Isolement et analyse transcriptome de types de cellules végétales

Résumé

La faisabilité et l’efficacité des méthodes de séquençage de l’ARNc à haut débit annoncent une ère unicellulaire dans la recherche sur les plantes. La présente ici est une procédure robuste et complète pour isoler des types spécifiques de cellules racinaires d’Arabidopsis thaliana et la construction et l’analyse ultérieures de la bibliothèque de transcriptomes.

Résumé

Dans les organismes multicellulaires, la programmation du développement et les réponses environnementales peuvent être très divergentes dans différents types de cellules ou même au sein des cellules, ce qui est connu sous le nom d’hétérogénéité cellulaire. Ces dernières années, l’isolement unicellulaire et de type cellulaire combiné aux techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS) sont devenus des outils importants pour étudier les processus biologiques à résolution unicellulaire. Cependant, l’isolement des cellules végétales est relativement plus difficile en raison de la présence de parois cellulaires végétales, ce qui limite l’application d’approches unicellulaires chez les plantes. Ce protocole décrit une procédure robuste pour l’isolement unicellulaire et de type cellulaire basé sur le tri activé par fluorescence (FACS) avec des cellules végétales, qui convient à l’analyse multi-omique en aval et à d’autres études. À l’aide de lignes de marqueurs fluorescents racinaires d’Arabidopsis , nous démontrons comment des types de cellules particuliers, tels que les cellules péricycliques xylèmes, les cellules initiales des racines latérales, les cellules de la calotte radiculaire latérale, les cellules du cortex et les cellules endodermiques, sont isolés. En outre, une méthode efficace d’analyse du transcriptome en aval utilisant Smart-seq2 est également fournie. La méthode d’isolement cellulaire et les techniques d’analyse du transcriptome peuvent être adaptées à d’autres types de cellules et espèces végétales et ont un large potentiel d’application en phytotechnie.

Introduction

Les cellules sont l’unité fondamentale de tous les organismes vivants et remplissent des fonctions structurelles et physiologiques. Bien que les cellules des organismes multicellulaires montrent une synchronicité apparente, les cellules de différents types et les cellules individuelles présentent des différences dans leurs transcriptomes au cours du développement et des réponses environnementales. Le séquençage d’ARN unicellulaire à haut débit (scRNA-seq) fournit une puissance sans précédent pour comprendre l’hétérogénéité cellulaire. L’application de scRNA-seq en sciences végétales a contribué à la construction réussie d’un atlas des cellules végétales¹, a été utilisée pour identifier les taxons cellulaires rares dans les tissus végétaux², a fourni un aperçu de la composition des types cellulaires dans les tissus végétaux et a été utilisée pour identifier l’identité cellulaire et les fonctions importantes utilisées pendant le développement et la différenciation des plantes. De plus, il est possible de déduire des trajectoires de développement spatio-temporelles dans les tissus végétaux ^1,2,3 pour découvrir de nouveaux gènes marqueurs⁴ et étudier les fonctions de facteurs de transcription importants⁵ en utilisant scRNA-seq afin de révéler la conservation évolutive d’un même type cellulaire chez différentes plantes³. Les stress abiotiques sont parmi les influences environnementales les plus importantes sur la croissance et le développement des plantes. En explorant les changements dans la composition des types cellulaires dans les tissus végétaux dans différentes conditions de traitement grâce au séquençage du transcriptome unicellulaire, on peut également résoudre le mécanisme de réponse au stress abiotique⁶.

Le potentiel de résolution de l’hétérogénéité transcriptionnelle entre les types cellulaires à l’aide du séquençage de l’ARNc dépend de la méthode d’isolement cellulaire et de la plate-forme de séquençage. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) est une technique largement utilisée pour isoler une sous-population de cellules pour scRNA-seq en fonction de la diffusion de la lumière et des propriétés de fluorescence des cellules. Le développement de lignes de marqueurs fluorescentes par la technologie transgénique a considérablement amélioré l’efficacité de l’isolement cellulaire par FACS⁷. La réalisation de scRNA-seq à l’aide de Smart-seq2⁸ améliore encore la capacité à disséquer l’hétérogénéité cellulaire. La méthode Smart-seq2 a une bonne sensibilité pour la détection des gènes et peut détecter les gènes même avec une faible entrée^de transcrit 9. En plus de la collecte de types de cellules en vrac, les trieurs cellulaires modernes fournissent un format de tri à index unicellulaire, permettant l’analyse du transcriptome à une résolution de cellule unique en utilisant Smart-seq2¹⁰ ou d’autres méthodes de séquençage d’ARN multiplexé, telles que CEL-seq2¹¹. Le tri unicellulaire ou de type cellulaire peut être potentiellement utilisé pour de nombreuses autres applications en aval, telles que les études multi-omiques parallèles^12,13. Un protocole robuste et polyvalent est présenté ici pour isoler les types de cellules végétales, telles que les cellules péricycliques xylèmes, les cellules de la calotte radiculaire latérale, les cellules initiales des racines latérales, les cellules du cortex et les cellules endodermiques des racines des lignées cellulaires marqueurs d’Arabidopsis thaliana par FACS. Le protocole implique en outre la construction de la bibliothèque Smart-seq2 pour l’analyse du transcriptome en aval.

Protocole

Le protocole suivant a été optimisé pour les semences de type sauvage (WT) d’A. thaliana sans fluorescence et les lignes marqueurs fluorescentes pour les types de cellules racinaires suivants : cellules péricycliques xylèmes-pôles (J0121), cellules initiales des racines latérales, cellules de la calotte radiculaire latérale (J3411), cellules de l’endoderme et du cortex (J0571) (Figure 1A). Toutes les lignées marqueurs ont été obtenues à partir d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux), à l’exception de la lignée de marqueurs de cellules d’initiation racinaires latérales, qui a été générée par l’introduction d’une construction GFP pilotée par le promoteur GATA23 dans une plante Arabidopsis de type sauvage à la suite d’un rapport publié précédemment¹⁴.

1. Préparation du matériel végétal

1. Stériliser les graines d’A. thaliana WT et les graines de la lignée de marqueurs fluorescents en incubant les graines dans de l’eau de Javel à 20 % dans un incubateur rotatif à température ambiante pendant 15 min.
2. Rincer les graines dans de l’eau bidistillée (_ddH2O) trois à cinq fois. Effectuez cette étape sur un banc propre et stérile.
3. Plaquer les graines de la ligne WT et reporter sur un milieu de Murashige et Skoog (MS) à demi-concentration avec une gélose à 0,8 % (p/v)¹⁵. Cultiver les plantes verticalement pendant 5 jours (16 h de lumière à 23 °C) après stratification pendant 2 jours à 4 °C.

2. Protoplasting

1. Préparer les solutions protoplastiques^2,5, appelées solution A et solution B (voir tableau des matières).
   1. Préparer la solution A contenant 400 mM de mannitol, 0,05 % de BSA, 20 mM de MES (pH 5,7), 10 mM de CaCl₂ et 20 mM de KCl (voir le tableau des matières). Conserver la solution A à −20 °C jusqu’à 1 mois.
   2. Préparer la solution B en ajoutant 1 % (p/v) de cellulase R10, 1 % (p/v) de cellulase RS, 1 % (p/v) d’hémicellulase, 0,5 % (p/v) de pectolyase et 1 % (p/v) de macérozyme R10 dans une nouvelle partie aliquote de la solution A. Conservez la solution B à −20 °C pendant 1 mois maximum.
2. Décongeler doucement la solution A et la solution B sur la glace avant de commencer l’expérience.
3. Coupez les racines à l’aide d’une lame propre ou de ciseaux et coupez les racines en morceaux de ~0,5 cm. Immerger les racines dans 1,5 mL de solution B suivie d’une rotation douce (à environ 18 rpm) à température ambiante pendant 1,5 à 2 h.
4. Filtrer les protoplastes racinaires à travers le maillage de la crépine de 40 μm (voir le tableau des matériaux).
5. Rincer le filet de la crépine avec 1-2 mL de solution A.
6. Combiner les liquides des étapes 2.4 et 2.5 et centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette, remettre en suspension la pastille de la cellule dans 500 à 600 μL de solution A, puis la placer immédiatement sur de la glace.
7. Transférer la solution cellulaire remise en suspension dans un nouveau tube à essai de 5 mL pour le tri des cellules.

3. Tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

1. Allumez et terminez les étapes de configuration de l’instrument sur le trieur (voir le tableau des matériaux). Sélectionnez les canaux de fluorescence, utilisez une plante WT (pas de fluorescence) comme témoin pour déterminer la ligne de base pour l’autofluorescence et ajustez la grille de tri en fonction de l’intensité de fluorescence et des singulets FSC/SSC (Figure 2).
2. Ajouter 500 μL de solution A (étape 2.1.1) dans un tube de prélèvement de 1,5 mL pour éviter que les cellules ne soient endommagées. Recueillir 2 000 à 3 000 cellules par tube.
3. Après tri, placer immédiatement les échantillons sur de la glace, centrifuger le tube de prélèvement contenant les cellules à 300 x g pendant 5 min à 4 °C et retirer le surnageant à l’aide d’une pipette.
4. Prenez 2 μL de cellules triées et vérifiez la fluorescence à l’aide d’un microscope à fluorescence (voir le tableau des matériaux).
5. Stockez les cellules triées à −80 °C ou utilisez-les immédiatement pour la construction de bibliothèques (étape 4).
6. Pour le tri d’index unicellulaire, placez la plaque à 96 puits dans l’adaptateur. Calibrer la position de la plaque de sorte que la gouttelette tombe dans le trou central de la plaque. Sélectionnez le mode de tri à cellule unique lors du tri, entrez le nombre cible de cellules triées sur 1 et commencez le tri.

4. Préparation de bibliothèque Smart-seq2

1. En raison de la très faible quantité d’entrées, effectuez la construction d’une bibliothèque RNA-seq de type unicellulaire dans un environnement exempt de contamination. Avant de commencer l’expérience, nettoyez le banc avec un décontaminant de surface⁸ (voir tableau des matériaux) et de l’éthanol à 75%.
2. Préparer le tampon de lyse (mélange A) (tableau 1) en combinant 0,33 μL de Triton X-100 à 10 %, 0,55 μL d’inhibiteur de la RNase et 0,22 μL de DTT 0,1 M (voir le tableau des matériaux).
3. Ajouter 1 μL de mélange A dans l’échantillon trié et broyer avec un pilon stérile. Le volume d’échantillon préférable est de ≤0,5 μL; utiliser de l’eau exempte de RNase pour porter le volume à 14 μL. Transférer chaque échantillon de cellule dans un tube PCR à paroi mince de 0,2 mL.
4. Préparer le mélange B contenant 0,44 μL d’amorce de réaction de transcription inverse (RT) oligo-dT 30 VN (100 μM) et 4,4 μL de dNTP (₁₀mM) (tableau 2) (voir le tableau des matières).
5. Ajouter 4,4 μL de mélange B aux 14 μL d’échantillon dans chaque tube, pipeter doucement pour mélanger l’échantillon et incuber l’échantillon à 72 °C pendant 3 min. Après l’incubation, mettre immédiatement les échantillons sur de la glace pour hybrider l’oligo-dT à la queue poly A.
6. Préparer le mélange réactionnel de transcription inverse (mélange C) (tableau 3) (voir tableau des matières). Ajouter 21,6 μL de mélange C à chaque tube contenant les échantillons. Activez le programme RT sur un instrument PCR commun (Tableau 4).
7. Effectuer la réaction de préamplification sur la glace. Préparer le mélange D en combinant 44 μL de 2x mélange de polymérase PCR et 0,88 μL d’amorce IS PCR (10 μM) (tableau 5) (voir le tableau des matières). Ajouter 40,8 μL de mélange D aux 40 μL de produit de réaction RT et exécuter le programme de préamplification (tableau 6).
8. Purifier les produits de réaction de préamplification à l’aide de billes Ampure XP (voir le tableau des matériaux). Ajouter 48 μL de billes (rapport 0,6:1) dans chaque échantillon de l’étape 4.7 et mélanger délicatement les échantillons par pipetage.
9. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 min. Placer les tubes de 1,5 mL contenant les échantillons sur un support de séparation magnétique pendant 5 min. Jetez soigneusement le surnageant des échantillons sans déranger les perles.
10. Lavez les billes en les remettant en suspension dans 200 μL d’éthanol à 80 % et placez les échantillons sur le support de séparation magnétique (voir le tableau des matériaux) pendant encore 3 minutes avant de jeter le surnageant contenant de l’éthanol.
11. Sécher les échantillons à l’air pendant 10 minutes et couvrir le tube pour éviter la contamination et la contamination croisée pendant le séchage à l’air.
12. Remettez les billes en suspension dans 20 μL de_ddH2O, incuber les échantillons à température ambiante pendant 5 min, puis les placer sur le support de séparation magnétique pendant 5 min.
13. Extraire à la pipette 18 μL du surnageant de chaque tube et transférer les échantillons dans de nouveaux tubes à centrifuger de 1,5 mL. Utiliser 1 μL de l’échantillon pour évaluer la qualité de l’ADNc à l’aide d’une trousse de quantification de l’ADN, déterminer la distribution granulométrique de chaque prébibliothèque à l’aide d’un analyseur de fragments (voir le tableau des matériaux) et conserver l’échantillon restant à −20 °C.
14. Construire une bibliothèque d’ADNc⁸ pour le séquençage^{Illumina 16} à partir du produit de prébibliothèque de l’étape 4.13 à l’aide d’un kit de préparation de bibliothèque de séquençage (voir Tableau des matériaux).
15. Purifiez les bibliothèques (à partir de l’étape 4.14) à l’aide des perles Ampure XP, quantifiez les bibliothèques purifiées et déterminez la distribution de taille de chaque bibliothèque à l’étape 4.13.
    REMARQUE: Pool égal nanomoles de chaque bibliothèque, en veillant à ce qu’aucune d’entre elles n’ait la même combinaison d’indice Illumina. Sinon, les bibliothèques peuvent être regroupées dans un rapport basé sur la sortie de séquençage souhaitée et séquencées ensemble sur la même voie du séquenceur Illumina. Généralement, le séquençage de chaque bibliothèque à une profondeur de 4 à 6 Go, ce qui donne > 10 millions de lectures cartographiées, fournit une couverture 20x-30x du génome d’Arabidopsis . Des profondeurs de séquençage plus faibles sont également acceptables, mais peuvent affecter la signification de l’analyse de l’expression différentielle.

5. Analyse des données RNA-seq

1. Coupez les lectures brutes à l’aide de Trim-Galore¹⁷ suivies d’une cartographie au génome de référence à l’aide de hisat2 18 (daehwankimlab.github.io/hisat2), et supprimez les fragments dupliqués par PCR à l’aide de Picard¹⁹ (broadinstitute.github.io/picard).
2. Effectuer le traitement du comptage brut et l’analyse ultérieure des gènes exprimés différentiellement (DEG) avec DESeq2²⁰ en utilisant au moins trois réplicas biologiques pour chaque échantillon. Effectuez le regroupement de l’expression génique avec le package Pheatmap et visualisez dans une carte thermique d’expression.
   NOTE: Les valeurs RPKM (lectures par kilobase par million de lectures cartographiées) des gènes et des TE (éléments transposables) ont été calculées avec Stringtie¹⁸ (github.com/gpertea/stringtie) et visualisées dans un navigateur génomique.

Résultats

Isolation du protoplaste
Ce protocole est efficace pour le tri des protoplastes des lignées marqueurs radiculaires fluorescentes d’A. thaliana. Ces lignées de marqueurs ont été développées par la fusion de protéines fluorescentes avec des gènes exprimés spécifiquement dans les types de cellules cibles, ou en utilisant des lignes de pièges amplificateurs (Figure 1). De nombreux tissus et organes ont été disséqués en types cellulaires exprimant des...

Discussion

Le protocole basé sur Smart-seq2 peut générer des bibliothèques de séquençage fiables à partir de plusieurs centaines de cellules⁸. La qualité du matériel de départ est essentielle pour la précision de l’analyse du transcriptome. FACS est un outil puissant pour préparer les cellules d’intérêt, mais cette procédure, en particulier l’étape de protomination, doit être optimisée pour les applications en usine. La microdissection par capture laser (LCM) ou les cellules disséqu?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm strainer	Sorfa	622110
Agar	Yeasen	70101ES76
Agilent fragment analyzer	Aglient	Aglient 5200
Agilent high-sensitivity DNA kit	Aglient	DNF-474-0500
Ampure XP beads	BECKMAN	A63881
Betaine	yuanye	S18046-100g
Bleach	Mr Muscle	FnBn83BK	20% (v/v) bleach
BSA	sigma	9048-46-8
CaCl2	yuanye	S24109-500g
Cellulase R10	Yakult (Japan)	9012-54-8
Cellulase RS	Yakult (Japan)	9012-54-8
Centrifuge tube (1.5 mL)	Eppendolf	30121589
DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants	Beyotime	R0127
dNTPs (10 mM)	NEB	N0447S
DTT (0.1 M)	invitrogen	18090050
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	100092680
FACS	BD FACS Melody	BD-65745
FACS	Sony	SH800S
Filter tip  (1000 µL)	Thermo Scientific	TF112-1000-Q
Filter tip  (200 µL)	Thermo Scientific	TF140-200-Q
Filter tip (10 µL)	Thermo Scientific	TF104-10-Q
Filter tip (100 µL)	Thermo Scientific	TF113-100-Q
Fluorescent microscope	Nikon	Eclipse Ni-E
Four-Dimensional Rotating Mixer	Kylin -Bell	BE-1100
Hemicellulase	sigma	9025-56-3
IS PCR primer			5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3'
KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X)	Roche	7958935001
KCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	7447-40-7
Macerozyme R10	Yakult (Japan)	9032-75-1
Magnetic separation stand	invitrogen	12321D
Mannitol	aladdin	69-65-8
MES	aladdin	145224948
MgCl2	yuanye	R21455-500ml
Microcentrifuges	Eppendorf	Centrifuge 5425
Micro-mini-centrifuge	Titan	Timi-10k
MS	Phytotech	M519
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	illumina	FC-131-1024
oligo-dT30VN primer			5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3'
PCR instrument	Thermal cycler	A24811
Pectolyase	Yakult (Japan)	9033-35-6
Plant marker lines	Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)
Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit	invitrogen	Q33231
Qubit 2.0 fluorometer	invitrogen	Q32866
RNase inhibitor	Thermo Scientific	EO0382
RNase-free water	invitrogen	10977023
Solution A			400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl
Solution B			1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 %  (w/v)hemicellulase, 0.5 %  (w/v)pectolyase and 1 %  (w/v) Macerozyme R10 in a fresh aliquot of solution A
Sterile pestle	BIOTREAT	453463
Strainer (40 µm )	Sorfa	251100
SuperScript IV reverse transcriptase (200 U/µL)	invitrogen	18090050
SuperScript IV buffer (5x)	invitrogen	18090050
Test tube (5 mL)	BD Falcon	352052
Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL)	AXYGEN	PCR-05-C
Triton X-100	Sangon Biotech	A600198-0500
TSO primer			5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3'
Vortex	Titan	VM-T2