento, cubra el cuerpo del animal para evitar la pérdida de calor.
   NOTA: La profundidad de la anestesia se evalúa mediante la pérdida del reflejo pedal durante el procedimiento y mediante el monitoreo de los signos vitales. Si es necesario, use un pequeño cono nasal para mantener la anestesia con isoflurano al 2% en oxígeno al 100%. Aplique ungüento oftálmico estéril en ambos ojos después de la inducción de la anestesia para proteger las córneas y evitar la sequedad.
6. Durante los procedimientos, administre oxígeno al 100% usando un pequeño cono nasal y controle la frecuencia del pulso y la saturación de oxígeno mediante oximetría de pulso.
   NOTA: Si la saturación de oxígeno y la frecuencia del pulso caen por debajo del 95% y 190 lpm, respectivamente, detener el procedimiento y colocar al animal en la posición de decúbito lateral hasta alcanzar los valores normales.
7. Abra la boca de la rata con una mordaza bucal de aluminio alrededor de los incisivos (superior e inferior), retrayendo la lengua con ella y estabilizando el maxilar y la mandíbula en una posición de trabajo abierta y cómoda, permitiendo el acceso a los molares mandibulares.
   NOTA: Si el animal necesita ser colocado en decúbito lateral, retire la mordaza bucal antes de cambiar su posición para favorecer la recuperación. Una vez anestesiado el animal, recoger líquido gingival crevicular (GCF) antes de la cirugía (muestra en condiciones basales) (día 0).
8. Recopile GCF como se describe en los siguientes pasos:
   1. Coloque al animal boca arriba en una plataforma quirúrgica y estabilice el maxilar y la mandíbula en una posición abierta con mordazas bucales de aluminio.
   2. Recolectar GCF utilizando un total de cuatro (dos para cada M1) papel absorbente punto nº 30 (0,03 cm diámetro x 3 cm largo), insertándolo en la grieta gingival (espacio entre el epitelio gingival y el esmalte adyacente) alrededor del mesio-palatal del M1 hasta una ligera resistencia. Conserve el punto de papel en la misma posición durante un total de 30 s antes de retirarlo inmediatamente.
   3. Después de la recolección, transferir el punto de papel inmediatamente a un vial de plástico y almacenar a -80 °C hasta el rendimiento del ensayo.

2. Técnica de ligadura retentiva e inyección intragingival de Pg-LPS

NOTA: El modelo de ligadura se creó (día 0) colocando una ligadura de seda trenzada estéril (5/0) alrededor del M1 bilateralmente dentro del surco gingival utilizando instrumentos microquirúrgicos y asegurándolo con los nudos del cirujano en la superficie palatina. Los instrumentos microquirúrgicos utilizados fueron alicates microquirúrgicos, un portaagujas micro, un tallador de hollenback, un elevador microquirúrgico perióstico y tijeras microquirúrgicas. También se utilizaron lupas quirúrgicas con fuente de luz LED (aumento de 3,6x).

1. Coloque la cola distal de la sutura en el lado palatino de la dentición e inserte el segmento proximal entre el contacto de M1 y los segundos molares maxilares (M2).
2. Use el elevador microquirúrgico perióstico para insertar la sutura dentro del surco. Envuelva la ligadura alrededor de la superficie bucal de la M1 con mucho cuidado, ya que los tejidos en este nivel presentan una zona estrecha de encía adherida. En el aspecto palatino, asegúrese de que la sutura esté apretada en ambos extremos para asegurarse de que se introduce en el surco gingival.
   NOTA: Si se observa resistencia al insertar la sutura entre el M1 y el M2, el contacto puede abrirse ligeramente con un explorador dental y una fresa en forma de lanza de diamante.
3. Ate los extremos de la sutura con un nudo de cirujano y recorte las colas lo más cortas posible. Inserte el nudo en el surco.
   NOTA: Las puntas de los instrumentos quirúrgicos pueden causar traumatismo oral y sangrado. Prepare pequeños segmentos de gasa o un hisopo de algodón para eliminar la sangre de la cavidad oral y aplique presión para detener cualquier hemorragia. El manejo cuidadoso de los tejidos blandos con un enfoque microquirúrgico minimiza las complicaciones quirúrgicas y conduce a menos traumatismos tisulares.
4. Después de la posición de la ligadura, inyecte 40 μL de Pg-LPS en solución salina estéril con una aguja hipodérmica estéril de 25 G y una jeringa de 1 ml en el tejido subgingival (entre la raíz o el cuello de un diente y el margen de la encía) en el lado mesio-palatino de la M1 bilateralmente (día 0).

3. Fin del procedimiento

1. Después del posicionamiento de ligadura y la aplicación de Pg-LPS, libere a la rata del estado quirúrgico y colóquela en una jaula individual limpia bajo una lámpara de calor.
2. Inyecte el antagonista Atipamezole (0,5 mg/kg por vía subcutánea [SC]) con una aguja hipodérmica estéril de 25 G y una jeringa de 1 ml.
3. Para aliviar el dolor, inyecte 0,03 mg/kg de buprenorfina, SC.
4. Monitorear la recuperación del animal hasta que los efectos de la operación se reviertan por completo. Aloje individualmente a cada rata en el ambiente apropiado en condiciones constantes (20-24 ° C, 12 h por día ciclos de luz-oscuridad). Ofrecer alimentos y agua desionizada ad libitum.
5. Durante los primeros 2 días después del procedimiento, pesar los animales e inyectar buprenorfina SC dos veces al día para aliviar el dolor.
   NOTA: La buprenorfina se puede administrar antes de comenzar el procedimiento para eliminar el efecto de liquidación.
6. Durante el tiempo del experimento, monitoree a los animales por peso y evaluación general del comportamiento una o dos veces por semana.

4. Seguimiento posterior al procedimiento

NOTA: La inducción de DP se mantuvo durante 14 días para promover la acumulación de biofilm bacteriano y la consecuente inflamación. Las ligaduras deben examinarse y ajustarse, y Pg-LPS se inyecta tres veces por semana (día 2, día 4, día 6, día 8, día 10 y día 12).

1. Examine y ajuste la ligadura (día 2, día 4, día 6, día 8, día 10 y día 12) de la siguiente manera:
   1. Anestesiar con isoflurano al 2% en oxígeno al 100% utilizando una cámara de inducción de anestesia.
   2. Después de anestesiar a la rata, coloque al animal boca arriba y use un pequeño cono nasal durante el procedimiento con isoflurano al 1% en oxígeno al 100% para el mantenimiento de la anestesia animal.
   3. Abra la boca de la rata con la mordaza bucal de aluminio alrededor de los incisivos (superior e inferior), retrayendo la lengua con ella y estabilizando el maxilar y la mandíbula en una posición de trabajo abierta y cómoda, permitiendo el acceso a las ligaduras.
   4. Apriete las ligaduras contra la encía con la ayuda de un elevador microquirúrgico perióstico y asegúrese de que se inserte la sutura de las ligaduras, creando inflamación alrededor de la encía.
      NOTA: Es posible que 7-10 días después de la cirugía, las ligaduras se pierdan. Si esto sucede, siga el protocolo explicado para la inyección de Pg-LPS (paso 2.4).
2. Después del ajuste de la ligadura, inyecte bilateralmente 40 μL de Pg-LPS con una aguja hipodérmica estéril de 25 G y una jeringa de 1 ml en el tejido subgingival en el lado mesio-palatino de la M1 (día 2, día 4, día 6, día 8, día 10 y día 12).
3. Retire el cono de la nariz para la anestesia y coloque a la rata en su jaula. Monitorear la recuperación del animal hasta que los efectos de la anestesia se reviertan por completo.

5. Sacrificio y análisis de animales

NOTA: Existen diferentes opciones para evaluar la progresión de la EP. Aquí, el análisis descrito consiste en una evaluación de citoquinas proinflamatorias en el líquido crevicular gingival (GCF) y una evaluación de la pérdida de hueso alveolar.

1. En el día 14 del estudio (día 14), sacrifique a los animales con_CO2 en una cámara de dióxido de carbono. Se recomienda una tasa de desplazamiento del 30% al 70% del volumen / min de la cámara para roedores.
   NOTA: La falta de respuesta animal al reflejo pedal y la ausencia de signos vitales deben verificarse para confirmar la eutanasia.
2. Recopile GCF como se describe en los siguientes pasos:
   NOTA: El GCF se recolecta antes de la inducción de DP (antes de la cirugía) (día 0) y después de la inducción de DP (después del sacrificio) (día 14).
   1. Coloque al animal boca arriba en una plataforma quirúrgica y estabilice el maxilar y la mandíbula en una posición abierta con mordazas bucales de aluminio.
   2. Recoger el GCF utilizando papel adsorbente punto nº 30 (0,03 cm de diámetro x 3 cm de largo) insertándolo en la grieta gingival alrededor del mesio-palatal del M1 hasta una ligera resistencia. Conserve el punto de papel en la misma posición durante un total de 30 s antes de retirarlo inmediatamente.
   3. Después de la recolección, transferir el punto de papel inmediatamente a un vial de plástico y almacenar a -80 °C hasta el rendimiento del ensayo.
3. Para evaluar las proteínas dentro del GCF, prepare las siguientes soluciones y siga los pasos del método de elución como se describe:
   NOTA: La IL-1β se evalúa en el GCF (día 14) mediante un inmunoensayo, de acuerdo con el protocolo del fabricante.
   1. Prepare el tampón de elución fresco y manténgalo en hielo durante todo el proceso de extracción para inhibir la actividad de la proteasa.
   2. Prepare todas las soluciones necesarias para el tampón de elución como se describe:
      1. Prepare 1 ml de aprotinina (1 mg/ml) en agua ultrapura.
      2. Prepare 10 ml de fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) (200 mM) en metanol.
      3. Añadir 125 μL de PMSF y 250 μL de aprotinina a 24,5 ml de solución de PBS (pH = 7,4) para preparar el tampón de elución.
   3. Disolver un comprimido comercial inhibidor de la fosfatasa con 10 ml de tampón de elución recién preparado durante 10 minutos bajo agitación a 4 °C.
      NOTA: La duración de la elución del GCF es limitada; Usar inmediatamente para centrifugaciones después de la adición de la tableta inhibidora de la fosfatasa dentro de los primeros 30 minutos.
   4. Después de agregar el inhibidor de fosfatasa, agregue 11 μL de tampón de elución completo directamente sobre el tubo con los puntos de papel.
   5. Centrifugar el tubo a 452 x g durante 5 min a 4 °C.
   6. Transfiera el contenido eluyido a un nuevo vial de plástico. Repita este proceso cuatro veces más para obtener un volumen total de 50 μL.
   7. Después de la última centrifugación, añadir un volumen total de 60 μL directamente sobre el punto de papel y centrifugar una última vez a 452 x g durante 5 min a 4 °C.
   8. Utilice el volumen requerido para la evaluación de proteínas.
4. Después de la eutanasia y la recolección de GCF, con la ayuda de tijeras quirúrgicas, corte la mandíbula superior de las ratas. Trate de quitar la máscara de la rata y deje la menor cantidad de tejido blando posible.
5. Coloque la mandíbula en la etapa de microscopio para la visualización y tome una fotografía con el aumento deseado.
6. Coloque la mandíbula directamente en paraformaldehído al 4% (PFA) diluido en PBS. Refrésquese dos veces por semana con un nuevo PFA durante 12 días para una fijación completa.
   PRECAUCIÓN: Los pasos que involucran PFA deben realizarse en una campana extractora siguiendo las recomendaciones de la Hoja de datos de seguridad.
7. Después de la fijación completa de la mandíbula, evalúe la pérdida ósea utilizando un escáner de tomografía computarizada de haz cónico (CBCT), de la siguiente manera:
   1. Abra el PC.
   2. Abra el programa de análisis CBCT.
   3. Seleccione Protocolo de escaneo > Modo de escaneo de dentadura.
   4. Seleccione Campo de visión (FOV) > (11x8) HIRes (90 kV de tensión y 3 mA de corriente).
   5. Coloque el maxilar superior fijo de las ratas en el pórtico.
   6. Haga clic en Siguiente.
   7. Haga clic en el botón de disparo de rayos X (presione el control remoto de rayos X para realizar la emisión y manténgalo presionado durante toda la duración del escaneo).
   8. Si es necesario, reubique el maxilar superior en el centro del plano frontal presionando el botón de control, luego haga clic en el botón de disparo de rayos X (presione el control remoto de rayos X para realizar la emisión y manténgalo presionado durante toda la duración del escaneo).
   9. Haga clic en Siguiente.
   10. Haga clic en el botón de disparo de rayos X (presione el control remoto de rayos X para realizar la emisión y manténgalo presionado durante toda la duración del escaneo).
   11. Si es necesario, reubique la dentadura postiza en el centro del plano sagital presionando el botón de control, luego haga clic en el botón de disparo de rayos X (presione el control remoto de rayos X para realizar la emisión y manténgalo presionado durante toda la duración del escaneo).
   12. Haga clic en Siguiente.
   13. Haga clic en el botón Inicio (pulse el mando a distancia de rayos X para realizar la emisión y manténgalo presionado durante toda la duración del examen). Espere hasta recibir un mensaje de procesamiento y, a continuación, siga las instrucciones que se muestran.
   14. Aparece una vista de ventana. Regula el gris al 65% y haz clic en Aplicar.
   15. Para guardar el escaneo, haga clic en Archivo y guárdelo en formato DICOM. Luego, haga clic en Todas las imágenes y en la ventana de selección de exportación DICOM, seleccione todos los parámetros mostrados (imagen inicial, axial original, axial reformateada, multiplanar) y seleccione el tipo predefinido.
8. Procese las imágenes representativas bidimensionales y sagitales de los molares maxilares utilizando un programa de análisis, de la siguiente manera:
   1. Abra el software.
   2. Haga clic en Archivo y abrir y, a continuación, seleccione la carpeta con imágenes en formato DICOM y haga clic en Abrir.
   3. Espere hasta que aparezca la ventana "Convertir a 8 bits", seleccione el rango de 0 a 6,000 y haga clic en Aceptar.
   4. Haga clic en Imágenes sin procesar.
   5. Defina la parte superior e inferior de la selección para limitar la región de interés. Busque la primera y la última imagen donde aparece el hueso alveolar y selecciónelo con la parte superior de selección y la parte inferior de los comandos de selección .
      NOTA: Se pueden exportar imágenes bidimensionales representativas del hueso alveolar de los molares, como en la Figura 3A,B.
   6. Para imágenes representativas sagitales, haga clic en Alternar barra de perfil.
   7. Dibuje una línea sagital en el centro del paladar y haga clic en Modelo de rebanada. Determine los parámetros para delimitar la región de interés (espaciado entre sectores: 1; número de sectores: 100) y haga clic en Aceptar. Espere hasta que finalice el modelo de resegmentación. Finalmente, haga clic en guardar imágenes recortadas.
      NOTA: Se podrían exportar imágenes sagitales representativas del hueso alveolar de los molares, como en la Figura 3C,D.

Resultados

En la Figura 1 se presenta una línea de tiempo de los pasos experimentales. La Figura 2A muestra una imagen de la mandibula, después de la intervención quirúrgica, con colocación de ligaduras alrededor del surco del M1 en el momento 0 del experimento. La Figura 2B muestra cómo, después de 14 días del procedimiento, la ligadura alrededor del M1 ingresa al surco gingival, causando inflamación de la encía y acumulación infil...

Discusión

Este método describe la inducción de DP en ratas siguiendo una técnica combinada de inyecciones de Pg-LPS y colocación de ligaduras alrededor del M1, revelando que se podrían inducir cambios significativos en los tejidos periodontales y el hueso alveolar en 14 días después de este método.

Durante este procedimiento, se debe prestar atención a diferentes pasos críticos. Durante la anestesia animal y la preparación del procedimiento, evaluar la anestesia adecuada durante el p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adsorbent paper point nº30	Proclinc	8187
Aprotinin	Sigma-Aldrich	A1153
Atipamezole	Dechra	573751.5	Revanzol 5 mg/mL
Braided silk ligature (5/0)	Laboratorio Arago Sl	613112
Buprenorphine	Richter pharma	578816.6	Bupaq 0.3 mg/mL
Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner	MyRay	hyperion X9	Model Hyperion X9
CTAn software	SkyScan		Version 1.13.4.0
Dental explorer	Proclinc	99743
Diamond lance-shaped bur	Dentaltix	IT21517
Food maintenance diet	Sodispain research	ROD14
Heated surgical platform	PetSavers
Hollenback carver	Hu-FRIEDY	HF45234
Hypodermic needle	BD	300600	25G X 5/8” - 0,5 X 16 MM
Isoflurane	Karizoo		Isoflutek 1000mg/g
Ketamine	Dechra	581140.6	Anesketin 100 mg/mL
Lipopolysaccharide  derived from P.Gingivalis	InvivoGen	TLRL-PGLPS
Methanol	Fisher Scientific	M/4000/PB08
Micro needle holter	Fehling Surgical Instruments	KOT-6
Microsurgical pliers	KLS Martin	12-384-06-07
microsurgical scissors	S&T microsurgical instruments	SDC-15 RV
Monitor iMEC 8 Vet	Mindray
Multiplex bead immunoassay	Procartaplex, Thermo fisher Scientific	PPX-05
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	8187151000
Periosteal microsurgical elevator	Dentaltix	CU19112468
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)	Roche	10837091001
Phosphate Buffer Solution (PBS)	Capricorn Scientific	PBS-1A
PhosSTOP	Roche	4906845001	Commercial phosphatase inhibitor tablet
Plastic vial	SPL Lifesciencies	60015	1.5mL
Saline	Cinfa	204024.3
Stereo Microscope	Zeiss		Model SteREO Discovery.V12
Surgical loupes led light	Zeiss
Surgical scissors	Zepf Surgical	08-1701-17
Syringe	BD plastipak	303172	1mL
Veterinary dental micromotor	Eickemeyer	174028
Xylazine	Calier	20102-003	Xilagesic 20 mg/mL