식물 세포 유형의 분리 및 전사체 분석

요약

고처리량 scRNA-seq 분석법의 실현 가능성과 효과는 식물 연구에서 단일 세포 시대를 예고합니다. 여기에 제시된 것은 특정 Arabidopsis thaliana 뿌리 세포 유형을 분리하고 후속 전사체 라이브러리 구성 및 분석을 위한 강력하고 완전한 절차입니다.

초록

다세포 유기체에서 발달 프로그래밍 및 환경 반응은 다른 세포 유형 또는 세포 내에서도 매우 다양할 수 있으며, 이를 세포 이질성이라고 합니다. 최근 몇 년 동안 차세대 염기서열 분석(NGS) 기술과 결합된 단일 세포 및 세포 유형 분리는 단일 세포 분해능에서 생물학적 과정을 연구하는 데 중요한 도구가 되었습니다. 그러나 식물 세포를 분리하는 것은 식물 세포벽의 존재로 인해 상대적으로 더 어려우며, 이는 식물에서 단일 세포 접근법의 적용을 제한합니다. 이 프로토콜은 식물 세포를 사용한 형광 활성화 세포 분류(FACS) 기반 단일 세포 및 세포 유형 분리를 위한 강력한 절차를 설명하며, 이는 다운스트림 다중 오믹스 분석 및 기타 연구에 적합합니다. 애기장 대 뿌리 형광 마커 라인을 사용하여 목부-극 페리사이클 세포, 측면 뿌리 초기 세포, 측면 뿌리 캡 세포, 피질 세포 및 내배엽 세포와 같은 특정 세포 유형이 어떻게 분리되는지 보여줍니다. 또한, Smart-seq2를 이용한 효과적인 다운스트림 전사체 분석 방법도 제공된다. 세포 분리 방법 및 전사체 분석 기술은 다른 세포 유형 및 식물 종에 적용할 수 있으며 식물 과학 분야에서 광범위한 응용 가능성을 가지고 있습니다.

서문

세포는 모든 생명체의 기본 단위이며 구조적 및 생리적 기능을 수행합니다. 다세포 유기체의 세포는 명백한 동시성을 나타내지만, 다른 유형과 개별 세포의 세포는 발달 및 환경 반응 동안 전사체에 차이를 나타냅니다. 고처리량 단일 세포 RNA 염기서열 분석(scRNA-seq)은 세포 이질성을 이해하는 데 있어 전례 없는 성능을 제공합니다. 식물 과학에 scRNA-seq를 적용하면 식물 세포 아틀라스¹을 성공적으로 구성하는 데 기여했으며, 식물 조직²에서 희귀 세포 분류군을 식별하는 데 사용되었으며, 식물 조직의 세포 유형 구성에 대한 통찰력을 제공하고, 식물 발달 및 분화 중에 사용되는 세포 정체성 및 중요한 기능을 식별하는 데 사용되었습니다. 또한, 식물 조직^(1,2,3)에서 시공간 발달 궤적을 추론하여 새로운 마커 유전자4를^{발견하고,} scRNA-seq를 사용하여 중요한 전사 인자⁵의 기능을 연구하여^{다른 식물3}에서 동일....

프로토콜

다음 프로토콜은 목부-극 페리사이클 세포(J0121), 측근 초기 세포, 외측 뿌리 캡 세포(J3411), 내피 및 피질 세포(J0571)(그림 1A)와 같은 뿌리 세포 유형에 대한 형광 및 형광 마커 라인이 없는 A. thaliana 야생형(WT) 종자에 최적화되었습니다. 이전에 발표된 보고서¹⁴에 이어 야생형 애기장대 식물에 GATA23 프로모터 구동 GFP 구축물을 도입함으로써 생성된 측근 개시 세포 마커 라인을 제외한 모든 마커 라인은 상업적 공급원(재료 표 참조)으로부터 수득하였다.

1. 식물 재료의 준비

1. A. thaliana WT 종자 및 형광 마커 라인 종자를 실온의 회전 배양기에서 20% 표백제로 15분 동안 배양하여 살균합니다.
2. 씨앗을 이중 증류수 (ddH₂O)로 3-5 회 헹굽니다. 멸균된 깨끗한 벤치에서 이 단계를 수행합니다.
3. WT 및 리포터 라인 시드를 0.8% 한천(w/v)¹⁵의 절반 강도 Murashi....

결과

원형질체 분리
이 프로토콜은 형광 A. thaliana 루트 마커 라인의 원형질체 분류에 효과적입니다. 이러한 마커 라인은 형광 단백질과 표적 세포 유형에서 특이적으로 발현되는 유전자를 융합하거나 인핸서 트랩 라인을 사용하여 개발되었습니다(그림 1). 수많은 조직과 기관이 모델 식물과 작물에서 특정 형광 마커를 발현하는 세포 유형으로 해부되었습니?.......

토론

Smart-seq2 기반 프로토콜은 수백^{개의 셀(}8)로부터 신뢰할 수 있는 시퀀싱 라이브러리를 생성할 수 있다. 출발 물질의 품질은 전사체 분석의 정확성에 필수적입니다. FACS는 관심 세포를 준비하기 위한 강력한 도구이지만, 이 절차, 특히 원형질체 단계는 식물 응용 분야에 최적화되어야 합니다. 레이저 포획 미세해부(LCM) 또는 수동 해부된 세포도 입력(^25,26)으로서 사.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm strainer	Sorfa	622110
Agar	Yeasen	70101ES76
Agilent fragment analyzer	Aglient	Aglient 5200
Agilent high-sensitivity DNA kit	Aglient	DNF-474-0500
Ampure XP beads	BECKMAN	A63881
Betaine	yuanye	S18046-100g
Bleach	Mr Muscle	FnBn83BK	20% (v/v) bleach
BSA	sigma	9048-46-8
CaCl2	yuanye	S24109-500g
Cellulase R10	Yakult (Japan)	9012-54-8
Cellulase RS	Yakult (Japan)	9012-54-8
Centrifuge tube (1.5 mL)	Eppendolf	30121589
DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants	Beyotime	R0127
dNTPs (10 mM)	NEB	N0447S
DTT (0.1 M)	invitrogen	18090050
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	100092680
FACS	BD FACS Melody	BD-65745
FACS	Sony	SH800S
Filter tip  (1000 µL)	Thermo Scientific	TF112-1000-Q
Filter tip  (200 µL)	Thermo Scientific	TF140-200-Q
Filter tip (10 µL)	Thermo Scientific	TF104-10-Q
Filter tip (100 µL)	Thermo Scientific	TF113-100-Q
Fluorescent microscope	Nikon	Eclipse Ni-E
Four-Dimensional Rotating Mixer	Kylin -Bell	BE-1100
Hemicellulase	sigma	9025-56-3
IS PCR primer			5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3'
KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X)	Roche	7958935001
KCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	7447-40-7
Macerozyme R10	Yakult (Japan)	9032-75-1
Magnetic separation stand	invitrogen	12321D
Mannitol	aladdin	69-65-8
MES	aladdin	145224948
MgCl2	yuanye	R21455-500ml
Microcentrifuges	Eppendorf	Centrifuge 5425
Micro-mini-centrifuge	Titan	Timi-10k
MS	Phytotech	M519
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	illumina	FC-131-1024
oligo-dT30VN primer			5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3'
PCR instrument	Thermal cycler	A24811
Pectolyase	Yakult (Japan)	9033-35-6
Plant marker lines	Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)
Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit	invitrogen	Q33231
Qubit 2.0 fluorometer	invitrogen	Q32866
RNase inhibitor	Thermo Scientific	EO0382
RNase-free water	invitrogen	10977023
Solution A			400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl
Solution B			1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 %  (w/v)hemicellulase, 0.5 %  (w/v)pectolyase and 1 %  (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A
Sterile pestle	BIOTREAT	453463
Strainer (40 µm )	Sorfa	251100
Superscript enzyme (200 U/µL)	invitrogen	18090050
SuperScript VI buffer (5x)	invitrogen	18090050
T0est tube (5 mL)	BD Falcon	352052
Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL)	AXYGEN	PCR-05-C
Triton X-100	Sangon Biotech	A600198-0500
TSO primer			5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3'
Vortex	Titan	VM-T2