Induktion von Parodontitis durch eine Kombination aus Ligatur- und Lipopolysaccharid-Injektion im Rattenmodell

Zusammenfassung

In dieser Studie wird ein Rattenmodell zur Induktion von Parodontitis durch eine Kombination aus remanenter Ligatur und wiederholten Injektionen von Lipopolysaccharid aus Porphyromonas gingivalis über 14 Tage um die ersten Oberkiefermolaren herum vorgestellt. Die Ligatur- und LPS-Injektionstechniken waren wirksam bei der Induktion einer Peridontitis, die zu einem Verlust und einer Entzündung des alveolären Knochens führte.

Zusammenfassung

Parodontitis (PD) ist eine weit verbreitete, chronisch immunentzündliche Erkrankung des Zahnhalteapparates, die zum Verlust von Zahnfleischweichgewebe, parodontalem Ligament, Zement und Alveolarknochen führt. In dieser Arbeit wird eine einfache Methode der Parkinson-Induktion bei Ratten beschrieben. Wir bieten eine detaillierte Anleitung für die Platzierung des Ligaturmodells um die ersten Oberkiefermolaren (M1) und eine Kombination von Injektionen von Lipopolysaccharid (LPS), abgeleitet von Porphyromonas gingivalis auf der mesio-palatinalen Seite des M1. Die Induktion der Parodontitis wurde 14 Tage lang aufrechterhalten, was die Ansammlung von Bakterienbiofilm und Entzündungen förderte. Um das Tiermodell zu validieren, wurde IL-1β, ein wichtiger Entzündungsmediator, durch einen Immunoassay in der gingivalen Crevicularflüssigkeit (GCF) bestimmt und der alveoläre Knochenverlust mittels Cone-Beam-Computertomographie (DVT) berechnet. Diese Technik war wirksam bei der Förderung der Gingivarezession, des Alveolarknochenverlusts und eines Anstiegs der IL-1β-Spiegel im GCF am Ende des experimentellen Verfahrens nach 14 Tagen. Diese Methode erwies sich als wirksam bei der Induktion von Parkinson und konnte daher in Studien zu Mechanismen des Krankheitsverlaufs und zukünftigen möglichen Behandlungen eingesetzt werden.

Einleitung

Parodontitis (PD) ist die sechsthäufigste Erkrankung der öffentlichen Gesundheit weltweit, von der etwa 11 % der Gesamtbevölkerung betroffen sind, und ist eine fortgeschrittene, irreversible und zerstörerische Form der Parodontitis ^1,2. Parkinson ist ein entzündlicher Prozess, der das Zahnfleisch- und Parodontalgewebe betrifft, was zu einer Gingivarezession, einer apikalen Migration des Saumepithels mit Taschenentwicklung und dem Verlust von Alveolarknochen führt³. Darüber hinaus wird Parkinson mit mehreren systemischen Erkrankungen in Verbindung gebracht, darunter Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Fettleibigkeit, Diabetes und rheumatoide Arthritis, bei denen umwelt- und wirtsspezifische Faktoren eine wichtige Rolle spielen ^4,5.

Die Parkinson-Krankheit ist also eine multifaktorielle Erkrankung, die in erster Linie durch die Anhäufung von mikrobieller Plaque - die aus einer Dysbiose mikrobieller Gemeinschaften resultiert - und durch eine übertriebene Immunantwort des Wirts auf parodontale Krankheitserreger ausgelöst wird, die zum Abbau von parodontalem Gewebe führt ^4,6. Unter mehreren Parodontalbakterien ist das gramnegative anaerobe Bakterium Porphyromonas gingivalis einer der Haupterreger der PD⁴. P. gingivalis enthält in seinen Wänden ein komplexes Lipopolysaccharid (LPS), ein Molekül, von dem bekannt ist, dass es eine polymorphkernige Leukozyteninfiltration und Gefäßerweiterung in entzündetem parodontalem Gewebe induziert⁷. Dies führt zur Produktion von Entzündungsmediatoren wie Interleukin 1 (IL-1), IL-6 und IL-8, Tumornekrosefaktor (TNF) oder Prostaglandinen mit anschließender Osteoklastenaktivierung und Knochenresorption, was zur Gewebezerstörung und schließlich zum Zahnverlust^{führt 3}.

Zu den verschiedenen Vorteilen von Tiermodellen gehört die Fähigkeit, zelluläre Komplexitäten wie beim Menschen nachzuahmen oder genauer zu sein als In-vitro-Studien , die auf Kunststoffoberflächen mit begrenzten Zelltypen durchgeführt werden⁸. Für die experimentelle Modellierung der Parkinson-Krankheit in vivo wurden verschiedene Tierarten wie nicht-menschliche Primaten, Hunde, Schweine, Frettchen, Kaninchen, Mäuse und Ratten verwendet⁹. Ratten sind jedoch das am besten untersuchte Tiermodell für die Pathogenese der Parkinson-Krankheit, da sie kostengünstig und einfach zu handhaben sind¹⁰. Ihr Zahnfleischgewebe weist ähnliche strukturelle Merkmale wie menschliches Zahnfleischgewebe auf, mit einem flachen Zahnfleischsulkus und einem Saumepithel, das an der Zahnoberfläche befestigt ist. Darüber hinaus erleichtert das Saumepithel wie beim Menschen die Passage von bakteriellen Bakterien, Fremdstoffen und Exsudaten aus Entzündungszellen ⁹.

Eines der am häufigsten berichteten experimentellen Modelle der Parkinson-Induktion bei Ratten ist die Platzierung von Ligaturen um die Zähne, die technisch anspruchsvoll, aber zuverlässig ist¹⁰. Die Platzierung der Ligatur begünstigt die Ansammlung von Zahnbelag und Bakterien, wodurch eine Dysbiose in den Zahnfleischsulci entsteht, die eine Entzündung und Zerstörung des parodontalen Gewebes verursacht¹¹. Der Verlust der parodontalen Befestigung und die Resorption des Alveolarknochens konnte bei diesem Rattenmodell innerhalb von 7 Tagen auftreten⁸.

Ein weiteres Tiermodell für Parkinson ist die Injektion von LPS in das Zahnfleischgewebe. Dadurch werden die Osteoklastogenese und der Knochenabbau angeregt. Die histopathologischen Merkmale dieses Modells ähneln denen der vom Menschen etablierten Parkinson-Krankheit, die durch höhere Konzentrationen von proinflammatorischen Zytokinen, Kollagenabbau und Alveolarknochenresorption gekennzeichnet^{ist 6,8}.

Das Ziel dieser Arbeit war es daher, ein einfaches Rattenmodell der experimentellen Parkinson-Krankheit zu beschreiben, das auf den Techniken der P . gingivalis-LPS (Pg-LPS)-Injektionen basiert, kombiniert mit der Platzierung von Ligaturen um die ersten Oberkiefermolaren (M1). Dabei handelt es sich um ein Modell mit ähnlichen Merkmalen wie bei der menschlichen Parkinson-Krankheit, das bei der Untersuchung von Mechanismen des Krankheitsverlaufs und zukünftiger möglicher Behandlungen verwendet werden könnte.

Protokoll

HINWEIS: Das Versuchsprotokoll der Studie wurde von der Ethikkommission für Tierversuche des Instituts für Gesundheitsforschung der Balearen (CEEA-UIB; Referenznummer 163/03/21) genehmigt.

1. Tieranästhesie und Vorbereitung des Eingriffs

1. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente (Mundknebel aus Aluminium, Dentalforscher, Diamantlanze, chirurgische Schere, mikrochirurgische Zange, Mikronadelhalter, Hollenback-Schnitzer, periostaler mikrochirurgischer Aufzug und mikrochirurgische Schere) (5 min bei 135 °C) vor der Operation.
2. Bereiten Sie alle für das Verfahren benötigten Lösungen unter sterilen Bedingungen vor, wie beschrieben:
   1. Bereiten Sie eine Mischung aus Ketamin (60 mg/ml) und Xylazin (8 mg/ml) vor, indem Sie 1,6 ml Ketamin mit 1 ml Xylazin, verdünnt in Phosphatpufferlösung (PBS)/Kochsalzlösung, mischen. Lagern Sie die Brühe bei 4 °C.
   2. Verdünnen Sie Atipamezol auf eine Endkonzentration von 0,25 mg/ml in PBS/Kochsalzlösung. Lagern Sie die Brühe bei 4 °C.
   3. Verdünnen Sie Buprenorphin auf eine Endkonzentration von 0,03 mg/ml in PBS/Kochsalzlösung. Lagern Sie die Brühe bei 4 °C.
   4. Bereiten Sie 1 ml Pg-LPS (1 mg/ml) in steriler Kochsalzlösung vor. Lagern Sie die Brühe bei -20 °C.
3. Verwenden Sie für das Experiment weibliche und männliche Wistar-Ratten, die zum Zeitpunkt der Operation 12 Wochen alt sind und 210-350 g wiegen. Halten Sie die Tiere in Gruppen unter der entsprechenden Umgebung und unter konstanten Bedingungen (20-24 °C, 12 Stunden pro Tag Hell-Dunkel-Zyklen), mit Futter und normalem Wasser, das ad libitum angeboten wird.
4. Um eine Anästhesie einzuleiten, wiegen Sie die Ratte und verabreichen Sie die Mischung aus Ketamin und Xylazin in einer Konzentration von 80/10 mg/kg intraperitoneal (IP) mit einer sterilen 25-G-Injektionsnadel und einer 1-ml-Spritze.
5. Nachdem die Ratte betäubt wurde, legen Sie das Tier auf den Rücken auf eine beheizte chirurgische Plattform. Decken Sie während des Eingriffs den Körper des Tieres ab, um Wärmeverluste zu vermeiden.
   HINWEIS: Die Anästhesietiefe wird durch den Verlust des Pedalreflexes während des Eingriffs und durch die Überwachung der Vitalfunktionen beurteilt. Verwenden Sie bei Bedarf einen kleinen Nasenkegel, um die Anästhesie mit 2 % Isofluran in 100 % Sauerstoff aufrechtzuerhalten. Tragen Sie nach der Narkoseeinleitung sterile Augensalbe auf beide Augen auf, um die Hornhaut zu schützen und ein Austrocknen zu verhindern.
6. Verabreichen Sie während der Eingriffe 100 % Sauerstoff mit einem kleinen Nasenkegel und überwachen Sie die Pulsfrequenz und Sauerstoffsättigung durch Pulsoximetrie.
   Anmerkungen: Wenn die Sauerstoffsättigung und die Pulsfrequenz unter 95 % bzw. 190 Schläge pro Minute fallen, beenden Sie den Eingriff und bringen Sie das Tier in die seitliche Dekubitusposition, bis normale Werte erreicht sind.
7. Öffnen Sie das Rattenmaul mit einem Aluminium-Mundknebel um die Schneidezähne (oben und unten), ziehen Sie die Zunge damit zurück und stabilisieren Sie Ober- und Unterkiefer in einer offenen, bequemen Arbeitsposition, um den Zugang zu den Unterkiefermolaren zu ermöglichen.
   Anmerkungen: Wenn das Tier in den seitlichen Dekubitus gebracht werden muss, entfernen Sie den Maulknebel, bevor Sie seine Position ändern, um die Genesung zu fördern. Sobald das Tier betäubt ist, entnehmen Sie vor der Operation Gingiva-Crevicularflüssigkeit (GCF) (Probe unter basalen Bedingungen) (Tag 0).
8. Erfassen Sie GCF wie in den folgenden Schritten beschrieben:
   1. Legen Sie das Tier auf den Rücken auf eine chirurgische Plattform und stabilisieren Sie Ober- und Unterkiefer in einer offenen Position mit Aluminium-Mundknebeln.
   2. Sammeln Sie GCF mit insgesamt vier (zwei für jeden M1) absorbierenden Papierpunkt Nr. 30 (0,03 cm Durchmesser x 3 cm Länge), indem Sie ihn bis zum leichten Widerstand in den Zahnfleischspalt (Raum zwischen Zahnfleischepithel und benachbartem Zahnschmelz) um den Mesio-Gaumen des M1 einführen. Halten Sie die Papierspitze insgesamt 30 Sekunden lang in derselben Position, bevor Sie sie sofort entfernen.
   3. Übertragen Sie die Papierspitze nach der Entnahme sofort in ein Plastikfläschchen und lagern Sie sie bei -80 °C, bis die Assay-Leistung erreicht ist.

2. Retentive Ligaturtechnik und intragingivale Pg-LPS-Injektion

HINWEIS: Das Ligaturmodell wurde erstellt (Tag 0), indem eine sterile geflochtene Seidenligatur (5/0) mit mikrochirurgischen Instrumenten bilateral innerhalb des Sulcus gingiva um die M1 gelegt und mit den Knoten des Chirurgen auf der Gaumenoberfläche befestigt wurde. Die verwendeten mikrochirurgischen Instrumente waren eine mikrochirurgische Zange, ein Mikronadelhalter, ein Hollenback-Schnitzer, ein periostaler mikrochirurgischer Aufzug und eine mikrochirurgische Schere. Auch chirurgische Lupenbrillen mit LED-Lichtquelle (3,6-fache Vergrößerung) wurden verwendet.

1. Positionieren Sie den distalen Schwanz der Naht auf der Gaumenseite des Gebisses und führen Sie das proximale Segment zwischen dem Kontakt von M1 und den zweiten Oberkiefermolaren (M2) ein.
2. Verwenden Sie den periostalen mikrochirurgischen Lift, um die Naht in den Sulkus einzuführen. Wickeln Sie die Ligatur sehr vorsichtig um die bukkale Oberfläche des M1, da das Gewebe auf dieser Ebene eine schmale Zone mit anhaftender Gingiva aufweist. Auf der palatinalen Seite ist darauf zu achten, dass die Naht an beiden Enden festgezogen ist, um sicherzustellen, dass sie in den Sulcus gingivais getrieben wird.
   Anmerkungen: Wenn beim Einführen der Naht zwischen M1 und M2 ein Widerstand beobachtet wird, kann der Kontakt mit einem Dentalforscher und einem diamantlanzenförmigen Bohrer leicht geöffnet werden.
3. Binden Sie die Enden der Naht mit einem Chirurgenknoten zusammen und kürzen Sie die Schwänze so kurz wie möglich. Führen Sie den Knoten in den Sulkus ein.
   HINWEIS: Spitzen von chirurgischen Instrumenten können orale Traumata und Blutungen verursachen. Bereiten Sie kleine Mullsegmente oder ein Wattestäbchen vor, um Blut aus der Mundhöhle zu entfernen, und üben Sie Druck aus, um Blutungen zu stoppen. Ein sorgfältiges Weichteilmanagement mit einem mikrochirurgischen Ansatz minimiert chirurgische Komplikationen und führt zu weniger Gewebetrauma.
4. Nach der Ligaturpositionierung werden 40 μl Pg-LPS in steriler Kochsalzlösung mit einer 25 g sterilen Injektionsnadel und einer 1-ml-Spritze in das subgingivale Gewebe (zwischen Zahnwurzel oder Zahnfleischhals und Zahnfleischrand) an der mesio-palatinalen Seite des M1 bilateral injiziert (Tag 0).

3. Ende des Verfahrens

1. Nach der Positionierung der Ligatur und der Anwendung von Pg-LPS wird die Ratte aus dem chirurgischen Zustand entlassen und in einen sauberen Einzelkäfig unter einer Wärmelampe gesetzt.
2. Der Antagonist Atipamezol (0,5 mg/kg subkutan (subkutan)) wird mit einer 25 g sterilen Injektionsnadel und einer 1-ml-Spritze injiziert.
3. Zur Schmerzlinderung 0,03 mg/kg Buprenorphin, subkutan injizieren.
4. Überwachen Sie die Genesung des Tieres, bis die Auswirkungen der Operation vollständig rückgängig gemacht werden. Unterbringe jede Ratte einzeln in der entsprechenden Umgebung unter konstanten Bedingungen (20-24 °C, 12 h pro Tag Hell-Dunkel-Zyklen). Bieten Sie Nahrung und deionisiertes Wasser ad libitum an.
5. Wiegen Sie die Tiere in den ersten 2 Tagen nach dem Eingriff und injizieren Sie zweimal täglich Buprenorphin SC zur Schmerzlinderung.
   Anmerkungen: Buprenorphin kann vor Beginn des Verfahrens verabreicht werden, um den Aufzieheffekt zu beseitigen.
6. Überwachen Sie die Tiere während des Versuchs ein- bis zweimal pro Woche nach Gewicht und allgemeiner Verhaltensbeurteilung.

4. Nachsorge nach dem Eingriff

HINWEIS: Die Induktion von Parkinson wurde 14 Tage lang aufrechterhalten, um die Ansammlung von Bakterienbiofilm und die daraus resultierende Entzündung zu fördern. Die Ligaturen müssen untersucht und angepasst werden, und Pg-LPS wird dreimal pro Woche injiziert (Tag 2, Tag 4, Tag 6, Tag 8, Tag 10 und Tag 12).

1. Überprüfen und passen Sie die Ligatur (Tag 2, Tag 4, Tag 6, Tag 8, Tag 10 und Tag 12) wie folgt an:
   1. Anästhesieren Sie mit 2 % Isofluran in 100 % Sauerstoff unter Verwendung einer Anästhesie-Induktionskammer.
   2. Nachdem die Ratte betäubt wurde, legen Sie das Tier auf den Rücken und verwenden Sie während des Eingriffs einen kleinen Nasenkegel mit 1 % Isofluran in 100 % Sauerstoff zur Aufrechterhaltung der Betäubung des Tieres.
   3. Öffnen Sie das Rattenmaul mit dem Aluminium-Mundknebel um die Schneidezähne (oben und unten), ziehen Sie die Zunge damit zurück und stabilisieren Sie Ober- und Unterkiefer in einer offenen, bequemen Arbeitsposition, um den Zugang zu den Ligaturen zu ermöglichen.
   4. Ziehen Sie die Ligaturen mit Hilfe eines periostalen mikrochirurgischen Lifts gegen die Gingiva fest und stellen Sie sicher, dass die Naht der Ligaturen eingeführt wird, wodurch eine Entzündung um die Gingiva herum entsteht.
      HINWEIS: Es ist möglich, dass 7-10 Tage nach der Operation Ligaturen verloren gehen. Befolgen Sie in diesem Fall das Protokoll, wie es für die Injektion von Pg-LPS erklärt wurde (Schritt 2.4).
2. Nach der Ligaturanpassung werden bilateral 40 μl Pg-LPS mit einer 25 g sterilen Injektionsnadel und einer 1-ml-Spritze in das subgingivale Gewebe an der mesio-palatinalen Seite des M1 injiziert (Tag 2, Tag 4, Tag 6, Tag 8, Tag 10 und Tag 12).
3. Entfernen Sie den Nasenkegel zur Narkose und setzen Sie die Ratte in ihren Käfig. Überwachen Sie die Genesung des Tieres, bis die Wirkung der Anästhesie vollständig rückgängig gemacht wird.

5. Tieropfer und -analyse

HINWEIS: Es gibt verschiedene Möglichkeiten, den Verlauf der Parkinson zu beurteilen. Die hier beschriebene Analyse besteht aus einer Bewertung der proinflammatorischen Zytokine an der gingivalen Crevicularflüssigkeit (GCF) und einer Bewertung des Verlusts des Alveolarknochens.

1. An Tag 14 der Studie (Tag 14) werden die Tiere mit CO₂ in einer Kohlendioxidkammer geopfert. Für Nagetiere wird eine Verdrängungsrate von 30 % bis 70 % des Kammervolumens/min empfohlen.
   HINWEIS: Eine mangelnde Reaktion des Tieres auf den Pedalreflex und das Fehlen von Vitalfunktionen müssen überprüft werden, um die Euthanasie zu bestätigen.
2. Erfassen Sie GCF wie in den folgenden Schritten beschrieben:
   HINWEIS: GCF wird vor der PD-Induktion (vor der Operation) (Tag 0) und nach der PD-Induktion (nach dem Verzicht) (Tag 14) gesammelt.
   1. Legen Sie das Tier auf den Rücken auf eine chirurgische Plattform und stabilisieren Sie Ober- und Unterkiefer in einer offenen Position mit Aluminium-Mundknebeln.
   2. Sammeln Sie den GCF mit dem Adsorptionspapier Nr. 30 (0,03 cm Durchmesser x 3 cm Länge), indem Sie ihn bis zum leichten Widerstand in den Zahnfleischspalt um den mesio-palatinalen M1 einführen. Halten Sie die Papierspitze insgesamt 30 Sekunden lang in derselben Position, bevor Sie sie sofort entfernen.
   3. Nach der Entnahme wird die Papierspitze sofort in ein Plastikfläschchen übertragen und bis zur Testleistung bei -80 °C gelagert.
3. Um Proteine innerhalb des GCF zu bewerten, bereiten Sie die folgenden Lösungen vor und befolgen Sie die Schritte der Elutionsmethode wie beschrieben:
   HINWEIS: IL-1β wird auf dem GCF (Tag 14) mit einem Immunoassay gemäß dem Protokoll des Herstellers bewertet.
   1. Bereiten Sie den Elutionspuffer frisch vor und bewahren Sie ihn während des gesamten Extraktionsprozesses auf Eis auf, um die Proteaseaktivität zu hemmen.
   2. Bereiten Sie alle für den Elutionspuffer benötigten Lösungen wie beschrieben vor:
      1. Bereiten Sie 1 ml Aprotinin (1 mg/ml) in Reinwasser vor.
      2. Bereiten Sie 10 ml Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) (200 mM) in Methanol vor.
      3. Fügen Sie 125 μl PMSF und 250 μl Aprotinin zu 24,5 ml PBS-Lösung (pH = 7,4) hinzu, um den Elutionspuffer herzustellen.
   3. Eine handelsübliche Phosphatase-Hemmer-Tablette mit 10 ml frisch zubereitetem Elutionspuffer wird 10 min lang unter Rühren bei 4 °C gelöst.
      HINWEIS: Die Dauer der GCF-Elution ist begrenzt; Sofort für Zentrifugationen nach Zugabe der Phosphatase-Hemmer-Tablette innerhalb der ersten 30 Minuten verwenden.
   4. Nach Zugabe des Phosphatase-Inhibitors geben Sie 11 μl vollständigen Elutionspuffer direkt auf das Röhrchen mit den Papierspitzen.
   5. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 452 x g für 5 min bei 4 °C.
   6. Übertragen Sie den eluierten Inhalt in eine neue Durchstechflasche aus Kunststoff. Wiederholen Sie diesen Vorgang vier weitere Male, um ein Gesamtvolumen von 50 μl zu erhalten.
   7. Nach der letzten Zentrifugation wird ein Gesamtvolumen von 60 μL direkt auf die Papierspitze gegeben und ein letztes Mal bei 452 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
   8. Verwenden Sie das erforderliche eluierte Volumen für die Proteinbewertung.
4. Nach der Euthanasie und der GCF-Entnahme schneiden Sie mit Hilfe einer chirurgischen Schere den oberen Kiefer der Ratten heraus. Versuchen Sie, die Maske der Ratte abzuziehen und so wenig Weichgewebe wie möglich zu hinterlassen.
5. Positionieren Sie den Kiefer zur Visualisierung im Mikroskoptisch und nehmen Sie ein Bild in der gewünschten Vergrößerung auf.
6. Legen Sie den Kiefer direkt in 4%iges Paraformaldehyd (PFA), das in PBS verdünnt ist. Zweimal pro Woche 12 Tage lang mit neuem PFA auffrischen, um eine vollständige Fixierung zu gewährleisten.
   VORSICHT: Schritte mit PFA sollten in einem Abzug gemäß den Empfehlungen des Sicherheitsdatenblatts durchgeführt werden.
7. Nach vollständiger Kieferfixierung ist der Knochenverlust mit einem Kegelstrahl-Computertomographen (DVT) wie folgt zu beurteilen:
   1. Öffnen Sie den PC.
   2. Öffnen Sie das DVT-Analyseprogramm.
   3. Wählen Sie Scan-Protokoll > Prothesen-Scan-Modus.
   4. Wählen Sie das Sichtfeld (FOV) > ( 11x8) HIRes ( 90 kV Spannung und 3 mA Strom).
   5. Legen Sie den fixierten Oberkiefer der Ratten in die Gantry.
   6. Klicken Sie auf Weiter.
   7. Klicken Sie auf die Taste zum Auslösen von Röntgenstrahlen (drücken Sie die Röntgenfernbedienung, um die Emission auszuführen, und halten Sie sie während der gesamten Dauer des Scans gedrückt).
   8. Verschieben Sie bei Bedarf den Oberkiefer in die Mitte der Frontalebene, indem Sie die Steuertaste drücken, und klicken Sie dann auf die Röntgenauslösetaste (drücken Sie die Röntgenfernbedienung, um die Emission durchzuführen, und halten Sie sie während der gesamten Dauer des Scans gedrückt).
   9. Klicken Sie auf Weiter.
   10. Klicken Sie auf die Taste zum Auslösen von Röntgenstrahlen (drücken Sie die Röntgenfernbedienung, um die Emission auszuführen, und halten Sie sie während der gesamten Dauer des Scans gedrückt).
   11. Falls erforderlich, verlagern Sie die Prothese in der Mitte der Sagittalebene, indem Sie die Steuerungstaste drücken, und klicken Sie dann auf die Röntgenauslösetaste (drücken Sie die Röntgenfernbedienung, um die Emission durchzuführen, und halten Sie sie während der gesamten Dauer des Scans gedrückt).
   12. Klicken Sie auf Weiter.
   13. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start (drücken Sie die Röntgenfernbedienung, um die Emission zu erzeugen, und halten Sie sie während der gesamten Dauer der Untersuchung gedrückt). Warten Sie, bis Sie eine Verarbeitungsmeldung erhalten, und befolgen Sie dann die angezeigten Anweisungen.
   14. Es erscheint eine Fensteransicht. Regulieren Sie das Grau auf 65 % und klicken Sie auf Anwenden.
   15. Um den Scan zu speichern, klicken Sie auf Datei und speichern Sie ihn im DICOM-Format. Klicken Sie dann auf Alle Bilder und wählen Sie im DICOM-Exportauswahlfenster alle angezeigten Parameter aus (Anfangsbild, Originalachse, neu formatierte axiale, multiplanare) und wählen Sie den vordefinierten Typ aus.
8. Verarbeiten Sie die zweidimensionalen und sagittalen repräsentativen Bilder der Oberkiefermolaren mit einem Analyseprogramm wie folgt:
   1. Öffnen Sie die Software.
   2. Klicken Sie auf Datei und Öffnen, wählen Sie dann den Ordner mit Bildern im DICOM-Format aus, und klicken Sie auf Öffnen.
   3. Warten Sie, bis das Fenster "In 8 Bit konvertieren" angezeigt wird, wählen Sie den Bereich von 0 bis 6.000 aus und klicken Sie auf OK.
   4. Klicken Sie auf RAW-Bilder.
   5. Definieren Sie den oberen und unteren Rand der Auswahl, um den gewünschten Bereich einzuschränken. Suchen Sie nach dem ersten und letzten Bild, auf dem der Alveolarknochen erscheint, und wählen Sie es mit den Befehlen "Oben in der Auswahl" und "Unten in der Auswahl" aus.
      HINWEIS: Repräsentative zweidimensionale Bilder des Alveolarknochens der Molaren können exportiert werden, wie in Abbildung 3A,B.
   6. Für sagittale repräsentative Bilder klicken Sie auf Profilleiste umschalten.
   7. Zeichnen Sie eine Sagittallinie in der Mitte des Gaumens und klicken Sie auf Modell aufteilen. Legen Sie die Parameter für die Abgrenzung des Interessenbereichs fest (Schichtabstand: 1; Anzahl der Slices: 100), und klicken Sie auf OK. Warten Sie, bis das Reslicing-Modell beendet ist. Klicken Sie abschließend auf Resliced images speichern.
      ANMERKUNG: Repräsentative sagittale Bilder des Alveolarknochens der Molaren können exportiert werden, wie in Abbildung 3C,D.

Ergebnisse

Eine Zeitleiste der experimentellen Schritte ist in Abbildung 1 dargestellt. Abbildung 2A zeigt ein Bild des Unterkiefers nach einem chirurgischen Eingriff mit einer Ligaturplatzierung um den Sulcus des M1 zum Zeitpunkt 0 des Experiments. Abbildung 2B zeigt, wie nach 14 Tagen des Eingriffs die Ligatur um den M1 in den Sulcus gingivais eindringt, was zu einer Entzündung der Gingiva und einer infiltrierenden Ansammlung führt.

Diskussion

Diese Methode beschreibt die Induktion von Parkinson bei Ratten nach einer kombinierten Technik aus Pg-LPS-Injektionen und der Platzierung von Ligaturen um den M1 und zeigt, dass signifikante Veränderungen im parodontalen Gewebe und im Alveolarknochen innerhalb von 14 Tagen nach dieser Methode induziert werden können.

Während dieses Verfahrens müssen verschiedene kritische Schritte beachtet werden. Während der Tieranästhesie und der Vorbereitung des Eingriffs ist die Beurteilung...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adsorbent paper point nº30	Proclinc	8187
Aprotinin	Sigma-Aldrich	A1153
Atipamezole	Dechra	573751.5	Revanzol 5 mg/mL
Braided silk ligature (5/0)	Laboratorio Arago Sl	613112
Buprenorphine	Richter pharma	578816.6	Bupaq 0.3 mg/mL
Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner	MyRay	hyperion X9	Model Hyperion X9
CTAn software	SkyScan		Version 1.13.4.0
Dental explorer	Proclinc	99743
Diamond lance-shaped bur	Dentaltix	IT21517
Food maintenance diet	Sodispain research	ROD14
Heated surgical platform	PetSavers
Hollenback carver	Hu-FRIEDY	HF45234
Hypodermic needle	BD	300600	25G X 5/8” - 0,5 X 16 MM
Isoflurane	Karizoo		Isoflutek 1000mg/g
Ketamine	Dechra	581140.6	Anesketin 100 mg/mL
Lipopolysaccharide  derived from P.Gingivalis	InvivoGen	TLRL-PGLPS
Methanol	Fisher Scientific	M/4000/PB08
Micro needle holter	Fehling Surgical Instruments	KOT-6
Microsurgical pliers	KLS Martin	12-384-06-07
microsurgical scissors	S&T microsurgical instruments	SDC-15 RV
Monitor iMEC 8 Vet	Mindray
Multiplex bead immunoassay	Procartaplex, Thermo fisher Scientific	PPX-05
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	8187151000
Periosteal microsurgical elevator	Dentaltix	CU19112468
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)	Roche	10837091001
Phosphate Buffer Solution (PBS)	Capricorn Scientific	PBS-1A
PhosSTOP	Roche	4906845001	Commercial phosphatase inhibitor tablet
Plastic vial	SPL Lifesciencies	60015	1.5mL
Saline	Cinfa	204024.3
Stereo Microscope	Zeiss		Model SteREO Discovery.V12
Surgical loupes led light	Zeiss
Surgical scissors	Zepf Surgical	08-1701-17
Syringe	BD plastipak	303172	1mL
Veterinary dental micromotor	Eickemeyer	174028
Xylazine	Calier	20102-003	Xilagesic 20 mg/mL