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摘要

高通量scRNA-seq方法的可行性和有效性预示着植物研究的单细胞时代。这里介绍的是一个强大而完整的程序，用于分离特定的拟 南芥 根细胞类型以及随后的转录组文库构建和分析。

摘要

在多细胞生物中，发育编程和环境反应在不同的细胞类型甚至细胞内可能高度不同，这被称为细胞异质性。近年来，单细胞和细胞类型分离与二代测序（NGS）技术相结合已成为研究单细胞分辨率生物过程的重要工具。然而，由于植物细胞壁的存在，分离植物细胞相对困难，这限制了单细胞方法在植物中的应用。该协议描述了基于荧光激活细胞分选（FACS）的单细胞和细胞类型与植物细胞分离的稳健程序，适用于下游多组学分析和其他研究。使用 拟南芥 根荧光标记系，我们展示了如何分离特定细胞类型，例如木质部 - 极周周期细胞，侧根初始细胞，侧根帽细胞，皮质细胞和内胚层细胞。此外，还提供了使用Smart-seq2的有效下游转录组分析方法。细胞分离方法和转录组分析技术可以适应其他细胞类型和植物物种，在植物科学中具有广泛的应用潜力。

引言

细胞是所有生物体的基本单位，执行结构和生理功能。尽管多细胞生物中的细胞显示出明显的同步性，但不同类型和单个细胞的细胞在发育和环境反应过程中的转录组存在差异。高通量单细胞RNA测序（scRNA-seq）为了解细胞异质性提供了前所未有的能力。在植物科学中应用scRNA-seq有助于成功构建植物细胞图谱1，已被用于鉴定植物组织中的稀有细胞分类群2，提供了对植物组织中细胞类型组成的见解，并已用于鉴定细胞身份和植物发育和分化过程中使用的重要功能。此外，还可以推断植物组织1，2，3的时空发育轨迹，以发现新的标记基因4并使用scRNA-seq研究重要转录因子5的功能，以揭示不同植物中相同细胞类型的进化保守性3.非生物胁迫是影响植物生长发育的最重要环境影响之一。通过单细胞转录组测序探索不同处理条件下植物组织中细胞类型组成的变化，还可以解决非生物胁迫响应机制6。

使用scRNA测序解决细胞类型之间的转录异质性的潜力取决于细胞分离方法和测序平台。荧光激活细胞分选（FACS）是一种广泛使用的技术，用于根据光散射和细胞的荧光特性分离细胞亚群以获得scRNA-seq。转基因技术开发荧光标记系，大大提高了FACS7细胞分离的效率。使用Smart-seq28 进行scRNA-seq进一步增强了解剖细胞异质性的能力。Smart-seq2方法具有良好的基因检测灵敏度，即使在低转录本输入的情况下也能检测基因9。除了批量细胞类型采集外，现代细胞分选仪还提供单细胞索引分选格式，允许使用 Smart-seq210 或其他多重 RNA-seq 方法（如 CEL-seq211）以单细胞分辨率进行转录组分析。单细胞或细胞类型分选可用于许多其他下游应用，例如平行多组学研究12，13。这里介绍的是一种强大且通用的方案，用于通过 FACS 从 拟南芥 标记细胞系的根中分离植物细胞类型，例如木质部极周周期细胞、侧根帽细胞、侧根初始细胞、皮质细胞和内胚层细胞。该协议还涉及构建用于下游转录组分析的Smart-seq2文库。

研究方案

以下方案已针对拟南芥野生型（WT）种子进行了优化，没有荧光和以下根细胞类型的荧光标记系:木质部 - 极周周期细胞（J0121），侧根初始细胞，侧根帽细胞（J3411），内胚层和皮质细胞（J0571）（图1A）。所有标记系均来自商业来源（见材料表），但侧根起始细胞标记系除外，该标记系是通过在先前发表的报告14之后将GATA23启动子驱动的GFP构建体引入野生型拟南芥植物而产生的。

1. 植物材料的制备

  1. 通过将种子在室温旋转培养箱中的20%漂白剂中孵育15分钟，对 拟南芥 WT种子和荧光标记线种子进行灭菌。
  2. 用双蒸水（ddH2O）冲洗种子三到五次。在无菌清洁工作台上执行此步骤。
  3. 将WT和报告系种子接种在含有0.8%琼脂（w / v）的半强度Murashige和Skoog（MS）培养基上15。在4°C下分层2天后，垂直种植植物5天（在23°C下光照16小时）。

2. 原生质持久

  1. 制备原生质持久的溶液2，5，称为溶液A和溶液B（见材料表）。
    1. 制备含有400 mM甘露醇，0.05%BSA，20 mM MES（pH 5.7），10 mM CaCl2和20 mM KCl的溶液A（参见 材料表）。将溶液A在-20°C下储存长达1个月。
    2. 通过加入 1% （w/v） 纤维素酶 R10、1% （w/v） 纤维素酶 RS、1% （w/v） 半纤维素酶、0.5% （w/v） 果胶溶解酶和 1% （w/v） macerozyme R10 在溶液 A 的新鲜等分试样中制备溶液 B。
  2. 在开始实验之前，在冰上轻轻解冻溶液A和溶液B。
  3. 用干净的刀片或剪刀剪掉根部，并将根部切成~0.5厘米的碎片。将根浸入1.5mL溶液B中，然后在室温下轻轻旋转（以约18rpm）1.5-2小时。
  4. 通过40μm过滤器网过滤根原生质体（参见 材料表）。
  5. 用 1-2 mL 溶液 A 冲洗过滤器网。
  6. 合并步骤2.4和步骤2.5的液体，并在4°C下以300× g 离心5分钟。 用移液管弃去上清液，将细胞沉淀重悬于500-600μL溶液A中，然后立即将其置于冰上。
  7. 将重悬的细胞溶液转移到新的 5 mL 试管中进行细胞分选。

3. 荧光激活细胞分选 （FACS）

  1. 打开并完成分拣机上的仪器设置步骤（参见 材料表）。选择荧光通道，使用WT植物（无荧光）作为对照来确定自发荧光的基线，并根据荧光强度和FSC / SSC单线调整分选门（图2）。
  2. 将 500 μL 溶液 A（步骤 2.1.1）加入 1.5 mL 收集管中，以防止细胞受损。每管收集2，000-3，000个细胞。
  3. 分选后，立即将样品放在冰上，在4°C下以300× g 离心含有细胞的收集管5分钟，并用移液管除去上清液。
  4. 取 2 μL 分选细胞，并使用荧光显微镜检查荧光（参见 材料表）。
  5. 将分选的细胞储存在-80°C，或立即用于文库构建（步骤4）。
  6. 对于单细胞指数分选，将 96 孔板放入适配器中。校准板的位置，使液滴落在板的中心孔中。排序时选择单细胞排序模式，输入目标排序单元格数为1，开始排序。

4. 智能序列2文库制备

  1. 由于输入量超低，可在无污染环境中进行单细胞型RNA-seq文库构建。在开始实验之前，用表面净化剂8 （见 材料表）和75%乙醇清洁工作台。
  2. 通过混合 0.33 μL 10% Triton X-100、0.55 μL RNase 抑制剂和 0.22 μL 0.1 M DTT 制备裂解缓冲液（混合物 A）（表 1）（参见 材料表）。
  3. 将 1 μL 混合物 A 加入分选样品中，并用无菌杵研磨。优选的样品体积为 ≤0.5 μL;使用不含RNase的水将体积补足至14μL。 将每个单细胞样品转移到 0.2 mL 薄壁 PCR 管中。
  4. 制备含有 0.44 μL 寡核苷酸dT 30VN 逆转录 （RT） 反应引物 （100 μM） 和 4.4 μL dNTP （10 mM） 的混合物 B（表 2）（参见 材料表）。
  5. 将 4.4 μL 混合物 B 添加到每个管中的 14 μL 样品中，轻轻移液以混合样品，并将样品在 72 °C 下孵育 3 分钟。孵育后，立即将样品放在冰上，将寡核苷酸-dT杂交到poly A尾部。
  6. 制备逆转录反应混合物（混合物C）（表3）（见 材料表）。向每个含有样品的试管中加入 21.6 μL 混合物 C。在常用PCR仪器上打开RT程序（表4）。
  7. 在冰上进行预扩增反应。通过将 44 μL 2x PCR 聚合酶混合物和 0.88 μL IS PCR 引物 （10 μM） 混合来制备混合物 D（表 5）（参见 材料表）。将 40.8 μL 混合物 D 加入 40 μL RT 反应产物中，然后运行预扩增程序（表 6）。
  8. 使用Ampure XP磁珠纯化预扩增反应产物（参见 材料表）。向步骤 4.7 中的每个样品中加入 48 μL 磁珠（0.6:1 比例），并通过移液轻轻混合样品。
  9. 将样品在室温下孵育10分钟。将含有样品的 1.5 mL 管放在磁分离台上 5 分钟。小心地从样品中丢弃上清液，不要干扰珠子。
  10. 通过将珠子重悬于200μL80%乙醇中来洗涤珠子，并将样品放在磁性分离台（参见 材料表）上再放置3分钟，然后丢弃含乙醇的上清液。
  11. 将样品风干10分钟，并盖上试管以防止风干过程中的污染和交叉污染。
  12. 将磁珠重悬于20μL ddH2O中，将样品在室温下孵育5分钟，然后将它们放在磁性分离台上5分钟。
  13. 从每个试管中移出 18 μL 上清液，并将样品转移到新的 1.5 mL 离心管中。使用1 μL样品使用DNA定量试剂盒评估cDNA的质量，使用片段分析仪确定每个预库的大小分布（参见 材料表），并将剩余样品储存在-20°C。
  14. 使用测序文库制备试剂盒从步骤4.13的库前产物构建用于Illumina测序16的cDNA文库8（参见材料表）。
  15. 使用Ampure XP磁珠纯化文库（从步骤4.14开始），量化纯化的文库，并按照步骤4.13确定每个文库的大小分布。
    注意:汇集每个库的纳摩尔相等，确保它们都没有相同的 Illumina 指数组合。否则，可以根据所需的测序输出以比例汇集文库，并在 Illumina 测序仪的同一通道上一起测序。通常，将每个文库测序到4-6 GB的深度，产生>1000万个映射读取，提供拟 南芥 基因组的20-30倍覆盖率。较低的测序深度也是可以接受的，但可能会影响差异表达分析的重要性。

5. RNA-seq数据分析

  1. 使用Trim-Galore17修剪原始读数，然后使用hisat2 18（daehwankimlab.github.io/hisat2）映射到参考基因组，并使用Picard19（broadinstitute.github.io/picard）去除PCR重复片段。
  2. 使用 DESeq220 对差异表达基因 （DEG） 进行原始计数处理和后续分析，每个样品至少使用三个生物学重复。使用热图包对基因表达进行聚类，并在表达热图中可视化。
    注意:基因和TEs（转座元件）的RPKM（每百万个映射读取的每千碱基读取数）值使用Stringtie18 （github.com/gpertea/stringtie）计算并在基因组浏览器中可视化。

结果

原生质体分离
该协议对于荧光 拟南芥 根标记系的原生质体分选有效。这些标记系是通过荧光蛋白与靶细胞类型中特异性表达的基因融合或使用增强子捕获系开发的（图1）。许多组织和器官已被解剖成在模式植物和作物中表达特定荧光标记物的细胞类型。

FACS 群体、分选细胞和文库质量控制
通过使用野生型植物作为...

讨论

基于Smart-seq2的方案可以从数百个细胞中生成可靠的测序文库8。起始材料的质量对于转录组分析的准确性至关重要。FACS是制备目标细胞的强大工具，但该过程，尤其是原生增殖步骤，必须针对植物应用进行优化。激光捕获显微切割（LCM）或手动解剖细胞也可以用作输入25，26，因此此处提供的协议可以潜在地用于具有或不具有已知标记?...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

我们在上海交通大学农业与生物学院的单细胞多组学设施中建立了该方案，并得到了国家自然科学基金（批准号32070608），上海浦江计划（批准号20PJ1405800）和上海交通大学（批准号Agri-X20200202，2019TPB05）的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm strainerSorfa 622110
AgarYeasen70101ES76
Agilent fragment analyzerAglientAglient 5200
Agilent high-sensitivity DNA kitAglientDNF-474-0500
Ampure XP beadsBECKMANA63881
BetaineyuanyeS18046-100g
BleachMr MuscleFnBn83BK20% (v/v) bleach
BSAsigma9048-46-8
CaCl2yuanyeS24109-500g
Cellulase R10Yakult (Japan)9012-54-8
Cellulase RSYakult (Japan)9012-54-8
Centrifuge tube (1.5 mL)Eppendolf30121589
DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface DecontaminantsBeyotimeR0127
dNTPs (10 mM)NEBN0447S
DTT (0.1 M)
invitrogen		18090050
EthanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd100092680
FACSBD FACS MelodyBD-65745
FACSSonySH800S
Filter tip  (1000 µL)Thermo ScientificTF112-1000-Q
Filter tip  (200 µL)Thermo ScientificTF140-200-Q
Filter tip (10 µL)Thermo ScientificTF104-10-Q
Filter tip (100 µL)Thermo ScientificTF113-100-Q
Fluorescent microscopeNikonEclipse Ni-E
Four-Dimensional Rotating MixerKylin -BellBE-1100
Hemicellulasesigma9025-56-3
IS PCR primer5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
T-3'
KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X)Roche 7958935001
KClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd7447-40-7
Macerozyme R10Yakult (Japan)9032-75-1
Magnetic separation standinvitrogen12321D
Mannitolaladdin69-65-8
MESaladdin145224948
MgCl2 yuanyeR21455-500ml
MicrocentrifugesEppendorfCentrifuge 5425
Micro-mini-centrifugeTitanTimi-10k
MSPhytotechM519
Nextera XT DNA Library Preparation KitilluminaFC-131-1024
oligo-dT30VN primer5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTVN-3'
PCR instrumentThermal cyclerA24811
PectolyaseYakult (Japan)9033-35-6
Plant marker linesNottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)
Qubit 1x dsDNA HS Assay KitinvitrogenQ33231
Qubit 2.0 fluorometerinvitrogenQ32866
RNase inhibitor Thermo ScientificEO0382
RNase-free waterinvitrogen10977023
Solution A400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl
Solution B1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 %  (w/v)hemicellulase, 0.5 %  (w/v)pectolyase and 1 %  (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A
Sterile pestleBIOTREAT453463
Strainer (40 µm )Sorfa 251100
Superscript enzyme (200 U/µL)invitrogen18090050
SuperScript VI buffer (5x)invitrogen18090050
T0est tube (5 mL)BD Falcon352052
Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL)AXYGENPCR-05-C
Triton X-100Sangon BiotechA600198-0500
TSO primer5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACATrGrG+G-3'
VortexTitanVM-T2

参考文献

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