JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Осуществимость и эффективность высокопроизводительных методов секвенирования скРНК предвещают эру одноклеточных исследований растений. Здесь представлена надежная и полная процедура выделения конкретных типов клеток корня Arabidopsis thaliana и последующего построения и анализа библиотеки транскриптома.

Аннотация

В многоклеточных организмах программирование развития и реакции окружающей среды могут сильно различаться в разных типах клеток или даже внутри клеток, что известно как клеточная гетерогенность. В последние годы выделение отдельных клеток и клеток в сочетании с методами секвенирования следующего поколения (NGS) стали важными инструментами для изучения биологических процессов при разрешении в одной клетке. Однако выделение растительных клеток относительно сложнее из-за наличия клеточных стенок растений, что ограничивает применение одноклеточных подходов у растений. Этот протокол описывает надежную процедуру выделения одноклеточных и клеточных клеток на основе флуоресцентно-активированной сортировки (FACS) с растительными клетками, которая подходит для последующего мультиомиксного анализа и других исследований. Используя флуоресцентные маркерные линии корня арабидопсиса , мы демонстрируем, как выделяются определенные типы клеток, такие как клетки перицикла ксилемы, начальные клетки латерального корня, клетки боковой крышки корня, клетки коры и энтодермальные клетки. Кроме того, предусмотрен эффективный последующий метод анализа транскриптома с использованием Smart-seq2. Метод выделения клеток и методы анализа транскриптома могут быть адаптированы к другим типам клеток и видам растений и имеют широкий потенциал применения в науке о растениях.

Введение

Клетки являются основной единицей всех живых организмов и выполняют структурные и физиологические функции. Хотя клетки в многоклеточных организмах демонстрируют кажущуюся синхронность, клетки разных типов и отдельные клетки демонстрируют различия в своих транскриптомах во время развития и реакций окружающей среды. Высокопроизводительное секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq) обеспечивает беспрецедентную мощность для понимания клеточной гетерогенности. Применение scRNA-seq в науках о растениях способствовало успешному построению атласарастительных клеток 1, использовалось для идентификации редких клеточных таксонов в тканях растений2, дало представление о составе типов клеток в тканях растений и использовалось для идентификации клеточной идентичности и важных функций, используемых во время развития и дифференцировки растений. Кроме того, можно вывести пространственно-временные траектории развития в тканях растений 1,2,3, открыть новые гены-маркеры 4 и изучить функции важных факторов транскрипции5 с помощью scRNA-seq, чтобы выявить эволюционное сохранение одного и того же типа клеток у разных растений 3. Абиотические стрессы являются одними из наиболее важных факторов воздействия окружающей среды на рост и развитие растений. Исследуя изменения в составе типов клеток в тканях растений в различных условиях лечения с помощью секвенирования одноклеточного транскриптома, можно также разрешить механизм абиотической реакциина стресс 6.

Потенциал разрешения транскрипционной гетерогенности между типами клеток с использованием секвенирования скРНК зависит от метода выделения клеток и платформы секвенирования. Сортировка клеток, активируемая флуоресценцией (FACS), является широко используемым методом выделения субпопуляции клеток для scRNA-seq на основе рассеяния света и флуоресцентных свойств клеток. Разработка флуоресцентных маркерных линий с помощью трансгенной технологии значительно повысила эффективность выделения клеток с помощью FACS7. Проведение секвенирования скРНК с использованием Smart-seq28 еще больше усиливает способность препарировать клеточную гетерогенность. Метод Smart-seq2 обладает хорошей чувствительностью для детекции генов и может обнаруживать гены даже при низком входе транскрипта9. В дополнение к массовому сбору типов клеток, современные сортировщики клеток предоставляют формат сортировки индекса одной ячейки, что позволяет проводить анализ транскриптома с разрешением одной клетки с использованием Smart-seq210 или других мультиплексных методов секвенирования РНК, таких как CEL-seq211. Сортировка по одной ячейке или по ячейке потенциально может быть использована для многих других последующих приложений, таких как параллельные мультиомические исследования12,13. Здесь представлен надежный и универсальный протокол для выделения типов растительных клеток, таких как клетки перицикла ксилемы, клетки боковой корневой крышки, начальные клетки бокового корня, клетки коры и энтодермальные клетки из корней маркерных клеточных линий Arabidopsis thaliana с помощью FACS. Кроме того, протокол включает в себя создание библиотеки Smart-seq2 для последующего анализа транскриптома.

протокол

Следующий протокол был оптимизирован для семян дикого типа (WT) A. thaliana без флуоресцентных и флуоресцентных маркерных линий для следующих типов корневых клеток: клетки перицикла ксилемы-полюса (J0121), начальные клетки бокового корня, клетки боковой корневой крышки (J3411), клетки энтодермы и коры (J0571) (рис. 1A). Все маркерные линии были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов), за исключением маркерной линии клеток инициации бокового корня, которая была получена путем введения конструкции GFP, управляемой промотором GATA23, в растение Arabidopsis дикого типа в соответствии с ранее опубликованным отчетом14.

1. Подготовка растительного сырья

  1. Стерилизуют семена A. thaliana WT и семена флуоресцентной маркерной линии, инкубируя семена в 20% отбеливателе во вращающемся инкубаторе при комнатной температуре в течение 15 минут.
  2. Промойте семена в воде двойной дистилляции (ddH2O) от трех до пяти раз. Выполните этот шаг на стерильной чистой скамье.
  3. Нанесите семена WT и репортерной линии на среднюю средность Murashige и Skoog (MS) половинной крепости с 0,8% агара (мас./об.)15. Выращивайте растения вертикально в течение 5 дней (16 часов света при 23 ° C) после стратификации в течение 2 дней при 4 ° C.

2. Протопластинг

  1. Приготовьте протопластные растворы2,5, называемые раствором А и раствором В (см. Таблицу материалов).
    1. Приготовьте раствор А, содержащий 400 мМ маннита, 0,05% BSA, 20 мМ MES (рН 5,7), 10 мМ CaCl2 и 20 мМ KCl (см. Таблицу материалов). Храните раствор А при температуре −20 °C до 1 месяца.
    2. Приготовьте раствор B, добавив 1% (мас./об.) целлюлазы R10, 1% (мас./об.) целлюлазы RS, 1% (мас./об.) гемицеллюлазы, 0,5% (мас./об.) пектолиазы и 1% (мас./об.) мацероцима R10 в свежей аликвоте раствора А. Храните раствор B при -20 °C до 1 месяца.
  2. Аккуратно разморозьте раствор А и раствор Б на льду перед началом эксперимента.
  3. Срежьте корни чистым лезвием или ножницами и измельчите корни на кусочки ~0,5 см. Погрузите корни в 1,5 мл раствора B с последующим осторожным вращением (примерно при 18 об/мин) при комнатной температуре в течение 1,5-2 часов.
  4. Отфильтруйте корневые протопласты через сетчатый фильтр 40 мкм (см. Таблицу материалов).
  5. Промойте сетку сетчатого фильтра 1-2 мл раствора А.
  6. Смешайте жидкости на шагах 2.4 и 2.5 и центрифугируйте при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки, ресуспендируйте клеточную гранулу в 500-600 мкл раствора А, а затем немедленно поместите ее на лед.
  7. Перенесите ресуспендированный клеточный раствор в новую пробирку объемом 5 мл для сортировки клеток.

3. Сортировка клеток, активируемая флуоресценцией (FACS)

  1. Включите и завершите шаги настройки прибора на сортировщике (см. Таблицу материалов). Выберите флуоресцентные каналы, используйте установку WT (без флуоресценции) в качестве элемента управления, чтобы определить базовую линию для автофлуоресценции, и отрегулируйте сортировочный затвор в зависимости от интенсивности флуоресценции и синглетов FSC/SSC (рис. 2).
  2. Добавьте 500 мкл раствора А (этап 2.1.1) в пробирку для сбора объемом 1,5 мл, чтобы предотвратить повреждение клеток. Соберите 2 000-3 000 клеток в пробирке.
  3. После сортировки немедленно поместите образцы на лед, центрифугируйте сборную пробирку, содержащую клетки при 300 x g , в течение 5 мин при 4 ° C и удалите надосадочную жидкость пипеткой.
  4. Возьмите 2 мкл отсортированных клеток и проверьте наличие флуоресценции с помощью флуоресцентного микроскопа (см. Таблицу материалов).
  5. Храните отсортированные ячейки при температуре −80 °C или сразу же используйте их для создания библиотеки (шаг 4).
  6. Для сортировки индекса по одной ячейке поместите пластину с 96 лунками в адаптер. Откалибруйте положение пластины так, чтобы капля попадала в центральное отверстие пластины. Выберите режим сортировки по одной ячейке при сортировке, введите целевое количество отсортированных ячеек равным 1 и начните сортировку.

4. Подготовка библиотеки Smart-seq2

  1. В результате сверхмалого количества входных данных выполните построение библиотеки РНК-секвенирования одноклеточного типа в среде, свободной от загрязнения. Перед началом эксперимента очистите стенд поверхностным обеззараживающим средством8 (см. Таблицу материалов) и 75% этанолом.
  2. Приготовьте буфер для лизиса (смесь А) (таблица 1), объединив 0,33 мкл 10% Triton X-100, 0,55 мкл ингибитора РНКазы и 0,22 мкл 0,1 М DTT (см. Таблицу материалов).
  3. Добавьте 1 мкл смеси А в отсортированный образец и измельчите стерильным пестиком. Предпочтительный объем образца составляет ≤0,5 мкл; используйте воду, не содержащую РНКазы, чтобы восполнить объем до 14 мкл. Перенесите каждый образец клетки в тонкостенную пробирку для ПЦР объемом 0,2 мл.
  4. Приготовьте смесь B, содержащую 0,44 мкл реакционного праймера с обратной транскрипцией (RT) oligo-dT 30 VN (100 мкМ) и 4,4 мкл dNTP (10мМ) (таблица 2) (см. Таблицу материалов).
  5. Добавьте 4,4 мкл смеси B к 14 мкл образца в каждой пробирке, аккуратно перемешайте образец пипеткой и инкубируйте образец при 72 ° C в течение 3 минут. После инкубации немедленно поместите образцы на лед, чтобы гибридизировать олиго-dT с поли-А-хвостом.
  6. Приготовьте реакционную смесь обратной транскрипции (смесь С) (табл. 3) (см. Таблицу материалов). Добавьте 21,6 мкл смеси С в каждую пробирку, содержащую образцы. Включите программу ЛТ на обычном ПЦР-приборе (табл. 4).
  7. Проведите реакцию предварительного усиления на льду. Приготовьте смесь D, соединив 44 мкл смеси 2x ПЦР-полимеразы и 0,88 мкл праймера IS PCR (10 мкМ) (таблица 5) (см. Таблицу материалов). Добавьте 40,8 мкл смеси D к 40 мкл продукта реакции RT и запустите программу предварительного усиления (таблица 6).
  8. Очистите продукты реакции предварительного усиления с помощью гранул Ampure XP (см. Таблицу материалов). Добавьте 48 мкл шариков (соотношение 0,6:1) в каждый образец с шага 4.7 и аккуратно перемешайте образцы с помощью пипетки.
  9. Инкубируют образцы при комнатной температуре в течение 10 мин. Поместите пробирки объемом 1,5 мл с образцами на стенд для магнитной сепарации на 5 минут. Аккуратно сбрасывайте надосадочную жидкость с образцов, не повреждая бусины.
  10. Промойте шарики, ресуспендировав их в 200 мкл 80% этанола, и поместите образцы на стенд для магнитной сепарации (см. Таблицу материалов) еще на 3 минуты, прежде чем выбросить надосадочную жидкость, содержащую этанол.
  11. Высушите образцы на воздухе в течение 10 минут и накройте пробирку, чтобы предотвратить загрязнение и перекрестное загрязнение во время сушки на воздухе.
  12. Ресуспендируют шарики в 20 мкл ddH2O, инкубируют образцы при комнатной температуре в течение 5 мин, а затем помещают их на стенд для магнитной сепарации на 5 мин.
  13. Пипеткой вынимают 18 мкл надосадочной жидкости из каждой пробирки и переносят образцы в новые центрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Используйте 1 мкл образца для оценки качества кДНК с помощью набора для количественного определения ДНК, определите распределение по размерам каждой предварительной библиотеки с помощью анализатора фрагментов (см. Таблицу материалов) и храните оставшийся образец при -20 ° C.
  14. Создайте библиотекукДНК 8 для секвенированияIllumina 16 из предбиблиотечного продукта шага 4.13, используя набор для подготовки библиотеки секвенирования (см. Таблицу материалов).
  15. Очистите библиотеки (из шага 4.14) с помощью шариков Ampure XP, количественно определите очищенные библиотеки и определите распределение размеров каждой библиотеки после шага 4.13.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объедините равные наномоли каждой библиотеки, убедившись, что ни один из них не имеет одинаковой комбинации индекса Illumina. В противном случае библиотеки могут быть объединены в соотношение, основанное на желаемом выходе секвенирования, и секвенированы вместе на одной полосе секвенсора Illumina. Как правило, секвенирование каждой библиотеки на глубину 4-6 ГБ, что дает >10 миллионов картированных чтений, обеспечивает 20-30-кратный охват генома Arabidopsis . Меньшая глубина секвенирования также приемлема, но может повлиять на значимость анализа дифференциального выражения.

5. Анализ данных RNA-seq

  1. Обрежьте необработанные чтения с помощью Trim-Galore17 с последующим сопоставлением с эталонным геномом с помощью hisat218 (daehwankimlab.github.io/hisat2) и удалите дублированные фрагменты ПЦР с помощью Picard19 (broadinstitute.github.io/picard).
  2. Проведите обработку необработанного подсчета и последующий анализ дифференциально экспрессируемых генов (DEG) с помощью DESeq220 , используя по крайней мере три биологические реплики для каждого образца. Выполните кластеризацию экспрессии генов с помощью пакета Pheatmap и визуализируйте тепловую карту экспрессии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значения RPKM (чтений на килобазу на миллион картированных чтений) генов и TE (переносимых элементов) были рассчитаны с помощью Stringtie18 (github.com/gpertea/stringtie) и визуализированы в браузере генома.

Результаты

Изоляция протопласта
Этот протокол эффективен для сортировки протопластов флуоресцентных линий корневых маркеров A. thaliana. Эти маркерные линии были разработаны путем слияния флуоресцентных белков с генами, экспрессируемыми специфически в типах клеток-мишеней, или с ис?...

Обсуждение

Протокол на основе Smart-seq2 может генерировать надежные библиотеки секвенирования из нескольких сотен ячеек8. Качество исходного материала имеет важное значение для точности анализа транскриптома. FACS является мощным инструментом для подготовки клеток, представляющих инте?...

Раскрытие информации

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

Мы создали этот протокол в одноклеточном мультиомиксном центре Школы сельского хозяйства и биологии Шанхайского университета Цзяотун при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (грант No 32070608), Шанхайской программы Пуцзян (грант No 20PJ1405800) и Шанхайского университета Цзяотун (грант No Agri-X20200202, 2019TPB05).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm strainerSorfa 622110
AgarYeasen70101ES76
Agilent fragment analyzerAglientAglient 5200
Agilent high-sensitivity DNA kitAglientDNF-474-0500
Ampure XP beadsBECKMANA63881
BetaineyuanyeS18046-100g
BleachMr MuscleFnBn83BK20% (v/v) bleach
BSAsigma9048-46-8
CaCl2yuanyeS24109-500g
Cellulase R10Yakult (Japan)9012-54-8
Cellulase RSYakult (Japan)9012-54-8
Centrifuge tube (1.5 mL)Eppendolf30121589
DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface DecontaminantsBeyotimeR0127
dNTPs (10 mM)NEBN0447S
DTT (0.1 M)
invitrogen		18090050
EthanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd100092680
FACSBD FACS MelodyBD-65745
FACSSonySH800S
Filter tip  (1000 µL)Thermo ScientificTF112-1000-Q
Filter tip  (200 µL)Thermo ScientificTF140-200-Q
Filter tip (10 µL)Thermo ScientificTF104-10-Q
Filter tip (100 µL)Thermo ScientificTF113-100-Q
Fluorescent microscopeNikonEclipse Ni-E
Four-Dimensional Rotating MixerKylin -BellBE-1100
Hemicellulasesigma9025-56-3
IS PCR primer5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
T-3'
KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X)Roche 7958935001
KClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd7447-40-7
Macerozyme R10Yakult (Japan)9032-75-1
Magnetic separation standinvitrogen12321D
Mannitolaladdin69-65-8
MESaladdin145224948
MgCl2 yuanyeR21455-500ml
MicrocentrifugesEppendorfCentrifuge 5425
Micro-mini-centrifugeTitanTimi-10k
MSPhytotechM519
Nextera XT DNA Library Preparation KitilluminaFC-131-1024
oligo-dT30VN primer5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTVN-3'
PCR instrumentThermal cyclerA24811
PectolyaseYakult (Japan)9033-35-6
Plant marker linesNottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)
Qubit 1x dsDNA HS Assay KitinvitrogenQ33231
Qubit 2.0 fluorometerinvitrogenQ32866
RNase inhibitor Thermo ScientificEO0382
RNase-free waterinvitrogen10977023
Solution A400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl
Solution B1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 %  (w/v)hemicellulase, 0.5 %  (w/v)pectolyase and 1 %  (w/v) Macerozyme R10 in a fresh aliquot of solution A
Sterile pestleBIOTREAT453463
Strainer (40 µm )Sorfa 251100
SuperScript IV reverse transcriptase (200 U/µL)invitrogen18090050
SuperScript IV buffer (5x)invitrogen18090050
Test tube (5 mL)BD Falcon352052
Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL)AXYGENPCR-05-C
Triton X-100Sangon BiotechA600198-0500
TSO primer5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACATrGrG+G-3'
VortexTitanVM-T2

Ссылки

  1. Zhang, T. -. Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -. H., Wang, J. -. W. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nature Communications. 12 (1), 2053 (2021).
  2. Denyer, T., et al. Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing. Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).
  3. Liu, Q., et al. Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution. Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).
  4. Liu, Z., et al. Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing. Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).
  5. Shahan, R., et al. A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants. Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).
  6. Wendrich, J. R., et al. Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions. Science. 370 (6518), (2020).
  7. Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).
  8. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
  9. Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2. Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).
  10. Serrano-Ron, L., et al. Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation. Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).
  11. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
  12. Macaulay, I. C., et al. G&T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes. Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).
  13. Angermueller, C., et al. Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity. Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).
  14. De Rybel, B., et al. A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity. Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).
  15. Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy. Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).
  16. Levy, S. E., Myers, R. M. Advancements in next-generation sequencing. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).
  17. Ooi, C. C., et al. High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells. PLoS One. 12 (11), e0188510 (2017).
  18. Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown. Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).
  19. Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease. Journal of Open Source Software. 3, 583 (2018).
  20. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
  21. Kamiya, T., et al. The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).
  22. Zhang, Y., et al. Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation. Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).
  23. Haecker, A., et al. Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Development. 131 (3), 657-668 (2004).
  24. Chen, Q., et al. Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots. Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).
  25. Nichterwitz, S., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
  26. Long, J., et al. Nurse cell--derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis. Science. 373 (6550), (2021).
  27. Gutzat, R., et al. Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns. EMBO Journal. 39 (20), e103667 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

194

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены