Bir sıçan modelinde ligatür ve lipopolisakkarit enjeksiyonunun bir kombinasyonu ile periodontitisin indüksiyonu

Özet

Bu çalışmada, periodontitis indüksiyonunun sıçan modeli, ilk maksiller azı dişlerinin etrafında 14 gün boyunca, Porphyromonas gingivalis'ten türetilen tekrarlayan lipopolisakkarit enjeksiyonları ve geciktirici ligatür kombinasyonu ile sunulmuştur. Ligasyon ve LPS enjeksiyon teknikleri peridonti indüklemede etkiliydi, bu da alveoler kemik kaybı ve inflamasyona neden oldu.

Özet

Periodontitis (PD), periodonsiyumun oldukça yaygın, kronik immün-inflamatuar bir hastalığı olup, dişeti yumuşak dokusu, periodontal ligament, sementum ve alveoler kemik kaybına neden olur. Bu çalışmada, sıçanlarda basit bir PD indüksiyon yöntemi tanımlanmıştır. Ligatür modelinin ilk maksiller azı dişlerinin (M1) etrafına yerleştirilmesi ve M1'in mesio-palatal tarafındaki Porphyromonas gingivalis'ten türetilen lipopolisakkarit (LPS) enjeksiyonlarının bir kombinasyonu için ayrıntılı talimatlar sunuyoruz. Periodontitisin indüksiyonu 14 gün boyunca korundu ve bakteri biyofilm ve inflamasyon birikimini teşvik etti. Hayvan modelini doğrulamak için, anahtar bir inflamatuar mediatör olan IL-1β, dişeti oluk sıvısında (GCF) bir immünoassay ile belirlendi ve koni ışınlı bilgisayarlı tomografi (CBCT) kullanılarak alveoler kemik kaybı hesaplandı. Bu teknik, 14 gün sonra deneysel prosedürün sonunda dişeti çekilmesini, alveoler kemik kaybını ve GCF'de IL-1β düzeylerinde bir artışı teşvik etmede etkiliydi. Bu yöntem PD'yi indüklemede etkiliydi, böylece hastalık ilerleme mekanizmaları ve gelecekteki olası tedaviler üzerine yapılan çalışmalarda kullanılabiliyordu.

Giriş

Periodontitis (PH), dünya çapında en sık görülen altıncı halk sağlığı durumudur ve toplam popülasyonun yaklaşık %11'ini etkileyen, periodontal hastalığın gelişmiş, geri dönüşümsüz ve yıkıcı bir formudur ^1,2. PD, dişeti ve periodontal dokuları etkileyen, dişeti çekilmesi, bileşke epitelinin cep gelişimi ile apikal migrasyonu ve alveoler kemik kaybı ile sonuçlanan inflamatuar bir süreçtir³. Ayrıca, PH kardiyovasküler hastalık, obezite, diyabet ve romatoid artrit gibi çevresel ve konakçıya özgü faktörlerin önemli rol oynadığı çeşitli sistemik hastalıklarla ilişkilidir ^4,5.

Bu nedenle, PD esas olarak mikrobiyal plak birikimi ile başlayan multifaktöriyel bir hastalıktır - mikrobiyal toplulukların disbiyozundan kaynaklanır - ve periodontal patojenlere karşı abartılı bir konakçı immün yanıtı ile başlar ve periodontal dokunun parçalanmasına yol açar ^4,6. Birkaç periodontal bakteri arasında, gram-negatif anaerobik bakteri Porphyromonas gingivalis, PD^4'teki anahtar patojenlerden biridir. P. gingivalis, duvarlarında kompleks bir lipopolisakkarit (LPS), iltihaplı periodontal dokularda polimorfonükleer lökosit infiltrasyonu ve vasküler dilatasyonu indüklediği bilinen bir molekül^{içerir 7}. Bu, interlökin 1 (IL-1), IL-6 ve IL-8, tümör nekroz faktörü (TNF) veya prostaglandinler gibi enflamatuar mediatörlerin üretilmesiyle sonuçlanır, daha sonra osteoklast aktivasyonu ve kemik rezorpsiyonu ile doku yıkımına ve nihai diş kaybına yol açar³.

Hayvan modellerinin farklı avantajları arasında, insanlarda olduğu gibi hücresel karmaşıklıkları taklit etme veya sınırlı hücre tiplerine sahip plastik yüzeylerde gerçekleştirilen in vitro çalışmalardan daha doğru olma kapasitesi^{bulunmaktadır 8}. PD'yi deneysel olarak in vivo olarak modellemek için, insan olmayan primatlar, köpekler, domuzlar, yaban gelinciği, tavşanlar, fareler ve sıçanlar gibi farklı hayvan türleri kullanılmıştır⁹. Bununla birlikte, sıçanlar PD'nin patogenezi için en çok çalışılan hayvan modelidir, çünkü ucuz ve kullanımı kolaydır¹⁰. Diş eti dokusu, insan dişeti dokusuna benzer yapısal özelliklere sahiptir, sığ bir dişeti sulkusu ve diş yüzeyine bağlı bileşke epitelidir. Ayrıca, insanlarda olduğu gibi, bileşke epiteli, bakteriyel, yabancı maddelerin ve eksüdaların enflamatuar hücrelerden geçişini kolaylaştırır ⁹.

Sıçanlarda PD indüksiyonunun en çok bildirilen deneysel modellerinden biri, teknik olarak zor ama güvenilir olan dişlerin etrafına ligatürlerin yerleştirilmesidir¹⁰. Ligatür yerleşimi diş plağı ve bakteri birikimini kolaylaştırır, dişeti sulcisinde periodontal doku iltihabına ve yıkımına neden olan bir dysbiosis oluşturur¹¹. Bu sıçan model^8'de periodontal ataşman kaybı ve alveoler kemiğin rezorpsiyonu 7 gün içinde ortaya çıkabilir.

PD için başka bir hayvan modeli, LPS'nin dişeti dokusuna enjekte edilmesinden oluşur. Sonuç olarak, osteoklastogenez ve kemik kaybı uyarılır. Bu modelin histopatolojik özellikleri, daha yüksek proinflamatuar sitokinler, kollajen yıkımı ve alveoler kemik rezorpsiyonu ^6,8 ile karakterize insan tarafından kurulan PD'ye benzer.

Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, P. gingivalis-LPS (Pg-LPS) enjeksiyonlarının tekniklerine dayanan deneysel PD'nin basit bir sıçan modelini ve ilk maksiller azı dişlerinin (M1) etrafına ligatür yerleştirilmesini tanımlamaktır. Bu, insan PD hastalığında gözlenenlere benzer özelliklere sahip, hastalık ilerleme mekanizmalarının ve gelecekteki olası tedavilerin incelenmesinde kullanılabilecek bir modeldir.

Protokol

NOT: Çalışmanın deneysel protokolü Balear Adaları Sağlık Araştırma Enstitüsü Hayvan Deneyleri Etik Kurulu (CEEA-UIB; referans numarası 163/03/21) tarafından onaylanmıştır.

1. Hayvan anestezisi ve prosedür hazırlama

1. Ameliyattan önce tüm cerrahi aletleri (alüminyum ağız tıkaçları, diş kaşifi, elmas mızrak, cerrahi makas, mikrocerrahi pense, mikro iğne tutucu, hollenback oymacı, periosteal mikrocerrahi asansör ve mikrocerrahi makas) sterilize edin (135 ° C'de 5 dakika).
2. Açıklandığı gibi steril koşullarda prosedür için gerekli tüm çözeltileri hazırlayın:
   1. 1.6 mL Ketamin'i Fosfat Tampon Çözeltisi (PBS) / salin içinde seyreltilmiş 1 mL Ksilazin ile karıştırarak Ketamin (60 mg / mL) ve Ksilazin (8 mg / mL) karışımı hazırlayın. Stoğu 4 °C'de saklayın.
   2. Atipamezol'ü PBS / salin içinde 0.25 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. Stoğu 4 °C'de saklayın.
   3. Buprenorfin'i PBS / salin içinde 0.03 mg / mL'lik nihai bir konsantrasyona seyreltin. Stoğu 4 °C'de saklayın.
   4. Steril salin içinde 1 mL Pg-LPS (1 mg/mL) hazırlayın. Stoğu -20 °C'de saklayın.
3. Deney için, 12 haftalık ve ameliyat sırasında 210-350 g ağırlığında dişi ve erkek Wistar sıçanları kullanın. Hayvanları uygun ortam ve sabit koşullar altında (20-24 ° C, günde 12 saat aydınlık-karanlık döngüleri), yiyecek ve standart su ile ad libitum sunulan gruplar halinde barındırın.
4. Anesteziyi indüklemek için, sıçanı tartın ve 25 G steril hipodermik iğne ve 1 mL şırınga kullanarak intraperitoneal olarak 80/10 mg / kg (IP) konsantrasyonda Ketamin / Ksilazin karışımını uygulayın.
5. Sıçan uyuşturulduktan sonra, hayvanı ısıtılmış bir cerrahi platforma sırt üstü yerleştirin; İşlem sırasında, ısı kaybını önlemek için hayvanın vücudunu örtün.
   NOT: Anestezi derinliği, işlem sırasında pedal refleksinin kaybı ve vital bulguların izlenmesi ile değerlendirilir. Gerekirse,% 100 oksijende% 2 İzofluran ile anesteziyi sürdürmek için küçük bir burun konisi kullanın. Korneaları korumak ve kurumayı önlemek için anestezi indüksiyonundan sonra her iki göze steril oftalmik merhem uygulayın.
6. İşlemler sırasında, küçük bir burun konisi kullanarak% 100 oksijen uygulayın ve nabız oksimetresi ile nabız hızını ve oksijen doygunluğunu izleyin.
   NOT: Oksijen doygunluğu ve nabız hızı sırasıyla% 95 ve 190 bpm'nin altına düşerse, prosedürü durdurun ve normal değerlere ulaşana kadar hayvanı lateral dekübit pozisyonuna getirin.
7. Kesici dişlerin etrafında (üst ve alt) alüminyum bir ağız tıkaç kullanarak sıçan ağzını açın, dili onunla geri çekin ve maksilla ve mandibulayı açık, rahat bir çalışma pozisyonunda stabilize ederek mandibular azı dişlerine erişim sağlayın.
   NOT: Hayvanın lateral dekübitusa yerleştirilmesi gerekiyorsa, iyileşmeyi desteklemek için konumunu değiştirmeden önce ağız tıkaçlarını çıkarın. Hayvan uyuşturulduktan sonra, ameliyattan önce dişeti oluk sıvısı (GCF) toplayın (bazal koşullarda örnek) (gün 0).
8. GCF'yi aşağıdaki adımlarda açıklandığı şekilde toplayın:
   1. Hayvanı cerrahi bir platforma sırt üstü yerleştirin ve maksilla ve mandibulayı alüminyum ağız tıkaçlarıyla açık bir konumda stabilize edin.
   2. GCF'yi, M1'in mesio-palatalının etrafındaki dişeti yarığına (dişeti epiteli ile bitişik emaye arasındaki boşluk) hafif bir direnç gösterene kadar yerleştirerek toplam 30 (0,03 cm çap x 3 cm uzunluk) numaralı toplam dört (her M1 için iki) emici kağıt noktası kullanarak toplayın. Hemen çıkarmadan önce kağıt noktasını toplam 30 saniye boyunca aynı konumda tutun.
   3. Toplandıktan sonra, kağıt noktasını hemen plastik bir şişeye aktarın ve tahlil performansına kadar -80 ° C'de saklayın.

2. Geciktirici ligatür tekniği ve intragingival Pg -LPS enjeksiyonu

NOT: Ligatür modeli, mikrocerrahi aletler kullanılarak dişeti sulkus içine çift taraflı olarak M1 etrafına steril örgülü ipek bir ligatür (5/0) yerleştirilerek ve damak yüzeyinde cerrahın düğümleri ile sabitlenerek oluşturuldu (gün 0). Kullanılan mikrocerrahi aletler mikrocerrahi pense, mikro iğne tutucu, hollenback oymacı, periosteal mikrocerrahi asansör ve mikrocerrahi makastı. LED ışık kaynağına sahip cerrahi büyüteçler de kullanıldı (3.6x büyütme).

1. Dikişin distal kuyruğunu dişlenmenin damak tarafına yerleştirin ve proksimal segmenti M1 ve ikinci maksiller azı dişlerinin (M2) teması arasına yerleştirin.
2. Sütürü sulkus içine yerleştirmek için periosteal mikrocerrahi asansörü kullanın. Ligatürü M1'in bukkal yüzeyinin etrafına çok dikkatli bir şekilde sarın, çünkü bu seviyedeki dokular dar bir bağlı dişeti bölgesi sunar. Damak yönünde, dişeti sulkusuna sürüldüğünden emin olmak için dikişin her iki ucunda sıkıldığından emin olun.
   NOT: M1 ve M2 arasına dikiş yerleştirilirken direnç gözlenirse, temas bir diş kaşifi ve elmas mızrak şeklindeki bur kullanılarak hafifçe açılabilir.
3. Dikişin uçlarını bir cerrahın düğümü ile bağlayın ve kuyrukları mümkün olduğunca kısa kesin. Düğümü sulkusa yerleştirin.
   NOT: Cerrahi aletlerin uçları oral travmaya ve kanamaya neden olabilir. Ağız boşluğundan kanı çıkarmak için küçük gazlı bez parçaları veya pamuklu çubuk hazırlayın ve herhangi bir kanamayı durdurmak için basınç uygulayın. Mikrocerrahi yaklaşımla dikkatli yumuşak doku yönetimi, cerrahi komplikasyonları en aza indirir ve daha az doku travmasına yol açar.
4. Ligatür konumlandırmadan sonra, M1'in mezio-palatal tarafındaki subgingival dokuya (bir dişin kökü veya boynu ile diş eti marjı arasında) 25 G steril hipodermik iğne ve 1 mL şırınga ile steril salin içinde 40 μL Pg-LPS enjekte edin (gün 0).

3. Prosedürün sonu

1. Ligasyon konumlandırma ve Pg-LPS uygulamasından sonra, sıçanı cerrahi durumdan serbest bırakın ve bir ısı lambasının altındaki temiz bir bireysel kafese yerleştirin.
2. Antagonist Atipamezole'ye (deri altından 0.5 mg / kg (SC)) 25 G steril hipodermik iğne ve 1 mL şırınga ile enjekte edin.
3. Ağrıyı gidermek için, 0.03 mg / kg Buprenorfin, SC enjekte edin.
4. Operasyonun etkileri tamamen tersine dönene kadar hayvanın iyileşmesini izleyin. Her sıçanı ayrı ayrı sabit koşullar altında uygun ortamda barındırın (20-24 ° C, günde 12 saat aydınlık-karanlık döngüleri). Yiyecek ve deiyonize su ad libitum sunun.
5. İşlemden sonraki ilk 2 gün boyunca, hayvanları tartın ve ağrıyı gidermek için günde iki kez Buprenorfin SC enjekte edin.
   NOT: Buprenorfin, sarma etkisini ortadan kaldırmak için prosedüre başlamadan önce uygulanabilir.
6. Deney sırasında, hayvanları haftada bir veya iki kez ağırlık ve genel davranış değerlendirmesine göre izleyin.

4. İşlem sonrası takip

NOT: PD indüksiyonu, bakteri biyofilm birikimini ve bunun sonucunda inflamasyonu teşvik etmek için 14 gün boyunca korunmuştur. Ligatürler incelenmeli ve ayarlanmalıdır ve Pg-LPS haftada üç kez enjekte edilir (gün 2, gün 4, gün 6, gün 8, gün 10 ve gün 12).

1. Ligatürü (2. gün, 4. gün, 6. gün, 8. gün, 10. gün ve 12. gün) aşağıdaki gibi inceleyin ve ayarlayın:
   1. Bir anestezi indüksiyon odası kullanarak% 100 oksijende% 2 izofluran ile anestezi yapın.
   2. Sıçan uyuşturulduktan sonra, hayvanı sırtına yerleştirin ve hayvan anestezisinin sürdürülmesi için% 100 oksijende% 1 izofluran ile prosedür sırasında küçük bir burun konisi kullanın.
   3. Kesici dişlerin etrafındaki (üst ve alt) alüminyum ağız tıkaçlarını kullanarak sıçan ağzını açın, dili onunla geri çekin ve maksilla ve mandibulayı açık, rahat bir çalışma pozisyonunda stabilize ederek ligatürlere erişim sağlayın.
   4. Periosteal mikrocerrahi asansör yardımıyla bağları dişetine karşı sıkın ve bağların dikişinin yerleştirildiğinden emin olun, bu da dişeti çevresinde iltihap oluşturur.
      NOT: Ameliyattan 7-10 gün sonra bağların kaybolması mümkündür. Bu durumda, Pg-LPS enjeksiyonu için açıklanan protokolü izleyin (adım 2.4).
2. Ligatür ayarlamasından sonra, M1'in mesio-palatal tarafındaki subgingival dokuya 25 G steril hipodermik iğne ve 1 mL şırınga ile iki taraflı olarak 40 μL Pg-LPS enjekte edin (gün 2, gün 4, gün 6, gün 8, gün 10 ve gün 12).
3. Anestezi için burun konisini çıkarın ve sıçanı kafesine yerleştirin. Anestezinin etkileri tamamen tersine dönene kadar hayvanın iyileşmesini izleyin.

5. Hayvan kurban etme ve analiz

NOT: PD'nin ilerlemesini değerlendirmek için farklı seçenekler vardır. Burada tarif edilen analiz, dişeti oluk sıvısındaki (GCF) pro-inflamatuar sitokinlerin değerlendirilmesi ve alveoler kemik kaybının değerlendirilmesinden oluşmaktadır.

1. Çalışmanın 14. gününde (14. gün), CO_2'li hayvanları bir karbondioksit odasında kurban edin. Kemirgenler için oda hacminin/dak'nın %30 ila %70'lik bir yer değiştirme oranı önerilir.
   NOT: Ötanazi doğrulamak için pedal refleksine hayvan tepkisi eksikliği ve hayati belirtilerin yokluğu doğrulanmalıdır.
2. GCF'yi aşağıdaki adımlarda açıklandığı şekilde toplayın:
   NOT: GCF, PD indüksiyonundan önce (ameliyattan önce) (gün 0) ve PD indüksiyonundan sonra (kurbandan sonra) (gün 14) toplanır.
   1. Hayvanı cerrahi bir platforma sırt üstü yerleştirin ve maksilla ve mandibulayı alüminyum ağız tıkaçlarıyla açık bir konumda stabilize edin.
   2. GCF'yi 30 numaralı adsorban kağıt noktasını (0,03 cm çap x 3 cm uzunluk) kullanarak, hafif bir direnç gösterene kadar M1'in mesio-palatal etrafındaki dişeti yarığına yerleştirerek toplayın. Hemen çıkarmadan önce kağıt noktasını toplam 30 saniye boyunca aynı konumda tutun.
   3. Toplandıktan sonra, kağıt noktasını hemen plastik bir şişeye aktarın ve tahlil performansına kadar -80 ° C'de saklayın.
3. GCF içindeki proteinleri değerlendirmek için, aşağıdaki çözeltileri hazırlayın ve açıklandığı gibi elüsyon yönteminin adımlarını izleyin:
   NOT: IL-1β, üreticinin protokolüne göre bir immünoassay kullanılarak GCF'de (14. gün) değerlendirilir.
   1. Elüsyon tamponunu taze hazırlayın ve proteaz aktivitesini inhibe etmek için tüm ekstraksiyon işlemi boyunca buz üzerinde tutun.
   2. Elüsyon tamponu için gereken tüm çözümleri açıklandığı gibi hazırlayın:
      1. Ultra saf suda 1 mL Aprotinin (1 mg / mL) hazırlayın.
      2. Metanol içinde 10 mL fenilmetilsülfonilflorür (PMSF) (200 mM) hazırlayın.
      3. Elüsyon tamponunu hazırlamak için 24.5 mL PBS çözeltisine (pH = 7.4) 125 μL PMSF ve 250 μL Aprotinin ekleyin.
   3. Bir ticari fosfataz inhibitörü tableti, 10 mL taze hazırlanmış elüsyon tamponu ile 4 ° C'de ajitasyon altında 10 dakika boyunca çözün.
      NOT: GCF elüsyonunun süresi sınırlıdır; İlk 30 dakika içinde fosfataz inhibitörü tabletinin eklenmesinden sonra santrifüjler için hemen kullanın.
   4. Fosfataz inhibitörünü ekledikten sonra, kağıt noktalarıyla doğrudan tüpün üzerine 11 μL tam elüsyon tamponu ekleyin.
   5. Tüpü 452 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
   6. Salınan içeriği yeni bir plastik şişeye aktarın. 50 μL toplam hacim elde etmek için bu işlemi dört kez daha tekrarlayın.
   7. Son santrifüjlemeden sonra, doğrudan kağıt noktasına toplam 60 μL hacim ekleyin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 452 x g'de son bir kez santrifüj yapın.
   8. Protein değerlendirmesi için salınan gerekli hacmi kullanın.
4. Ötanazi ve GCF toplanmasından sonra, cerrahi makas yardımıyla, sıçanların üstün çenesini kesin. Sıçanın maskesini soymaya çalışın ve mümkün olduğunca az yumuşak doku bırakın.
5. Görselleştirme için çeneyi mikroskop aşamasında konumlandırın ve istenen büyütmede bir resim çekin.
6. Çeneyi doğrudan PBS'de seyreltilmiş %4 paraformaldehit (PFA) içine yerleştirin. Tam bir sabitleme için haftada iki kez yeni PFA ile 12 gün boyunca yenileyin.
   DİKKAT: PFA içeren adımlar, Güvenlik Bilgi Formu tavsiyelerine uygun olarak bir duman davlumbazında gerçekleştirilmelidir.
7. Tam çene fiksasyonundan sonra, bir koni ışınlı bilgisayarlı tomografi (CBCT) tarayıcısı kullanarak kemik kaybını aşağıdaki gibi değerlendirin:
   1. Bilgisayarı açın.
   2. CBCT analiz programını açın.
   3. Scan Protocol (Tarama Protokolü) > Protez Tarama Modu (Protez Tarama Modu) seçeneğini belirleyin.
   4. Görüş Alanı (FOV) > (11x8) HIRes (90 kV voltaj ve 3 mA akım) öğesini seçin.
   5. Sıçanların sabit üst maksillasını portal içine yerleştirin.
   6. İleri'ye tıklayın.
   7. X-ışını ateşleme düğmesine tıklayın (emisyonu yapmak için X-ışını uzaktan kumandasına basın ve tarama süresi boyunca basılı tutun).
   8. Gerekirse, kontrol düğmesine basarak üst maksillayı ön düzlemin ortasına yerleştirin, ardından X-ışını ateşleme düğmesine tıklayın (emisyonu yapmak ve tarama süresi boyunca basılı tutmak için X-ışını uzaktan kumandasına basın).
   9. İleri'ye tıklayın.
   10. X-ışını ateşleme düğmesine tıklayın (emisyonu yapmak için X-ışını uzaktan kumandasına basın ve tarama süresi boyunca basılı tutun).
   11. Gerekirse, kontrol düğmesine basarak protezi sagital düzlemin ortasına yerleştirin, ardından X-ışını ateşleme düğmesine tıklayın (emisyonu yapmak ve tarama süresi boyunca basılı tutmak için X-ışını uzaktan kumandasına basın).
   12. İleri'ye tıklayın.
   13. Başlat düğmesine tıklayın (emisyonu yapmak için X-ışını uzaktan kumandasına basın ve sınav süresi boyunca basılı tutun). Bir işleme iletisi alana kadar bekleyin ve ardından gösterilen yönergeleri izleyin.
   14. Bir pencere görünümü görüntülenir. Griyi %65'te düzenleyin ve Uygula'yı tıklayın.
   15. Taramayı kaydetmek için Dosya'ya tıklayın ve DICOM formatında kaydedin. Ardından, Tüm Görüntüler'i tıklatın ve DICOM dışa aktarma seçimi penceresinde, gösterilen tüm parametreleri seçin (ilk görüntü, orijinal eksenel, yeniden biçimlendirilmiş eksenel, çok düzlemli) ve önceden tanımlanmış türü seçin.
8. Maksiller azı dişlerinin iki boyutlu ve sagital temsili görüntülerini bir analiz programı kullanarak aşağıdaki gibi işleyin:
   1. Yazılımı açın.
   2. Dosya ve Aç'ı tıklatın, ardından DICOM biçiminde görüntülerin bulunduğu klasörü seçip Aç'ı tıklatın.
   3. "8 bit'e dönüştür" penceresi görünene kadar bekleyin, 0 ile 6.000 arasındaki aralığı seçin ve Tamam'ı tıklayın.
   4. Raw görüntüler'i tıklayın.
   5. İlgilenilen bölgeyi sınırlamak için seçimin üst ve alt kısımlarını tanımlayın. Alveolar kemiğin göründüğü ilk ve son görüntüleri arayın ve seçimin üst ve alt kısım komutlarıyla seçin.
      NOT: Azı dişlerinin alveolar kemiğinin temsili iki boyutlu görüntüleri, Şekil 3A, B'de olduğu gibi dışa aktarılabilir.
   6. Sagital temsili görüntüler için, Profil çubuğunu değiştir'e tıklayın.
   7. Damak ortasına bir sagital çizgi çizin ve Modeli yeniden düzenle'yi tıklayın. İlgilenilen bölgeyi sınırlamak için parametreleri belirleyin (dilim aralığı: 1; dilim sayısı: 100) ve Tamam'ı tıklatın. Yeniden dilimleme modeli sona erene kadar bekleyin. Son olarak, Yeniden Dilimlenmiş görüntüleri kaydet'i tıklatın.
      NOT: Azı dişlerinin alveolar kemiğinin temsili sagital hayalleri, Şekil 3C, D'de olduğu gibi ihraç edilebilir.

Sonuçlar

Deneysel adımların zaman çizelgesi Şekil 1'de sunulmuştur. Şekil 2A , cerrahi müdahaleden sonra mandibulanın bir görüntüsünü, deneyin 0 zamanında M1'in sulkusunun etrafına bağ yerleştirilmesiyle göstermektedir. Şekil 2B , işlemden 14 gün sonra, M1 etrafındaki bağın dişeti sulkusuna nasıl girdiğini, dişetinin iltihaplanmasına ve birikime sızmasına neden olduğunu göstermektedir.

Tartışmalar

Bu yöntem, Pg-LPS enjeksiyonlarının kombine tekniğini ve M1 etrafındaki ligatür yerleşimini takiben sıçanlarda PD'nin indüksiyonunu açıklamakta ve periodontal dokularda ve alveoler kemikte önemli değişikliklerin bu yöntemi takip eden 14 gün içinde indüklenebileceğini ortaya koymaktadır.

Bu prosedür sırasında, farklı kritik adımlara dikkat edilmelidir. Hayvan anestezisi ve prosedür hazırlığı sırasında, cerrahi işlem sırasında uygun anestezinin değer...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adsorbent paper point nº30	Proclinc	8187
Aprotinin	Sigma-Aldrich	A1153
Atipamezole	Dechra	573751.5	Revanzol 5 mg/mL
Braided silk ligature (5/0)	Laboratorio Arago Sl	613112
Buprenorphine	Richter pharma	578816.6	Bupaq 0.3 mg/mL
Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner	MyRay	hyperion X9	Model Hyperion X9
CTAn software	SkyScan		Version 1.13.4.0
Dental explorer	Proclinc	99743
Diamond lance-shaped bur	Dentaltix	IT21517
Food maintenance diet	Sodispain research	ROD14
Heated surgical platform	PetSavers
Hollenback carver	Hu-FRIEDY	HF45234
Hypodermic needle	BD	300600	25G X 5/8” - 0,5 X 16 MM
Isoflurane	Karizoo		Isoflutek 1000mg/g
Ketamine	Dechra	581140.6	Anesketin 100 mg/mL
Lipopolysaccharide  derived from P.Gingivalis	InvivoGen	TLRL-PGLPS
Methanol	Fisher Scientific	M/4000/PB08
Micro needle holter	Fehling Surgical Instruments	KOT-6
Microsurgical pliers	KLS Martin	12-384-06-07
microsurgical scissors	S&T microsurgical instruments	SDC-15 RV
Monitor iMEC 8 Vet	Mindray
Multiplex bead immunoassay	Procartaplex, Thermo fisher Scientific	PPX-05
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	8187151000
Periosteal microsurgical elevator	Dentaltix	CU19112468
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)	Roche	10837091001
Phosphate Buffer Solution (PBS)	Capricorn Scientific	PBS-1A
PhosSTOP	Roche	4906845001	Commercial phosphatase inhibitor tablet
Plastic vial	SPL Lifesciencies	60015	1.5mL
Saline	Cinfa	204024.3
Stereo Microscope	Zeiss		Model SteREO Discovery.V12
Surgical loupes led light	Zeiss
Surgical scissors	Zepf Surgical	08-1701-17
Syringe	BD plastipak	303172	1mL
Veterinary dental micromotor	Eickemeyer	174028
Xylazine	Calier	20102-003	Xilagesic 20 mg/mL