식물 세포 유형의 분리 및 전사체 분석

요약

고처리량 scRNA-seq 분석법의 실현 가능성과 효과는 식물 연구에서 단일 세포 시대를 예고합니다. 여기에 제시된 것은 특정 Arabidopsis thaliana 뿌리 세포 유형을 분리하고 후속 전사체 라이브러리 구성 및 분석을 위한 강력하고 완전한 절차입니다.

초록

다세포 유기체에서 발달 프로그래밍 및 환경 반응은 다른 세포 유형 또는 세포 내에서도 매우 다양할 수 있으며, 이를 세포 이질성이라고 합니다. 최근 몇 년 동안 차세대 염기서열 분석(NGS) 기술과 결합된 단일 세포 및 세포 유형 분리는 단일 세포 분해능에서 생물학적 과정을 연구하는 데 중요한 도구가 되었습니다. 그러나 식물 세포를 분리하는 것은 식물 세포벽의 존재로 인해 상대적으로 더 어려우며, 이는 식물에서 단일 세포 접근법의 적용을 제한합니다. 이 프로토콜은 식물 세포를 사용한 형광 활성화 세포 분류(FACS) 기반 단일 세포 및 세포 유형 분리를 위한 강력한 절차를 설명하며, 이는 다운스트림 다중 오믹스 분석 및 기타 연구에 적합합니다. 애기장 대 뿌리 형광 마커 라인을 사용하여 목부-극 페리사이클 세포, 측면 뿌리 초기 세포, 측면 뿌리 캡 세포, 피질 세포 및 내배엽 세포와 같은 특정 세포 유형이 어떻게 분리되는지 보여줍니다. 또한, Smart-seq2를 이용한 효과적인 다운스트림 전사체 분석 방법도 제공된다. 세포 분리 방법 및 전사체 분석 기술은 다른 세포 유형 및 식물 종에 적용할 수 있으며 식물 과학 분야에서 광범위한 응용 가능성을 가지고 있습니다.

서문

세포는 모든 생명체의 기본 단위이며 구조적 및 생리적 기능을 수행합니다. 다세포 유기체의 세포는 명백한 동시성을 나타내지만, 다른 유형과 개별 세포의 세포는 발달 및 환경 반응 동안 전사체에 차이를 나타냅니다. 고처리량 단일 세포 RNA 염기서열 분석(scRNA-seq)은 세포 이질성을 이해하는 데 있어 전례 없는 성능을 제공합니다. 식물 과학에 scRNA-seq를 적용하면 식물 세포 아틀라스¹을 성공적으로 구성하는 데 기여했으며, 식물 조직²에서 희귀 세포 분류군을 식별하는 데 사용되었으며, 식물 조직의 세포 유형 구성에 대한 통찰력을 제공하고, 식물 발달 및 분화 중에 사용되는 세포 정체성 및 중요한 기능을 식별하는 데 사용되었습니다. 또한, 식물 조직^(1,2,3)에서 시공간 발달 궤적을 추론하여 새로운 마커 유전자4를^{발견하고,} scRNA-seq를 사용하여 중요한 전사 인자⁵의 기능을 연구하여^{다른 식물3}에서 동일한 세포 유형의 진화적 보존을 밝힐 수 있다. 비생물적 스트레스는 식물의 성장과 발달에 가장 중요한 환경적 영향 중 하나입니다. 단일 세포 전사체 시퀀싱을 통해 다양한 치료 조건에서 식물 조직의 세포 유형 구성 변화를 탐색함으로써 비생물적 스트레스 반응 메커니즘도 해결할 수 있습니다⁶.

scRNA 염기서열 분석을 사용하여 세포 유형 간의 전사 이질성을 해결할 수 있는 가능성은 세포 분리 방법 및 염기서열 분석 플랫폼에 따라 다릅니다. 형광 활성화 세포 분류(FACS)는 광 산란 및 세포의 형광 특성을 기반으로 scRNA-seq를 위해 세포의 하위 집단을 분리하는 데 널리 사용되는 기술입니다. 형질전환 기술에 의한 형광 마커 라인의 개발은 FACS⁷에 의한 세포 분리의 효율성을 크게 향상시켰습니다. Smart-seq2⁸을 사용하여 scRNA-seq를 수행하면 세포 이질성을 해부하는 능력이 더욱 향상됩니다. Smart-seq2 분석법은 유전자 검출에 대한 민감도가 우수하며, 낮은 전사체 입력(transcript input^)에서도 유전자를 검출할 수 있다 9. 벌크 세포 유형 수집 외에도 최신 세포 분류기는 단일 세포 인덱스 분류 형식을 제공하여 Smart-seq2¹⁰ 또는 CEL-seq2¹¹과 같은 기타 다중 RNA-seq 방법을 사용하여 단일 세포 분해능으로 전사체 분석을 가능하게 합니다. 단일 세포 또는 세포 유형 분류는 병렬 다중 오믹스 연구(parallel multi-omics studies)와 같은 다른 많은 다운스트림 응용 분야에 잠재적으로 사용될 수 있습니다^12,13. 여기에 제시된 것은 FACS에 의해 애기장대 마커 세포주의 뿌리에서 목부-극 페리사이클 세포, 측면 뿌리 캡 세포, 측면 뿌리 초기 세포, 피질 세포 및 내배엽 세포와 같은 식물 세포 유형을 분리하기 위한 강력하고 다재다능한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 또한 다운스트림 전사체 분석을 위한 Smart-seq2 라이브러리 구성을 포함합니다.

프로토콜

다음 프로토콜은 목부-극 페리사이클 세포(J0121), 측근 초기 세포, 외측 뿌리 캡 세포(J3411), 내피 및 피질 세포(J0571)(그림 1A)와 같은 뿌리 세포 유형에 대한 형광 및 형광 마커 라인이 없는 A. thaliana 야생형(WT) 종자에 최적화되었습니다. 이전에 발표된 보고서¹⁴에 이어 야생형 애기장대 식물에 GATA23 프로모터 구동 GFP 구축물을 도입함으로써 생성된 측근 개시 세포 마커 라인을 제외한 모든 마커 라인은 상업적 공급원(재료 표 참조)으로부터 수득하였다.

1. 식물 재료의 준비

1. A. thaliana WT 종자 및 형광 마커 라인 종자를 실온의 회전 배양기에서 20% 표백제로 15분 동안 배양하여 살균합니다.
2. 씨앗을 이중 증류수 (ddH₂O)로 3-5 회 헹굽니다. 멸균된 깨끗한 벤치에서 이 단계를 수행합니다.
3. WT 및 리포터 라인 시드를 0.8% 한천(w/v)¹⁵의 절반 강도 Murashige 및 Skoog(MS) 배지에 플레이트합니다. 4°C에서 2일 동안 성층화한 후 식물을 5일(23°C에서 16시간 빛) 동안 수직으로 성장시킵니다.

2. 프로토플라스팅

1. 용액 A 및 용액 B로 지칭되는 원형질체 용액 ^2,5를 준비한다(재료 표 참조).
   1. 400 mM 만니톨, 0.05% BSA, 20 mM MES (pH 5.7), 10 mM_CaCl2, 및 20 mM KCl을 함유하는 용액 A를 준비한다 ( 재료 표 참조). 용액 A를 -20°C에서 최대 1개월 동안 보관하십시오.
   2. 용액 A의 새로운 분취량에 1%(w/v) 셀룰라아제 R10, 1%(w/v) 셀룰라아제 RS, 1%(w/v) 헤미셀룰라아제, 0.5%(w/v) 펙톨리아제 및 1%(w/v) 마세로자임 R10을 첨가하여 용액 B를 준비합니다.
2. 실험을 시작하기 전에 용액 A와 용액 B를 얼음 위에서 부드럽게 해동합니다.
3. 깨끗한 칼날이나 가위로 뿌리를 잘라내고 뿌리를 ~0.5cm 크기로 자릅니다. 뿌리를 1.5mL의 용액 B에 담근 다음 실온에서 1.5-2시간 동안 부드럽게 회전(약 18rpm)합니다.
4. 40μm 스트레이너 메쉬를 통해 뿌리 원형질체를 여과합니다( 재료 표 참조).
5. 스트레이너 메쉬를 1-2mL의 용액 A로 헹굽니다.
6. 단계 2.4 및 단계 2.5의 액체를 합하고, 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리한다. 피펫으로 상청액을 버리고 용액 A 500-600 μL에 세포 펠릿을 재현탁 한 다음 즉시 얼음 위에 놓습니다.
7. 세포 분류를 위해 재현탁된 세포 용액을 새로운 5mL 시험관으로 옮깁니다.

3. 형광 활성화 세포 분류(FACS)

1. 전원을 켜고 분류기에서 기기 설정 단계를 완료합니다( 재료 표 참조). 형광 채널을 선택하고, WT 플랜트(형광 없음)를 대조군으로 사용하여 자가형광의 기준선을 결정하고, 형광 강도 및 FSC/SSC 싱글렛을 기반으로 분류 게이트를 조정합니다(그림 2).
2. 500μL의 용액 A(단계 2.1.1)를 1.5mL 수집 튜브에 추가하여 세포가 손상되는 것을 방지합니다. 튜브 당 2,000-3,000 개의 세포를 수집합니다.
3. 분류 후, 즉시 샘플을 얼음 위에 놓고, 세포를 함유하는 수집 튜브를 4°C에서 5분 동안 300 x g 로 원심분리하고, 피펫으로 상청액을 제거한다.
4. 분류된 세포 2μL를 취하여 형광 현미경을 사용하여 형광을 확인합니다( 재료 표 참조).
5. 분류된 셀을 -80°C에 보관하거나 라이브러리 구축에 즉시 사용합니다(4단계).
6. 단일 셀 인덱스 정렬의 경우 96웰 플레이트를 어댑터에 넣습니다. 물방울이 판의 중앙 구멍에 떨어지도록 판의 위치를 보정하십시오. 정렬 시 단일 셀 정렬 모드를 선택하고 정렬된 셀의 목표 수를 1로 입력하고 정렬을 시작합니다.

4. Smart-seq2 라이브러리 준비

1. 입력량이 매우 적기 때문에 오염이 없는 환경에서 single-cell type RNA-seq 라이브러리 구축을 수행합니다. 실험을 시작하기 전에 표면 오염 제거제⁸ ( 재료 표 참조)과 75% 에탄올로 벤치를 청소합니다.
2. 0.33 μL의 10% Triton X-100, 0.55 μL의 RNase 억제제 및 0.22 μL의 0.1 M DTT를 조합하여 용해 완충액(혼합물 A)(표 1)을 준비합니다( 재료 표 참조).
3. 혼합물 A 1μL를 분류된 샘플에 넣고 멸균 유봉으로 분쇄합니다. 바람직한 샘플 부피는 ≤0.5 μL; RNase가 없는 물을 사용하여 부피를 14μL로 구성합니다. 각 단일 세포 샘플을 0.2mL의 얇은 벽으로 된 PCR 튜브로 옮깁니다.
4. 0.44 μL의 oligo-dT 30 VN 역전사(RT) 반응 프라이머(100 μM)와 4.4 μL의 dNTP(₁₀mM)를 포함하는 혼합물 B를 준비합니다(표 2)( 표 참조).
5. 각 튜브의 샘플 14μL에 혼합물 B 4.4μL를 넣고 샘플을 부드럽게 피펫으로 혼합한 다음 샘플을 72°C에서 3분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 즉시 샘플을 얼음 위에 올려 놓고 올리고-dT를 폴리 A 테일에 혼성화한다.
6. 역전사 반응 혼합물(혼합물 C)을 준비한다(표 3)( 재료 표 참조). 시료가 들어 있는 각 튜브에 혼합물 C 21.6μL를 추가합니다. 일반적인 PCR 기기에서 RT 프로그램을 켭니다(표 4).
7. 얼음 위에서 사전 증폭 반응을 수행합니다. 44 μL의 2x PCR 중합효소 혼합물과 0.88 μL의 IS PCR 프라이머 (10 μM)를 조합하여 혼합물 D를 준비한다 (표 5) ( 표 참조). 40 μL의 RT 반응 생성물에 40 μL의 혼합물 D를 첨가하고, 프리증폭 프로그램을 실행한다(표 6).
8. Ampure XP 비드를 사용하여 사전 증폭 반응 생성물을 정제합니다( 재료 표 참조). 4.7단계의 각 샘플에 48μL의 비드(0.6:1 비율)를 추가하고 피펫팅으로 샘플을 부드럽게 혼합합니다.
9. 샘플을 실온에서 10분 동안 배양합니다. 샘플이 들어 있는 1.5mL 튜브를 자기 분리 스탠드에 5분 동안 놓습니다. 비드를 방해하지 않고 샘플에서 상청액을 조심스럽게 버리십시오.
10. 비드를 80% 에탄올 200μL에 재현탁하여 세척하고 에탄올 함유 상청액을 버리기 전에 샘플을 자기 분리 스탠드( 재료 표 참조)에 3분 더 놓습니다.
11. 샘플을 10분 동안 자연 건조하고 공기 건조 중 오염 및 교차 오염을 방지하기 위해 튜브를 덮습니다.
12. 비드를 20 μL의_ddH2O에 재현탁하고, 샘플을 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 다음, 5분 동안 자기 분리 스탠드 위에 놓는다.
13. 각 튜브에서 상층액 18μL를 피펫으로 꺼내고 샘플을 새 1.5mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 1μL의 샘플을 사용하여 DNA 정량 키트를 사용하여 cDNA의 품질을 평가하고, 단편 분석기( 재료 표 참조)를 사용하여 각 사전 라이브러리의 크기 분포를 결정하고, 나머지 샘플을 -20°C에서 보관합니다.
14. 시퀀싱 라이브러리 준비 키트를 사용하여 단계 4.13의 사전 라이브러리 제품으로부터 일루미나 시퀀싱(¹⁶)^{을 위한} cDNA 라이브러리(8)를 구축한다(재료 표 참조).
15. Ampure XP 비드를 사용하여 라이브러리를 정제하고(단계 4.14부터) 정제된 라이브러리를 정량화하고, 단계 4.13에 따라 각 라이브러리의 크기 분포를 결정합니다.
    참고: 각 라이브러리의 동일한 나노몰을 풀링하여 그 중 어느 것도 동일한 Illumina 인덱스 조합을 갖지 않도록 합니다. 그렇지 않으면 라이브러리를 원하는 시퀀싱 출력에 따라 비율로 풀링하고 Illumina 시퀀서의 동일한 레인에서 함께 시퀀싱할 수 있습니다. 일반적으로 각 라이브러리를 4-6GB 깊이로 시퀀싱하면 > 1,000만 개의 매핑된 읽기가 생성되며 애기장대 게놈의 20x-30x 범위를 제공합니다. 더 낮은 시퀀싱 깊이도 허용되지만 차등 발현 분석의 중요성에 영향을 미칠 수 있습니다.

5. RNA-seq 데이터 분석

1. Trim-Galore¹⁷을 사용하여 원시 판독을 트리밍한 후 hisat2 18(daehwankimlab.github.io/hisat2)을 사용하여 참조 게놈에 매핑하고 Picard¹⁹(broadinstitute.github.io/picard)를 사용하여 PCR 중복 단편을 제거합니다.
2. 각 샘플에 대해 최소 3개의 생물학적 복제물을 사용하여 DESeq2²⁰ 으로 차등적으로 발현된 유전자(DEG)의 원시 카운트 처리 및 후속 분석을 수행합니다. Pheatmap 패키지를 사용하여 유전자 발현의 클러스터링을 수행하고 발현 히트맵에서 시각화합니다.
   참고: 유전자 및 TE(전치 가능한 요소)의 RPKM(킬로베이스당 매핑된 읽기 수당 읽기 수) 값은 Stringtie¹⁸ (github.com/gpertea/stringtie)로 계산되고 게놈 브라우저에서 시각화되었습니다.

결과

원형질체 분리
이 프로토콜은 형광 A. thaliana 루트 마커 라인의 원형질체 분류에 효과적입니다. 이러한 마커 라인은 형광 단백질과 표적 세포 유형에서 특이적으로 발현되는 유전자를 융합하거나 인핸서 트랩 라인을 사용하여 개발되었습니다(그림 1). 수많은 조직과 기관이 모델 식물과 작물에서 특정 형광 마커를 발현하는 세포 유형으로 해부되었습니?...

토론

Smart-seq2 기반 프로토콜은 수백^{개의 셀(}8)로부터 신뢰할 수 있는 시퀀싱 라이브러리를 생성할 수 있다. 출발 물질의 품질은 전사체 분석의 정확성에 필수적입니다. FACS는 관심 세포를 준비하기 위한 강력한 도구이지만, 이 절차, 특히 원형질체 단계는 식물 응용 분야에 최적화되어야 합니다. 레이저 포획 미세해부(LCM) 또는 수동 해부된 세포도 입력(^25,26)으로서 사...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm strainer	Sorfa	622110
Agar	Yeasen	70101ES76
Agilent fragment analyzer	Aglient	Aglient 5200
Agilent high-sensitivity DNA kit	Aglient	DNF-474-0500
Ampure XP beads	BECKMAN	A63881
Betaine	yuanye	S18046-100g
Bleach	Mr Muscle	FnBn83BK	20% (v/v) bleach
BSA	sigma	9048-46-8
CaCl2	yuanye	S24109-500g
Cellulase R10	Yakult (Japan)	9012-54-8
Cellulase RS	Yakult (Japan)	9012-54-8
Centrifuge tube (1.5 mL)	Eppendolf	30121589
DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants	Beyotime	R0127
dNTPs (10 mM)	NEB	N0447S
DTT (0.1 M)	invitrogen	18090050
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	100092680
FACS	BD FACS Melody	BD-65745
FACS	Sony	SH800S
Filter tip  (1000 µL)	Thermo Scientific	TF112-1000-Q
Filter tip  (200 µL)	Thermo Scientific	TF140-200-Q
Filter tip (10 µL)	Thermo Scientific	TF104-10-Q
Filter tip (100 µL)	Thermo Scientific	TF113-100-Q
Fluorescent microscope	Nikon	Eclipse Ni-E
Four-Dimensional Rotating Mixer	Kylin -Bell	BE-1100
Hemicellulase	sigma	9025-56-3
IS PCR primer			5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3'
KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X)	Roche	7958935001
KCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	7447-40-7
Macerozyme R10	Yakult (Japan)	9032-75-1
Magnetic separation stand	invitrogen	12321D
Mannitol	aladdin	69-65-8
MES	aladdin	145224948
MgCl2	yuanye	R21455-500ml
Microcentrifuges	Eppendorf	Centrifuge 5425
Micro-mini-centrifuge	Titan	Timi-10k
MS	Phytotech	M519
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	illumina	FC-131-1024
oligo-dT30VN primer			5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3'
PCR instrument	Thermal cycler	A24811
Pectolyase	Yakult (Japan)	9033-35-6
Plant marker lines	Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)
Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit	invitrogen	Q33231
Qubit 2.0 fluorometer	invitrogen	Q32866
RNase inhibitor	Thermo Scientific	EO0382
RNase-free water	invitrogen	10977023
Solution A			400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl
Solution B			1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 %  (w/v)hemicellulase, 0.5 %  (w/v)pectolyase and 1 %  (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A
Sterile pestle	BIOTREAT	453463
Strainer (40 µm )	Sorfa	251100
Superscript enzyme (200 U/µL)	invitrogen	18090050
SuperScript VI buffer (5x)	invitrogen	18090050
T0est tube (5 mL)	BD Falcon	352052
Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL)	AXYGEN	PCR-05-C
Triton X-100	Sangon Biotech	A600198-0500
TSO primer			5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3'
Vortex	Titan	VM-T2