JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تبشر جدوى وفعالية طرق scRNA-seq عالية الإنتاجية بعصر الخلية الواحدة في أبحاث النبات. يظهر هنا إجراء قوي وكامل لعزل أنواع معينة من خلايا جذر Arabidopsis thaliana وبناء مكتبة النسخ اللاحقة وتحليلها.

Abstract

في الكائنات الحية متعددة الخلايا، يمكن أن تكون البرمجة التنموية والاستجابات البيئية متباينة للغاية في أنواع الخلايا المختلفة أو حتى داخل الخلايا، وهو ما يعرف بعدم التجانس الخلوي. في السنوات الأخيرة ، أصبح عزل الخلية الواحدة ونوع الخلية جنبا إلى جنب مع تقنيات تسلسل الجيل التالي (NGS) أدوات مهمة لدراسة العمليات البيولوجية بدقة خلية واحدة. ومع ذلك، فإن عزل الخلايا النباتية أكثر صعوبة نسبيا بسبب وجود جدران الخلايا النباتية، وهو ما يحد من تطبيق نهج الخلية الواحدة في النباتات. يصف هذا البروتوكول إجراء قويا لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) القائم على عزل الخلية الواحدة ونوع الخلية مع الخلايا النباتية ، وهو مناسب للتحليل متعدد الأوميكس المصب والدراسات الأخرى. باستخدام خطوط علامات الفلورسنت الجذرية Arabidopsis ، نوضح كيف يتم عزل أنواع معينة من الخلايا ، مثل خلايا pericycle ذات قطب الخشب ، والخلايا الأولية للجذر الجانبي ، وخلايا غطاء الجذر الجانبي ، وخلايا القشرة ، وخلايا الأديم الباطن. علاوة على ذلك ، يتم أيضا توفير طريقة فعالة لتحليل النسخ النهائي باستخدام Smart-seq2. يمكن تكييف طريقة عزل الخلايا وتقنيات تحليل النسخ مع أنواع الخلايا والأنواع النباتية الأخرى ولها إمكانات تطبيق واسعة في علوم النبات.

Introduction

الخلايا هي الوحدة الأساسية لجميع الكائنات الحية وتؤدي وظائف هيكلية وفسيولوجية. على الرغم من أن الخلايا في الكائنات متعددة الخلايا تظهر تزامنا واضحا ، إلا أن الخلايا من أنواع مختلفة وخلايا فردية تظهر اختلافات في نسخها أثناء التطور والاستجابات البيئية. يوفر تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية عالي الإنتاجية (scRNA-seq) قوة غير مسبوقة لفهم عدم التجانس الخلوي. ساهم تطبيق scRNA-seq في علوم النبات في بناء أطلس الخلايا النباتية1 بنجاح ، وقد تم استخدامه لتحديد الأصناف الخلوية النادرة في الأنسجة النباتية2 ، وقدم نظرة ثاقبة لتكوين أنواع الخلايا في الأنسجة النباتية ، وتم استخدامه لتحديد الهوية الخلوية والوظائف المهمة المستخدمة أثناء تطوير النبات وتمايزه. بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن استنتاج مسارات النمو الزماني المكاني في الأنسجة النباتية1،2،3 لاكتشاف جينات علامة جديدة4 ودراسة وظائف عوامل النسخ المهمة5 باستخدام scRNA-seq من أجل الكشف عن الحفظ التطوري لنفس نوع الخلية في النباتات المختلفة 3. تعد الضغوط اللاأحيائية من بين أهم التأثيرات البيئية على نمو النبات وتطوره. من خلال استكشاف التغييرات في تكوين أنواع الخلايا في الأنسجة النباتية في ظل ظروف معالجة مختلفة من خلال تسلسل النسخ أحادي الخلية ، يمكن للمرء أيضا حل آلية الاستجابة للإجهاد اللاأحيائي6.

تعتمد إمكانية حل عدم تجانس النسخ بين أنواع الخلايا باستخدام تسلسل scRNA على طريقة عزل الخلية ومنصة التسلسل. فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) هو تقنية مستخدمة على نطاق واسع لعزل مجموعة فرعية من الخلايا من أجل scRNA-seq بناء على تشتت الضوء وخصائص مضان الخلايا. وقد أدى تطوير خطوط علامات الفلورسنت بواسطة التكنولوجيا المحورة وراثيا إلى تحسن كبير في كفاءة عزل الخلايا بواسطة نظام مراقبة الأصولالميدانية 7. إن إجراء scRNA-seq باستخدام Smart-seq28 يعزز القدرة على تشريح عدم التجانس الخلوي. تتمتع طريقة Smart-seq2 بحساسية جيدة للكشف عن الجينات ويمكنها اكتشاف الجينات حتى مع إدخال نسخة منخفضة9. بالإضافة إلى جمع نوع الخلية السائبة ، توفر أجهزة فرز الخلايا الحديثة تنسيق فرز فهرس أحادي الخلية ، مما يسمح بتحليل النسخ بدقة خلية واحدة باستخدام Smart-seq210 أو طرق RNA-seq متعددة الإرسال الأخرى ، مثل CEL-seq211. يمكن استخدام الفرز أحادي الخلية أو نوع الخلية للعديد من التطبيقات النهائية الأخرى ، مثل الدراسات المتوازية متعددة الأوميكس12،13. يظهر هنا بروتوكول قوي ومتعدد الاستخدامات لعزل أنواع الخلايا النباتية، مثل خلايا البريسيكل ذات القطب الزاكيل، وخلايا غطاء الجذر الجانبي، والخلايا الأولية للجذر الجانبي، وخلايا القشرة، وخلايا الأديم الباطن من جذور خطوط خلايا علامة أرابيدوبسيس ثاليانا بواسطة FACS. يتضمن البروتوكول أيضا إنشاء مكتبة Smart-seq2 لتحليل النسخ النهائي.

Protocol

تم تحسين البروتوكول التالي لبذور A. thaliana من النوع البري (WT) بدون خطوط مضان وعلامات فلورية لأنواع الخلايا الجذرية التالية: خلايا pericycle قطب نسيج الخشب (J0121) ، والخلايا الأولية للجذر الجانبي ، وخلايا غطاء الجذر الجانبي (J3411) ، وخلايا الأدمة الداخلية والقشرة (J0571) (الشكل 1A). تم الحصول على جميع خطوط العلامات من مصدر تجاري (انظر جدول المواد) ، باستثناء خط علامة خلية بدء الجذر الجانبي ، والذي تم إنشاؤه عن طريق إدخال بنية GFP مدفوعة بمحفز GATA23 في نبات أرابيدوبسيس من النوع البري بعد تقرير نشرسابقا 14.

1. تحضير المواد النباتية

  1. تعقيم بذور A. thaliana WT وبذور خط علامة الفلورسنت عن طريق احتضان البذور في مبيض بنسبة 20٪ في حاضنة دوارة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  2. شطف البذور في الماء المقطر المزدوج (ddH2O) ثلاث إلى خمس مرات. نفذ هذه الخطوة على مقعد نظيف معقمة.
  3. قم بطلاء بذور خط WT والمراسل على وسط Murashige و Skoog (MS) بنصف قوة مع 0.8٪ أجار (وزن / حجم) 15. قم بزراعة النباتات عموديا لمدة 5 أيام (16 ساعة ضوء عند 23 درجة مئوية) بعد التقسيم الطبقي لمدة يومين عند 4 درجات مئوية.

2. البروتوبلاستينج

  1. تحضير المحاليل البروتوبية 2,5 ، المشار إليها باسم الحل أ والمحلول ب (انظر جدول المواد).
    1. تحضير المحلول A الذي يحتوي على 400 مللي مول مانيتول ، 0.05٪ BSA ، 20 مللي مول MES (درجة الحموضة 5.7) ، 10 مللي مول CaCl2 ، و 20 مللي مول KCl (انظر جدول المواد). قم بتخزين المحلول أ في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
    2. قم بإعداد المحلول B بإضافة 1٪ (w / v) السليولاز R10 ، 1٪ (w / v) السليولاز RS ، 1٪ (w / v) هيميسيلولاز ، 0.5٪ (w / v) pectolyase ، و 1٪ (w / v) macerozyme R10 في حصة جديدة من المحلول A. قم بتخزين المحلول B عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  2. قم بإذابة المحلول (أ) والمحلول (ب) برفق على الجليد قبل بدء التجربة.
  3. اقطع الجذور باستخدام شفرة أو مقص نظيف ، واقطع الجذور إلى قطع ~ 0.5 سم. اغمر الجذور في 1.5 مل من المحلول B متبوعا بدوران لطيف (عند حوالي 18 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1.5-2 ساعة.
  4. قم بتصفية البروتوبلاستيدات الجذرية من خلال شبكة مصفاة 40 ميكرومتر (انظر جدول المواد).
  5. شطف شبكة مصفاة مع 1-2 مل من محلول A.
  6. الجمع بين السوائل من الخطوة 2.4 والخطوة 2.5 ، وأجهزة الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 500-600 ميكرولتر من المحلول أ ، ثم ضعها على الثلج على الفور.
  7. انقل محلول الخلية المعاد تعليقه إلى أنبوب اختبار جديد سعة 5 مل لفرز الخلايا.

3. فرز الخلايا المنشطة بالتألق (FACS)

  1. قم بتشغيل وإنهاء خطوات إعداد الجهاز على آلة الفرز (انظر جدول المواد). حدد قنوات التألق ، واستخدم مصنع WT (بدون مضان) كعنصر تحكم لتحديد خط الأساس للتألق الذاتي ، واضبط بوابة الفرز بناء على شدة التألق ومفردات FSC / SSC (الشكل 2).
  2. أضف 500 ميكرولتر من المحلول A (الخطوة 2.1.1) إلى أنبوب تجميع سعة 1.5 مل لمنع تلف الخلايا. اجمع 2000-3000 خلية لكل أنبوب.
  3. بعد الفرز ، ضع العينات على الفور على الجليد ، وطرد مركزي أنبوب التجميع الذي يحتوي على الخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة.
  4. خذ 2 ميكرولتر من الخلايا المصنفة ، وتحقق من مضان باستخدام مجهر مضان (انظر جدول المواد).
  5. قم بتخزين الخلايا التي تم فرزها في -80 درجة مئوية ، أو استخدمها على الفور لبناء المكتبة (الخطوة 4).
  6. لفرز فهرس الخلية الواحدة ، ضع لوحة 96 بئرا في المحول. قم بمعايرة موضع اللوحة بحيث تسقط القطرة في الفتحة المركزية للوحة. حدد وضع الفرز أحادي الخلية عند الفرز ، وأدخل العدد المستهدف للخلايا التي تم فرزها ك 1 ، وابدأ الفرز.

4. إعداد مكتبة smart-seq2

  1. نتيجة للكمية المنخفضة للغاية من المدخلات ، قم بإجراء إنشاء مكتبة RNA-seq من نوع خلية واحدة في بيئة خالية من التلوث. قبل البدء في التجربة ، قم بتنظيف المقعد باستخدام مطهر سطحي8 (انظر جدول المواد) و 75٪ إيثانول.
  2. تحضير محلول التحلل (الخليط أ) (الجدول 1) عن طريق الجمع بين 0.33 ميكرولتر من 10٪ Triton X-100 ، و 0.55 ميكرولتر من مثبط RNase ، و 0.22 ميكرولتر من 0.1 M DTT (انظر جدول المواد).
  3. أضف 1 ميكرولتر من الخليط أ إلى العينة التي تم فرزها ، وطحنها بمدقة معقمة. حجم العينة المفضل هو ≤0.5 ميكرولتر ؛ استخدم الماء الخالي من RNase لتعويض الحجم إلى 14 ميكرولتر. انقل كل عينة خلية مفردة إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل رقيق الجدران سعة 0.2 مل.
  4. تحضير الخليط B الذي يحتوي على 0.44 ميكرولتر من أوليجو dT30VN للنسخ العكسي (RT) التمهيدي للتفاعل (100 ميكرومتر) و 4.4 ميكرولتر من dNTPs (10 mM) (الجدول 2) (انظر جدول المواد).
  5. أضف 4.4 ميكرولتر من الخليط B إلى 14 ميكرولتر من العينة في كل أنبوب ، ماصة بلطف لخلط العينة ، واحتضان العينة عند 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. بعد الحضانة ، ضع العينات على الفور على الجليد لتهجين oligo-dT إلى ذيل poly A.
  6. تحضير خليط تفاعل النسخ العكسي (الخليط C) (الجدول 3) (انظر جدول المواد). أضف 21.6 ميكرولتر من الخليط C إلى كل أنبوب يحتوي على العينات. قم بتشغيل برنامج RT على أداة PCR شائعة (الجدول 4).
  7. قم بإجراء تفاعل التضخيم المسبق على الجليد. تحضير الخليط D عن طريق الجمع بين 44 ميكرولتر من 2x PCR مزيج البلمرة و 0.88 ميكرولتر من IS PCR التمهيدي (10 ميكرومتر) (الجدول 5) (انظر جدول المواد). أضف 40.8 ميكرولتر من الخليط D إلى 40 ميكرولتر من منتج تفاعل RT ، وقم بتشغيل برنامج التضخيم المسبق (الجدول 6).
  8. تنقية منتجات تفاعل التضخيم المسبق باستخدام حبات Ampure XP (انظر جدول المواد). أضف 48 ميكرولتر من الخرز (نسبة 0.6: 1) إلى كل عينة من الخطوة 4.7 ، وامزج العينات برفق عن طريق الماصة.
  9. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ضع الأنابيب سعة 1.5 مل التي تحتوي على العينات على حامل فصل مغناطيسي لمدة 5 دقائق. تخلص بعناية من المادة الطافية من العينات دون إزعاج الخرز.
  10. اغسل الخرزات عن طريق تعليقها في 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪ ، وضع العينات على حامل الفصل المغناطيسي (انظر جدول المواد) لمدة 3 دقائق أخرى قبل التخلص من المادة الطافية المحتوية على الإيثانول.
  11. جفف العينات في الهواء لمدة 10 دقائق ، وقم بتغطية الأنبوب لمنع التلوث والتلوث المتبادل أثناء التجفيف بالهواء.
  12. أعد تعليق الخرزات في 20 ميكرولتر من ddH2O ، واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ، ثم ضعها على حامل الفصل المغناطيسي لمدة 5 دقائق.
  13. تقوم ماصة بإخراج 18 ميكرولتر من المادة الطافية من كل أنبوب ، ونقل العينات إلى أنابيب طرد مركزي جديدة سعة 1.5 مل. استخدم 1 ميكرولتر من العينة لتقييم جودة cDNA باستخدام مجموعة تقدير كمية الحمض النووي ، وتحديد توزيع حجم كل مكتبة مسبقة باستخدام محلل شظايا (انظر جدول المواد) ، وتخزين العينة المتبقية عند -20 درجة مئوية.
  14. أنشئ مكتبة cDNA8 لتسلسل Illumina 16 من منتج ما قبل المكتبة للخطوة4.13 باستخدام مجموعة إعداد مكتبة التسلسل (انظر جدول المواد).
  15. تنقية المكتبات (من الخطوة 4.14) باستخدام حبات Ampure XP ، وتحديد المكتبات المنقاة ، وتحديد توزيع حجم كل مكتبة باتباع الخطوة 4.13.
    ملاحظة: قم بتجميع نانومول متساو لكل مكتبة ، مما يضمن عدم وجود أي منها على نفس المجموعة من فهرس Illumina. خلاف ذلك ، يمكن تجميع المكتبات بنسبة بناء على إخراج التسلسل المطلوب وتسلسلها معا على نفس الممر من جهاز تسلسل Illumina. بشكل عام ، يوفر تسلسل كل مكتبة على عمق 4-6 جيجابايت ، مما ينتج عنه >10 ملايين قراءة محددة ، تغطية 20x-30x لجينوم Arabidopsis . أعماق التسلسل المنخفضة مقبولة أيضا ولكنها قد تؤثر على أهمية تحليل التعبير التفاضلي.

5. تحليل بيانات RNA-seq

  1. قم بقص القراءات الخام باستخدام Trim-Galore17 متبوعا بتعيين الجينوم المرجعي باستخدام hisat2 18 (daehwankimlab.github.io/hisat2) ، وقم بإزالة الأجزاء المكررة من تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام Picard19 (broadinstitute.github.io/picard).
  2. إجراء معالجة العد الخام والتحليل اللاحق للجينات المعبر عنها تفاضليا (DEG) باستخدام DESeq220 باستخدام ثلاث نسخ بيولوجية على الأقل لكل عينة. قم بإجراء تجميع للتعبير الجيني باستخدام حزمة Pheatmap ، وتصور في خريطة حرارية للتعبير.
    ملاحظة: تم حساب قيم RPKM (قراءات لكل كيلوقاعدة لكل مليون قراءة معينة) للجينات و TEs (العناصر القابلة للنقل) باستخدام Stringtie18 (github.com/gpertea/stringtie) وتصورها في متصفح الجينوم.

النتائج

عزل البروتوبلاست
هذا البروتوكول فعال لفرز البروتوبلاست لخطوط علامة الجذر الفلورية A. thaliana. تم تطوير خطوط العلامات هذه عن طريق اندماج البروتينات الفلورية مع الجينات المعبر عنها على وجه التحديد في أنواع الخلايا المستهدفة ، أو باستخدام خطوط مصيدة المحسن (الشكل 1

Discussion

يمكن للبروتوكول المستند إلى Smart-seq2 إنشاء مكتبات تسلسل موثوقة من عدة مئات من الخلايا8. جودة المواد الأولية ضرورية لدقة تحليل النسخ. FACS هو أداة قوية لإعداد الخلايا ذات الأهمية ، ولكن يجب تحسين هذا الإجراء ، وخاصة خطوة protoplasting ، لتطبيقات النبات. يمكن أيضا استخدام التشريح المجهري ل...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

أنشأنا هذا البروتوكول في منشأة متعددة الخلايا أحادية الخلية تابعة لكلية الزراعة والبيولوجيا ، جامعة شنغهاي جياو تونغ ، وتم دعمنا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 32070608) ، وبرنامج شنغهاي بوجيانغ (المنحة رقم 20PJ1405800) ، وجامعة شنغهاي جياو تونغ (رقم المنحة Agri-X20200202 ، 2019TPB05).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm strainerSorfa 622110
AgarYeasen70101ES76
Agilent fragment analyzerAglientAglient 5200
Agilent high-sensitivity DNA kitAglientDNF-474-0500
Ampure XP beadsBECKMANA63881
BetaineyuanyeS18046-100g
BleachMr MuscleFnBn83BK20% (v/v) bleach
BSAsigma9048-46-8
CaCl2yuanyeS24109-500g
Cellulase R10Yakult (Japan)9012-54-8
Cellulase RSYakult (Japan)9012-54-8
Centrifuge tube (1.5 mL)Eppendolf30121589
DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface DecontaminantsBeyotimeR0127
dNTPs (10 mM)NEBN0447S
DTT (0.1 M)
invitrogen		18090050
EthanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd100092680
FACSBD FACS MelodyBD-65745
FACSSonySH800S
Filter tip  (1000 µL)Thermo ScientificTF112-1000-Q
Filter tip  (200 µL)Thermo ScientificTF140-200-Q
Filter tip (10 µL)Thermo ScientificTF104-10-Q
Filter tip (100 µL)Thermo ScientificTF113-100-Q
Fluorescent microscopeNikonEclipse Ni-E
Four-Dimensional Rotating MixerKylin -BellBE-1100
Hemicellulasesigma9025-56-3
IS PCR primer5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
T-3'
KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X)Roche 7958935001
KClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd7447-40-7
Macerozyme R10Yakult (Japan)9032-75-1
Magnetic separation standinvitrogen12321D
Mannitolaladdin69-65-8
MESaladdin145224948
MgCl2 yuanyeR21455-500ml
MicrocentrifugesEppendorfCentrifuge 5425
Micro-mini-centrifugeTitanTimi-10k
MSPhytotechM519
Nextera XT DNA Library Preparation KitilluminaFC-131-1024
oligo-dT30VN primer5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTVN-3'
PCR instrumentThermal cyclerA24811
PectolyaseYakult (Japan)9033-35-6
Plant marker linesNottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)
Qubit 1x dsDNA HS Assay KitinvitrogenQ33231
Qubit 2.0 fluorometerinvitrogenQ32866
RNase inhibitor Thermo ScientificEO0382
RNase-free waterinvitrogen10977023
Solution A400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl
Solution B1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 %  (w/v)hemicellulase, 0.5 %  (w/v)pectolyase and 1 %  (w/v) Macerozyme R10 in a fresh aliquot of solution A
Sterile pestleBIOTREAT453463
Strainer (40 µm )Sorfa 251100
SuperScript IV reverse transcriptase (200 U/µL)invitrogen18090050
SuperScript IV buffer (5x)invitrogen18090050
Test tube (5 mL)BD Falcon352052
Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL)AXYGENPCR-05-C
Triton X-100Sangon BiotechA600198-0500
TSO primer5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACATrGrG+G-3'
VortexTitanVM-T2

References

  1. Zhang, T. -. Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -. H., Wang, J. -. W. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nature Communications. 12 (1), 2053 (2021).
  2. Denyer, T., et al. Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing. Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).
  3. Liu, Q., et al. Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution. Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).
  4. Liu, Z., et al. Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing. Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).
  5. Shahan, R., et al. A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants. Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).
  6. Wendrich, J. R., et al. Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions. Science. 370 (6518), (2020).
  7. Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).
  8. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
  9. Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2. Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).
  10. Serrano-Ron, L., et al. Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation. Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).
  11. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
  12. Macaulay, I. C., et al. G&T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes. Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).
  13. Angermueller, C., et al. Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity. Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).
  14. De Rybel, B., et al. A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity. Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).
  15. Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy. Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).
  16. Levy, S. E., Myers, R. M. Advancements in next-generation sequencing. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).
  17. Ooi, C. C., et al. High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells. PLoS One. 12 (11), e0188510 (2017).
  18. Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown. Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).
  19. Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease. Journal of Open Source Software. 3, 583 (2018).
  20. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
  21. Kamiya, T., et al. The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).
  22. Zhang, Y., et al. Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation. Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).
  23. Haecker, A., et al. Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Development. 131 (3), 657-668 (2004).
  24. Chen, Q., et al. Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots. Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).
  25. Nichterwitz, S., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
  26. Long, J., et al. Nurse cell--derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis. Science. 373 (6550), (2021).
  27. Gutzat, R., et al. Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns. EMBO Journal. 39 (20), e103667 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

194

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved