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要約

ハイスループットscRNA-seqメソッドの実現可能性と有効性は、植物研究におけるシングルセル時代の到来を告げるものです。ここでは、シ ロイヌナズ ナの根の特定の細胞タイプを単離し、その後のトランスクリプトームライブラリの構築と解析を行うための堅牢で完全な手順を紹介します。

要約

多細胞生物では、発生プログラミングと環境応答は、異なる細胞タイプまたは細胞内でさえ非常に異なる可能性があり、これは細胞の不均一性として知られています。近年、次世代シーケンシング(NGS)技術と組み合わせたシングルセルおよびセルタイプの分離は、シングルセル分解能で生物学的プロセスを研究するための重要なツールになっています。しかしながら、植物細胞壁が存在するため、植物細胞を単離することは比較的困難であり、それは植物における単一細胞アプローチの適用を制限する。このプロトコルは、植物細胞による蛍光活性化セルソーティング(FACS)ベースのシングルセルおよびセルタイプの分離のための堅牢な手順を説明しており、ダウンストリームのマルチオミクス解析やその他の研究に適しています。 シロイヌナ ズナの根蛍光マーカー株を用いて、木部極周回細胞、側根初期細胞、側根冠細胞、皮質細胞、内胚葉細胞などの特定の細胞種がどのように分離されるかを示します。さらに、Smart-seq2を用いた効果的なダウンストリームトランスクリプトーム解析法も提供します。細胞単離法とトランスクリプトーム解析技術は、他の細胞種や植物種にも適応でき、植物科学に幅広い応用の可能性を秘めています。

概要

細胞はすべての生物の基本単位であり、構造的および生理学的機能を果たします。多細胞生物の細胞は見かけのシンクロニシティを示しますが、異なる種類の細胞や個々の細胞は、発生中のトランスクリプトームと環境応答に違いを示します。ハイスループットシングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)は、細胞の不均一性を理解するための前例のないパワーを提供します。scRNA-seqを植物科学に応用することは、植物細胞アトラスの構築に成功し1、植物組織2の希少な細胞分類群の同定に使用され、植物組織における細胞タイプの組成に関する洞察を提供し、細胞同一性と植物の発生および分化に使用される重要な機能を特定するために使用されてきました。さらに、植物組織1,2,3における時空間発生軌跡を推測して新しいマーカー遺伝子を発見し4、scRNA-seqを用いて重要な転写因子5の機能を研究することで、異なる植物における同じ細胞種の進化的保存を明らかにすることができます3。.非生物的ストレスは、植物の成長と発達に対する最も重要な環境影響の一つです。シングルセルトランスクリプトームシーケンシングを通じて、さまざまな処理条件下での植物組織の細胞タイプの組成の変化を調べることにより、非生物的ストレス応答メカニズムを解明することもできます6。

scRNAシーケンシングを使用して細胞タイプ間の転写不均一性を解決できる可能性は、細胞分離方法とシーケンシングプラットフォームによって異なります。蛍光活性化セルソーティング(FACS)は、光散乱と細胞の蛍光特性に基づいてscRNA-seqの細胞の亜集団を単離するために広く使用されている技術です。トランスジェニック技術による蛍光マーカー株の開発により、FACS7による細胞単離の効率が大幅に向上しました。Smart-seq28を用いてscRNA-seqを実施すると、細胞の不均一性を解剖する能力がさらに高まります。Smart-seq2法は遺伝子検出感度が高く、転写物入力量が少ない場合でも遺伝子を検出できます9。バルクセルタイプの収集に加えて、最新のセルソーターはシングルセルインデックスソーティングフォーマットを提供し、Smart-seq210またはCEL-seq211などの他のマルチプレックスRNA-seqメソッドを使用してシングルセル分解能でトランスクリプトーム解析を可能にします。シングルセルまたはセルタイプのソーティングは、並行マルチオミクス研究など、他の多くのダウンストリームアプリケーションに使用できる可能性があります12,13。ここでは、FACSによってシロイヌナズナマーカー細胞株の根から木部極周回細胞、側根冠細胞、側根初期細胞、皮質細胞、内胚葉細胞などの植物細胞タイプを単離するための堅牢で汎用性の高いプロトコルを紹介します。このプロトコルには、ダウンストリームトランスクリプトーム解析用のSmart-seq2ライブラリの構築もさらに含まれます。

プロトコル

以下のプロトコルは、次の根細胞タイプの蛍光および蛍光マーカーラインを持たないA. thaliana野生型(WT)種子用に最適化されています:木部極周環状細胞(J0121)、側根初期細胞、側根冠細胞(J3411)、内皮および皮質細胞(J0571)(図1A)。以前に発表された第14報告書に続いて、GATA23プロモーター駆動GFP構築物を野生型シロイヌナズナ植物に導入することによって生成された側根開始細胞マーカー株を除いて、すべてのマーカー株は市販の供給源(材料の表を参照)から入手した。

1.植物材料の調製

  1. A. thaliana WT種子および蛍光マーカー系統種子を、室温で15分間回転インキュベーター内で20%漂白剤中でインキュベートすることにより滅菌する。
  2. 種子を二重蒸留水(ddH2O)で3〜5回すすいでください。このステップは、滅菌済みのクリーンベンチで実行します。
  3. WTおよびレポーターラインシードを、0.8%寒天(w / v)15を含む半強度のムラシゲおよびスクーグ(MS)培地にプレートします。4°Cで2日間成層した後、植物を垂直に5日間(23°Cで16時間光)育てます。

2.プロトプラスト

  1. 溶液Aおよび溶液Bと呼ばれるプロトプラスト溶液2,5を調製する(材料表を参照)。
    1. 400 mM マンニトール、0.05% BSA、20 mM MES(pH 5.7)、10 mM CaCl2、および 20 mM KCl を含む溶液 A を調製 します (材料表を参照)。溶液Aを-20°Cで最大1ヶ月間保存します。
    2. 溶液Aの新しいアリコートに1%(w/v)セルラーゼR10、1%(w/v)セルラーゼRS、1%(w/v)ヘミセルラーゼ、0.5%(w/v)ペクトリアーゼ、および1%(w/v)マセロチームR10を加えて、溶液Bを調製します。
  2. 実験を開始する前に、溶液Aと溶液Bを氷上で静かに解凍します。
  3. きれいな刃やハサミで根を切り落とし、根を~0.5cmに切ります。根を1.5 mLの溶液Bに浸し、続いて室温で1.5〜2時間穏やかに回転(約18 rpm)します。
  4. ルートプロトプラストを40 μmのストレーナーメッシュでろ過します(材料表を参照)。
  5. ストレーナーメッシュを1〜2 mLの溶液Aですすぎます。
  6. ステップ2.4とステップ2.5の液体を混ぜ合わせ、300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清をピペットで廃棄し、細胞ペレットを500〜600 μLの溶液Aに再懸濁し、すぐに氷上に置きます。
  7. 再懸濁した細胞溶液を新しい5 mL試験管に移し、細胞を選別します。

3. 蛍光活性化セルソーティング(FACS)

  1. スイッチを入れて、ソーターで機器のセットアップ手順を完了します( 材料表を参照)。蛍光チャンネルを選択し、WTプラント(蛍光なし)をコントロールとして使用して自家蛍光のベースラインを決定し、蛍光強度とFSC/SSCシングレットに基づいてソーティングゲートを調整します(図2)。
  2. 500 μLの溶液A(ステップ2.1.1)を1.5 mLの収集チューブに加えて、細胞の損傷を防ぎます。チューブあたり2,000〜3,000個の細胞を収集します。
  3. 選別後、直ちにサンプルを氷上に置き、細胞を入れた回収チューブを300 x g で4°Cで5分間遠心分離し、ピペットで上清を除去した。
  4. 選別した細胞を2 μL採取し、蛍光顕微鏡を使用して蛍光を確認します( 材料表を参照)。
  5. ソートしたセルを-80°Cで保存するか、すぐにライブラリの構築に使用します(ステップ4)。
  6. シングルセルインデックスソーティングの場合は、96ウェルプレートをアダプターに入れます。液滴がプレートの中央の穴に落ちるようにプレートの位置を調整します。ソート時に単一セルソートモードを選択し、ソートされたセルの目標数を1として入力し、ソートを開始します。

4. スマートシーク2ライブラリの準備

  1. 超低入力の結果、汚染のない環境でシングルセル型RNA-seqライブラリ構築を行うことができます。実験を開始する前に、表面除染剤8 ( 材料表を参照)と75%エタノールでベンチを清掃してください。
  2. 0.33 μLの10%Triton X-100、0.55 μLのRNase阻害剤、および0.22 μLの0.1 M DTTを組み合わせて、溶解バッファー(混合物A)(表1)を調製します( 材料の表を参照)。
  3. 選別したサンプルに混合物Aを1 μL加え、滅菌乳棒で粉砕します。好ましいサンプル容量は≤0.5μLです。RNaseフリーの水を使用して、容量を14 μLに構成します。 各単一細胞サンプルを0.2 mLの薄肉PCRチューブに移します。
  4. 0.44 μLのオリゴdT 30 VN逆転写(RT)反応プライマー(100 μM)および4.4 μLのdNTP(10mM)を含む混合物Bを調製します(表2)( 材料の表を参照)。
  5. 各チューブ内の14 μLのサンプルに4.4 μLの混合物Bを加え、ピペットで穏やかにサンプルを混合し、サンプルを72°Cで3分間インキュベートします。インキュベーション後、直ちにサンプルを氷上に置いて、オリゴ-dTをポリAテールにハイブリダイズさせる。
  6. 逆転写反応混合物(混合物C)(表3)を準備する( 材料表参照)。サンプルを含む各チューブに21.6 μLの混合物Cを追加します。一般的なPCR機器でRTプログラムをオンにします(表4)。
  7. 氷上でプリアンプ反応を行う。44 μLの2x PCRポリメラーゼミックスと0.88 μLのIS PCRプライマー(10 μM)を組み合わせて混合物Dを調製します(表5)( 材料の表を参照)。40.8 μLの混合物Dを40 μLのRT反応生成物に加え、プリアンププログラムを実行します(表6)。
  8. Ampure XPビーズを使用してプリアンプ反応生成物を精製します( 材料の表を参照)。ステップ4.7の各サンプルに48 μLのビーズ(0.6:1の比率)を加え、ピペッティングでサンプルを穏やかに混合します。
  9. サンプルを室温で10分間インキュベートします。サンプルを含む1.5 mLチューブを磁気分離スタンドに5分間置きます。ビーズを乱すことなく、サンプルから上清を慎重に廃棄します。
  10. ビーズを200 μLの80%エタノールに再懸濁して洗浄し、エタノール含有上清を廃棄する前に、サンプルをさらに3分間磁気分離スタンド( 材料の表を参照)に置きます。
  11. サンプルを10分間風乾し、空気乾燥中の汚染や相互汚染を防ぐためにチューブを覆います。
  12. ビーズを20 μLのddH2Oに再懸濁し、サンプルを室温で5分間インキュベートした後、磁気分離スタンドに5分間置きます。
  13. 各チューブから18 μLの上清をピペットで取り出し、サンプルを新しい1.5 mL遠沈管に移します。1 μLのサンプルを使用して、DNA定量キットを使用してcDNAの品質を評価し、フラグメントアナライザー( 材料の表を参照)を使用して各プレライブラリのサイズ分布を決定し、残りのサンプルを-20°Cで保存します。
  14. シーケンシングライブラリ調製キットを使用して、ステップ4.13のプレライブラリ製品からIlluminaシーケンシング16用のcDNAライブラリ8を構築します(材料表を参照)。
  15. Ampure XPビーズを使用してライブラリを精製し(ステップ4.14から)、精製されたライブラリを定量し、ステップ4.13に従って各ライブラリのサイズ分布を決定します。
    注:各ライブラリのナノモルを均等にプールし、イルミナインデックスの同じ組み合わせを持たないようにします。それ以外の場合は、ライブラリを目的のシーケンシング出力に基づく比率でプールし、イルミナシーケンサーの同じレーンで一緒にシーケンスすることができます。一般に、各ライブラリを4〜6 GBの深さまでシーケンシングすると、1,000万>のマップリードが得られ、 シロイヌナズナ ゲノムの20倍から30倍のカバレッジが得られます。より低いシーケンシング深度も許容されますが、発現差解析の有意性に影響を与える可能性があります。

5. RNA配列データ解析

  1. Trim-Galore17を使用して生のリードをトリミングし、続いてhisat2 18(daehwankimlab.github.io/hisat2)を使用して参照ゲノムにマッピングし、Picard19(broadinstitute.github.io/picard)を使用してPCR複製フラグメントを削除します。
  2. 各試料について少なくとも3つの生物学的反復を用いてDESeq220 を用いて差次発現遺伝子(DEG)の生計数処理およびその後の分析を行う。Pheatmapパッケージを使用して遺伝子発現のクラスタリングを実行し、発現ヒートマップで視覚化します。
    注:遺伝子とTE(転移要素)のRPKM(100万マップリードあたりのキロ塩基あたりのリード)値は、Stringtie18 (github.com/gpertea/stringtie)で計算され、ゲノムブラウザで視覚化されました。

結果

プロトプラスト単離
このプロトコルは、蛍光 A.タリアナ 根マーカー株のプロトプラストソーティングに有効です。これらのマーカー株は、蛍光タンパク質と標的細胞型で特異的に発現する遺伝子との融合、またはエンハンサートラップ株の使用によって開発されました(図1)。多数の組織や臓器が、モデル植物や作物で特定の蛍光マーカーを発現す...

ディスカッション

Smart-seq2ベースのプロトコルは、数百のセルから信頼性の高いシーケンシングライブラリを生成できます8。出発物質の品質は、トランスクリプトーム解析の精度に不可欠です。FACSは目的の細胞を調製するための強力なツールですが、この手順、特にプロトプラストステップは、植物用途に最適化する必要があります。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LCM)また?...

開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

このプロトコルは、上海交通大学農生物学部のシングルセルマルチオミクス施設で設定され、中国国家自然科学財団(助成金番号32070608)、上海浦江プログラム(助成金番号20PJ1405800)、上海交通大学(助成金番号Agri-X20200202、2019TPB05)の支援を受けました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm strainerSorfa 622110
AgarYeasen70101ES76
Agilent fragment analyzerAglientAglient 5200
Agilent high-sensitivity DNA kitAglientDNF-474-0500
Ampure XP beadsBECKMANA63881
BetaineyuanyeS18046-100g
BleachMr MuscleFnBn83BK20% (v/v) bleach
BSAsigma9048-46-8
CaCl2yuanyeS24109-500g
Cellulase R10Yakult (Japan)9012-54-8
Cellulase RSYakult (Japan)9012-54-8
Centrifuge tube (1.5 mL)Eppendolf30121589
DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface DecontaminantsBeyotimeR0127
dNTPs (10 mM)NEBN0447S
DTT (0.1 M)
invitrogen		18090050
EthanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd100092680
FACSBD FACS MelodyBD-65745
FACSSonySH800S
Filter tip  (1000 µL)Thermo ScientificTF112-1000-Q
Filter tip  (200 µL)Thermo ScientificTF140-200-Q
Filter tip (10 µL)Thermo ScientificTF104-10-Q
Filter tip (100 µL)Thermo ScientificTF113-100-Q
Fluorescent microscopeNikonEclipse Ni-E
Four-Dimensional Rotating MixerKylin -BellBE-1100
Hemicellulasesigma9025-56-3
IS PCR primer5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
T-3'
KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X)Roche 7958935001
KClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd7447-40-7
Macerozyme R10Yakult (Japan)9032-75-1
Magnetic separation standinvitrogen12321D
Mannitolaladdin69-65-8
MESaladdin145224948
MgCl2 yuanyeR21455-500ml
MicrocentrifugesEppendorfCentrifuge 5425
Micro-mini-centrifugeTitanTimi-10k
MSPhytotechM519
Nextera XT DNA Library Preparation KitilluminaFC-131-1024
oligo-dT30VN primer5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTVN-3'
PCR instrumentThermal cyclerA24811
PectolyaseYakult (Japan)9033-35-6
Plant marker linesNottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)
Qubit 1x dsDNA HS Assay KitinvitrogenQ33231
Qubit 2.0 fluorometerinvitrogenQ32866
RNase inhibitor Thermo ScientificEO0382
RNase-free waterinvitrogen10977023
Solution A400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl
Solution B1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 %  (w/v)hemicellulase, 0.5 %  (w/v)pectolyase and 1 %  (w/v) Macerozyme R10 in a fresh aliquot of solution A
Sterile pestleBIOTREAT453463
Strainer (40 µm )Sorfa 251100
SuperScript IV reverse transcriptase (200 U/µL)invitrogen18090050
SuperScript IV buffer (5x)invitrogen18090050
Test tube (5 mL)BD Falcon352052
Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL)AXYGENPCR-05-C
Triton X-100Sangon BiotechA600198-0500
TSO primer5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACATrGrG+G-3'
VortexTitanVM-T2

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