A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
تبشر جدوى وفعالية طرق scRNA-seq عالية الإنتاجية بعصر الخلية الواحدة في أبحاث النبات. يظهر هنا إجراء قوي وكامل لعزل أنواع معينة من خلايا جذر Arabidopsis thaliana وبناء مكتبة النسخ اللاحقة وتحليلها.
في الكائنات الحية متعددة الخلايا، يمكن أن تكون البرمجة التنموية والاستجابات البيئية متباينة للغاية في أنواع الخلايا المختلفة أو حتى داخل الخلايا، وهو ما يعرف بعدم التجانس الخلوي. في السنوات الأخيرة ، أصبح عزل الخلية الواحدة ونوع الخلية جنبا إلى جنب مع تقنيات تسلسل الجيل التالي (NGS) أدوات مهمة لدراسة العمليات البيولوجية بدقة خلية واحدة. ومع ذلك، فإن عزل الخلايا النباتية أكثر صعوبة نسبيا بسبب وجود جدران الخلايا النباتية، وهو ما يحد من تطبيق نهج الخلية الواحدة في النباتات. يصف هذا البروتوكول إجراء قويا لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) القائم على عزل الخلية الواحدة ونوع الخلية مع الخلايا النباتية ، وهو مناسب للتحليل متعدد الأوميكس المصب والدراسات الأخرى. باستخدام خطوط علامات الفلورسنت الجذرية Arabidopsis ، نوضح كيف يتم عزل أنواع معينة من الخلايا ، مثل خلايا pericycle ذات قطب الخشب ، والخلايا الأولية للجذر الجانبي ، وخلايا غطاء الجذر الجانبي ، وخلايا القشرة ، وخلايا الأديم الباطن. علاوة على ذلك ، يتم أيضا توفير طريقة فعالة لتحليل النسخ النهائي باستخدام Smart-seq2. يمكن تكييف طريقة عزل الخلايا وتقنيات تحليل النسخ مع أنواع الخلايا والأنواع النباتية الأخرى ولها إمكانات تطبيق واسعة في علوم النبات.
الخلايا هي الوحدة الأساسية لجميع الكائنات الحية وتؤدي وظائف هيكلية وفسيولوجية. على الرغم من أن الخلايا في الكائنات متعددة الخلايا تظهر تزامنا واضحا ، إلا أن الخلايا من أنواع مختلفة وخلايا فردية تظهر اختلافات في نسخها أثناء التطور والاستجابات البيئية. يوفر تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية عالي الإنتاجية (scRNA-seq) قوة غير مسبوقة لفهم عدم التجانس الخلوي. ساهم تطبيق scRNA-seq في علوم النبات في بناء أطلس الخلايا النباتية1 بنجاح ، وقد تم استخدامه لتحديد الأصناف الخلوية النادرة في الأنسجة النباتية2 ، وقدم نظرة ثاقبة لتكوين أنواع الخلايا في الأنسجة النباتية ، وتم استخدامه لتحديد الهوية الخلوية والوظائف المهمة المستخدمة أثناء تطوير النبات وتمايزه. بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن استنتاج مسارات النمو الزماني المكاني في الأنسجة النباتية1،2،3 لاكتشاف جينات علامة جديدة4 ودراسة وظائف عوامل النسخ المهمة5 باستخدام scRNA-seq من أجل الكشف عن الحفظ التطوري لنفس نوع الخلية في النباتات المختلفة 3. تعد الضغوط اللاأحيائية من بين أهم التأثيرات البيئية على نمو النبات وتطوره. من خلال استكشاف التغييرات في تكوين أنواع الخلايا في الأنسجة النباتية في ظل ظروف معالجة مختلفة من خلال تسلسل النسخ أحادي الخلية ، يمكن للمرء أيضا حل آلية الاستجابة للإجهاد اللاأحيائي6.
تعتمد إمكانية حل عدم تجانس النسخ بين أنواع الخلايا باستخدام تسلسل scRNA على طريقة عزل الخلية ومنصة التسلسل. فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) هو تقنية مستخدمة على نطاق واسع لعزل مجموعة فرعية من الخلايا من أجل scRNA-seq بناء على تشتت الضوء وخصائص مضان الخلايا. وقد أدى تطوير خطوط علامات الفلورسنت بواسطة التكنولوجيا المحورة وراثيا إلى تحسن كبير في كفاءة عزل الخلايا بواسطة نظام مراقبة الأصولالميدانية 7. إن إجراء scRNA-seq باستخدام Smart-seq28 يعزز القدرة على تشريح عدم التجانس الخلوي. تتمتع طريقة Smart-seq2 بحساسية جيدة للكشف عن الجينات ويمكنها اكتشاف الجينات حتى مع إدخال نسخة منخفضة9. بالإضافة إلى جمع نوع الخلية السائبة ، توفر أجهزة فرز الخلايا الحديثة تنسيق فرز فهرس أحادي الخلية ، مما يسمح بتحليل النسخ بدقة خلية واحدة باستخدام Smart-seq210 أو طرق RNA-seq متعددة الإرسال الأخرى ، مثل CEL-seq211. يمكن استخدام الفرز أحادي الخلية أو نوع الخلية للعديد من التطبيقات النهائية الأخرى ، مثل الدراسات المتوازية متعددة الأوميكس12،13. يظهر هنا بروتوكول قوي ومتعدد الاستخدامات لعزل أنواع الخلايا النباتية، مثل خلايا البريسيكل ذات القطب الزاكيل، وخلايا غطاء الجذر الجانبي، والخلايا الأولية للجذر الجانبي، وخلايا القشرة، وخلايا الأديم الباطن من جذور خطوط خلايا علامة أرابيدوبسيس ثاليانا بواسطة FACS. يتضمن البروتوكول أيضا إنشاء مكتبة Smart-seq2 لتحليل النسخ النهائي.
تم تحسين البروتوكول التالي لبذور A. thaliana من النوع البري (WT) بدون خطوط مضان وعلامات فلورية لأنواع الخلايا الجذرية التالية: خلايا pericycle قطب نسيج الخشب (J0121) ، والخلايا الأولية للجذر الجانبي ، وخلايا غطاء الجذر الجانبي (J3411) ، وخلايا الأدمة الداخلية والقشرة (J0571) (الشكل 1A). تم الحصول على جميع خطوط العلامات من مصدر تجاري (انظر جدول المواد) ، باستثناء خط علامة خلية بدء الجذر الجانبي ، والذي تم إنشاؤه عن طريق إدخال بنية GFP مدفوعة بمحفز GATA23 في نبات أرابيدوبسيس من النوع البري بعد تقرير نشرسابقا 14.
1. تحضير المواد النباتية
2. البروتوبلاستينج
3. فرز الخلايا المنشطة بالتألق (FACS)
4. إعداد مكتبة smart-seq2
5. تحليل بيانات RNA-seq
عزل البروتوبلاست
هذا البروتوكول فعال لفرز البروتوبلاست لخطوط علامة الجذر الفلورية A. thaliana. تم تطوير خطوط العلامات هذه عن طريق اندماج البروتينات الفلورية مع الجينات المعبر عنها على وجه التحديد في أنواع الخلايا المستهدفة ، أو باستخدام خطوط مصيدة المحسن (الشكل 1
يمكن للبروتوكول المستند إلى Smart-seq2 إنشاء مكتبات تسلسل موثوقة من عدة مئات من الخلايا8. جودة المواد الأولية ضرورية لدقة تحليل النسخ. FACS هو أداة قوية لإعداد الخلايا ذات الأهمية ، ولكن يجب تحسين هذا الإجراء ، وخاصة خطوة protoplasting ، لتطبيقات النبات. يمكن أيضا استخدام التشريح المجهري ل...
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
أنشأنا هذا البروتوكول في منشأة متعددة الخلايا أحادية الخلية تابعة لكلية الزراعة والبيولوجيا ، جامعة شنغهاي جياو تونغ ، وتم دعمنا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 32070608) ، وبرنامج شنغهاي بوجيانغ (المنحة رقم 20PJ1405800) ، وجامعة شنغهاي جياو تونغ (رقم المنحة Agri-X20200202 ، 2019TPB05).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22 µm strainer | Sorfa | 622110 | |
Agar | Yeasen | 70101ES76 | |
Agilent fragment analyzer | Aglient | Aglient 5200 | |
Agilent high-sensitivity DNA kit | Aglient | DNF-474-0500 | |
Ampure XP beads | BECKMAN | A63881 | |
Betaine | yuanye | S18046-100g | |
Bleach | Mr Muscle | FnBn83BK | 20% (v/v) bleach |
BSA | sigma | 9048-46-8 | |
CaCl2 | yuanye | S24109-500g | |
Cellulase R10 | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
Cellulase RS | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
Centrifuge tube (1.5 mL) | Eppendolf | 30121589 | |
DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants | Beyotime | R0127 | |
dNTPs (10 mM) | NEB | N0447S | |
DTT (0.1 M) | invitrogen | 18090050 | |
Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 100092680 | |
FACS | BD FACS Melody | BD-65745 | |
FACS | Sony | SH800S | |
Filter tip (1000 µL) | Thermo Scientific | TF112-1000-Q | |
Filter tip (200 µL) | Thermo Scientific | TF140-200-Q | |
Filter tip (10 µL) | Thermo Scientific | TF104-10-Q | |
Filter tip (100 µL) | Thermo Scientific | TF113-100-Q | |
Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse Ni-E | |
Four-Dimensional Rotating Mixer | Kylin -Bell | BE-1100 | |
Hemicellulase | sigma | 9025-56-3 | |
IS PCR primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3' | ||
KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) | Roche | 7958935001 | |
KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 7447-40-7 | |
Macerozyme R10 | Yakult (Japan) | 9032-75-1 | |
Magnetic separation stand | invitrogen | 12321D | |
Mannitol | aladdin | 69-65-8 | |
MES | aladdin | 145224948 | |
MgCl2 | yuanye | R21455-500ml | |
Microcentrifuges | Eppendorf | Centrifuge 5425 | |
Micro-mini-centrifuge | Titan | Timi-10k | |
MS | Phytotech | M519 | |
Nextera XT DNA Library Preparation Kit | illumina | FC-131-1024 | |
oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3' | ||
PCR instrument | Thermal cycler | A24811 | |
Pectolyase | Yakult (Japan) | 9033-35-6 | |
Plant marker lines | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | ||
Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit | invitrogen | Q33231 | |
Qubit 2.0 fluorometer | invitrogen | Q32866 | |
RNase inhibitor | Thermo Scientific | EO0382 | |
RNase-free water | invitrogen | 10977023 | |
Solution A | 400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl | ||
Solution B | 1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 % (w/v)hemicellulase, 0.5 % (w/v)pectolyase and 1 % (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A | ||
Sterile pestle | BIOTREAT | 453463 | |
Strainer (40 µm ) | Sorfa | 251100 | |
Superscript enzyme (200 U/µL) | invitrogen | 18090050 | |
SuperScript VI buffer (5x) | invitrogen | 18090050 | |
T0est tube (5 mL) | BD Falcon | 352052 | |
Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL) | AXYGEN | PCR-05-C | |
Triton X-100 | Sangon Biotech | A600198-0500 | |
TSO primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3' | ||
Vortex | Titan | VM-T2 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved