Isolamento e Análise do Transcriptoma de Tipos Celulares Vegetais

Resumo

A viabilidade e a eficácia de métodos scRNA-seq de alto rendimento anunciam uma era de célula única na pesquisa de plantas. Apresentamos aqui um procedimento robusto e completo para o isolamento de tipos específicos de células de raízes de Arabidopsis thaliana e posterior construção e análise da biblioteca de transcriptomas.

Resumo

Em organismos multicelulares, a programação do desenvolvimento e as respostas ambientais podem ser altamente divergentes em diferentes tipos celulares ou mesmo dentro das células, o que é conhecido como heterogeneidade celular. Nos últimos anos, o isolamento de célula única e do tipo celular combinado com técnicas de sequenciamento de próxima geração (NGS) tornaram-se ferramentas importantes para o estudo de processos biológicos em resolução de célula única. No entanto, o isolamento de células vegetais é relativamente mais difícil devido à presença de paredes celulares vegetais, o que limita a aplicação de abordagens unicelulares em plantas. Este protocolo descreve um procedimento robusto para o isolamento de células únicas e do tipo celular com células vegetais baseado em classificação celular ativada por fluorescência (FACS), que é adequado para análise multi-ômica a jusante e outros estudos. Usando linhas de marcadores fluorescentes de raízes de Arabidopsis , demonstramos como tipos celulares particulares, tais como células do periciclo xilema-pólo, células iniciais da raiz lateral, células da calota lateral da raiz, células do córtex e células endodérmicas, são isolados. Além disso, um método eficaz de análise do transcriptoma a jusante usando Smart-seq2 também é fornecido. O método de isolamento celular e as técnicas de análise do transcriptoma podem ser adaptados a outros tipos celulares e espécies vegetais e têm amplo potencial de aplicação na ciência vegetal.

Introdução

As células são a unidade fundamental de todos os organismos vivos e desempenham funções estruturais e fisiológicas. Embora as células em organismos multicelulares mostrem aparente sincronicidade, células de diferentes tipos e células individuais apresentam diferenças em seus transcriptomas durante o desenvolvimento e respostas ambientais. O sequenciamento de RNA de célula única de alto rendimento (scRNA-seq) fornece um poder sem precedentes para a compreensão da heterogeneidade celular. A aplicação de scRNA-seq em ciências vegetais tem contribuído para o sucesso na construção de um atlas celular vegetal¹, tem sido usado para identificar táxons celulares raros em tecidos vegetais², tem fornecido informações sobre a composição de tipos celulares em tecidos vegetais, e tem sido usado para identificar a identidade celular e funções importantes empregadas durante o desenvolvimento e diferenciação vegetal. Além disso, é possível inferir trajetórias espaço-temporais de desenvolvimento em tecidos^{vegetais1,2,3} para descobrir novos genes^marcadores4 e estudar as funções de importantes fatores de^{transcrição5} usando scRNA-seq, a fim de revelar a conservação evolutiva de um mesmo tipo celular em diferentes^plantas3. Os estresses abióticos estão entre as influências ambientais mais importantes sobre o crescimento e desenvolvimento das plantas. Ao explorar as mudanças na composição dos tipos celulares em tecidos vegetais sob diferentes condições de tratamento por meio do sequenciamento do transcriptoma de célula única, pode-se também resolver o mecanismo de resposta abiótica ao estresse⁶.

O potencial para resolver a heterogeneidade transcricional entre tipos celulares usando o sequenciamento de scRNA depende do método de isolamento celular e da plataforma de sequenciamento. A classificação celular ativada por fluorescência (FACS) é uma técnica amplamente utilizada para isolar uma subpopulação de células para scRNA-seq com base no espalhamento de luz e nas propriedades de fluorescência das células. O desenvolvimento de linhagens de marcadores fluorescentes por tecnologia transgênica melhorou muito a eficiência do isolamento celular pelo FACS⁷. A realização de scRNA-seq usando Smart-seq2⁸ aumenta ainda mais a capacidade de dissecar a heterogeneidade celular. O método Smart-seq2 tem boa sensibilidade para detecção de genes e pode detectar genes mesmo com uma baixa entrada de transcrito⁹. Além da coleta de tipos de células em massa, os classificadores de células modernos fornecem um formato de classificação de índice de célula única, permitindo a análise do transcriptoma em resolução de célula única usando Smart-seq2¹⁰ ou outros métodos de RNA-seq multiplexados como o CEL-seq2¹¹. A classificação de célula única ou do tipo célula pode ser potencialmente usada para muitas outras aplicações a jusante, como estudos multi-ômicos paralelos^12,13. Apresenta-se aqui um protocolo robusto e versátil para o isolamento de tipos celulares vegetais, tais como células periciclo xilema-pólo, células da calota lateral radicular, células iniciais da raiz lateral, células do córtex e células endodérmicas das raízes de linhagens celulares marcadoras de Arabidopsis thaliana por FACS. O protocolo envolve ainda a construção da biblioteca Smart-seq2 para análise do transcriptoma a jusante.

Protocolo

O seguinte protocolo foi otimizado para sementes de A. thaliana wild-type (WT) sem fluorescência e linhagens fluorescentes para os seguintes tipos de células radiculares: células do periciclo xilema-pólo (J0121), células iniciais da raiz lateral, células da calota lateral (J3411), células da endoderme e do córtex (J0571) (Figura 1A). Todas as linhagens de marcadores foram obtidas de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais), exceto a linha de marcador de célula de iniciação de raiz lateral, que foi gerada pela introdução de uma construção GFP orientada por promotor GATA23 em uma planta de Arabidopsis selvagem após um relatório publicado anteriormente¹⁴.

1. Preparação do material vegetal

1. Esterilizar as sementes de A. thaliana WT e as sementes da linha de marcadores fluorescentes, incubando-as em água sanitária a 20% em estufa rotativa à temperatura ambiente por 15 min.
2. Enxaguar as sementes em água bidestilada (ddH₂O) de três a cinco vezes. Execute esta etapa em uma bancada limpa e estéril.
3. Plaquear as sementes WT e linhagem repórter em meio Murashige e Skoog (MS) de meia resistência com 0,8% de ágar (p/v)¹⁵. Cultivar as plantas verticalmente por 5 dias (16 h de luz a 23 °C) após estratificação por 2 dias a 4 °C.

2. Protoplastificação

1. Preparar as soluções de protoplastagem^2,5, referidas como Solução A e Solução B (ver Tabela de Materiais).
   1. Preparar a solução A contendo 400 mM de manitol, 0,05% de BSA, 20 mM de MES (pH 5,7), 10 mM de CaCl₂ e 20 mM de KCl (ver Tabela de Materiais). Loja Solução A a -20 °C por até 1 mês.
   2. Preparar a Solução B adicionando 1% (p/v) celulase R10, 1% (p/v) celulase RS, 1% (p/v) hemicelulase, 0,5% (p/v) pectolyase e 1% (p/v) macerozyme R10 em uma alíquota fresca da Solução A. Armazene a Solução B a -20 °C por até 1 mês.
2. Descongelar suavemente a Solução A e a Solução B no gelo antes de iniciar o experimento.
3. Corte as raízes usando uma lâmina ou tesoura limpa e pique as raízes em pedaços de ~0,5 cm. Submergir as raízes em 1,5 mL de Solução B, seguido de rotação suave (aproximadamente 18 rpm) à temperatura ambiente por 1,5-2 h.
4. Filtrar os protoplastos radiculares através da malha de filtro de 40 μm (ver Tabela de Materiais).
5. Enxaguar a malha do filtro com 1-2 mL de solução A.
6. Combinar os líquidos dos passos 2.4 e 2.5 e centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a 4 °C. Descarte o sobrenadante com uma pipeta, ressuspenda o pellet de célula em 500-600 μL de Solução A e, em seguida, coloque-o no gelo imediatamente.
7. Transfira a solução celular ressuspensa para um novo tubo de ensaio de 5 mL para triagem celular.

3. Classificação de células ativadas por fluorescência (FACS)

1. Ligue e conclua as etapas de configuração do instrumento no classificador (consulte Tabela de materiais). Selecione os canais de fluorescência, use uma planta WT (sem fluorescência) como controle para determinar a linha de base para autofluorescência e ajuste a porta de classificação com base na intensidade da fluorescência e nos singlets FSC/SSC (Figura 2).
2. Adicionar 500 μL da solução A (passo 2.1.1) num tubo de recolha de 1,5 ml para evitar que as células sejam danificadas. Coletar 2.000-3.000 células por tubo.
3. Após a triagem, colocar imediatamente as amostras no gelo, centrifugar o tubo de recolha contendo as células a 300 x g durante 5 min a 4 °C e retirar o sobrenadante com uma pipeta.
4. Pegue 2 μL de células classificadas e verifique se há fluorescência usando um microscópio de fluorescência (ver Tabela de Materiais).
5. Armazene as células classificadas a -80 °C ou use-as imediatamente para a construção da biblioteca (etapa 4).
6. Para classificação de índice de célula única, coloque a placa de 96 poços no adaptador. Calibre a posição da placa de modo que a gotícula caia no orifício central da placa. Selecione o modo de classificação de célula única ao classificar, insira o número de destino de células classificadas como 1 e inicie a classificação.

4. Preparação da biblioteca Smart-seq2

1. Como resultado da quantidade ultrabaixa de entrada, execute a construção de biblioteca RNA-seq do tipo célula única em um ambiente livre de contaminação. Antes de iniciar o experimento, limpe a bancada com um descontaminante de superfície⁸ (ver Tabela de Materiais) e etanol 75%.
2. Preparar tampão de lise (mistura A) (Tabela 1) combinando 0,33 μL de Triton X-100 a 10%, 0,55 μL de inibidor de RNase e 0,22 μL de TDT 0,1 M (ver Tabela de Materiais).
3. Adicionar 1 μL da mistura A à amostra separada e triturar com um pilão estéril. O volume de amostra preferencial é de ≤0,5 μL; usar água livre de RNase para completar o volume para 14 μL. Transfira cada amostra de célula única para um tubo de PCR de paredes finas de 0,2 mL.
4. Preparar a mistura B contendo 0,44 μL de oligo-dT₃₀VN de primer de reação de transcrição reversa (RT) (100 μM) e 4,4 μL de dNTPs (10 mM) (Tabela 2) (ver Tabela de Materiais).
5. Adicionar 4,4 μL da mistura B aos 14 μL de amostra em cada tubo, pipetar suavemente para misturar a amostra e incubar a amostra a 72 °C durante 3 min. Após a incubação, colocar imediatamente as amostras em gelo para hibridizar o oligo-dT à cauda poli A.
6. Preparar a mistura de reação de transcrição reversa (mistura C) (Tabela 3) (ver Tabela de Materiais). Adicionar 21,6 μL de mistura C a cada tubo contendo as amostras. Ligue o programa de TR em um instrumento comum de PCR (Tabela 4).
7. Realizar a reação de pré-amplificação no gelo. Preparar a mistura D combinando 44 μL de 2x mistura de polimerase por PCR e 0,88 μL de primer IS PCR (10 μM) (Tabela 5) (ver Tabela de Materiais). Adicionar 40,8 μL da mistura D aos 40 μL do produto da reação de RT e executar o programa de pré-amplificação (Tabela 6).
8. Purificar os produtos da reação de pré-amplificação usando contas Ampure XP (ver Tabela de Materiais). Adicionar 48 μL de contas (proporção 0,6:1) em cada amostra do passo 4.7 e misturar suavemente as amostras por pipetagem.
9. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 10 min. Colocar os tubos de 1,5 ml que contêm as amostras num suporte de separação magnética durante 5 minutos. Descarte cuidadosamente o sobrenadante das amostras sem perturbar as contas.
10. Lave as esferas ressuspendendo-as em 200 μL de etanol 80% e coloque as amostras no suporte de separação magnética (ver Tabela de Materiais) por mais 3 minutos antes de descartar o sobrenadante contendo etanol.
11. Seque as amostras ao ar por 10 min e cubra o tubo para evitar contaminação e contaminação cruzada durante a secagem ao ar.
12. Ressuspender as esferas em 20 μL de ddH₂O, incubar as amostras à temperatura ambiente por 5 min e, em seguida, colocá-las no suporte de separação magnética por 5 min.
13. Pipetar 18 μL do sobrenadante de cada tubo e transferir as amostras para novos tubos centrífugos de 1,5 mL. Use 1 μL da amostra para avaliar a qualidade do cDNA usando um kit de quantificação de DNA, determine a distribuição de tamanho de cada pré-biblioteca usando um analisador de fragmentos (ver Tabela de Materiais) e armazene a amostra restante a -20 °C.
14. Construa uma biblioteca de cDNA⁸ para o sequenciamento Illumina 16 a partir do produto da pré-biblioteca da etapa^4.13 usando um kit de preparação de biblioteca de sequenciamento (consulte Tabela de Materiais).
15. Purifice as bibliotecas (a partir da etapa 4.14) usando as contas Ampure XP, quantifique as bibliotecas purificadas e determine a distribuição de tamanho de cada biblioteca seguindo a etapa 4.13.
    NOTA: Agrupe nanomoles iguais de cada biblioteca, garantindo que nenhum deles tenha a mesma combinação de índice Illumina. Caso contrário, as bibliotecas podem ser agrupadas em uma proporção com base na saída de sequenciamento desejada e sequenciadas juntas na mesma faixa do sequenciador Illumina. Geralmente, o sequenciamento de cada biblioteca a uma profundidade de 4-6 GB, o que produz > 10 milhões de leituras mapeadas, fornece cobertura de 20x-30x do genoma de Arabidopsis . Profundidades de sequenciamento mais baixas também são aceitáveis, mas podem afetar a importância da análise de expressão diferencial.

5. Análise dos dados de RNA-seq

1. Corte as leituras brutas usando Trim-Galore¹⁷ seguido de mapeamento para o genoma de referência usando hisat2 18 (daehwankimlab.github.io/hisat2), e remova os fragmentos duplicados de PCR usando Picard¹⁹ (broadinstitute.github.io/picard).
2. Realizar o processamento da contagem bruta e posterior análise dos genes diferencialmente expressos (DEG) com DESeq2²⁰ utilizando pelo menos três réplicas biológicas para cada amostra. Realizar agrupamento da expressão gênica com o pacote Pheatmap, e visualizar em um heatmap de expressão.
   NOTA: Os valores de RPKM (leituras por quilobase por milhão de leituras mapeadas) dos genes e dos TEs (elementos transponíveis) foram calculados com Stringtie¹⁸ (github.com/gpertea/stringtie) e visualizados em um navegador de genoma.

Resultados

Isolamento de protoplastos
Este protocolo é eficaz para a classificação de protoplastos de linhagens fluorescentes de marcadores radiculares de A. thaliana. Essas linhagens de marcadores foram desenvolvidas pela fusão de proteínas fluorescentes com genes expressos especificamente em tipos celulares alvo, ou usando linhagens de armadilhas intensificadoras (Figura 1). Numerosos tecidos e órgãos foram dissecados em tipos celulares expressando marcadores fluor...

Discussão

O protocolo baseado em Smart-seq2 pode gerar bibliotecas de sequenciamento confiáveis a partir de várias centenas de células⁸. A qualidade do material de partida é essencial para a precisão da análise do transcriptoma. O FACS é uma ferramenta poderosa para o preparo de células de interesse, mas este procedimento, especialmente a etapa de protoplast, deve ser otimizado para aplicações em plantas. Microdissecção por captura a laser (LCM) ou células dissecadas manualmente também podem s...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm strainer	Sorfa	622110
Agar	Yeasen	70101ES76
Agilent fragment analyzer	Aglient	Aglient 5200
Agilent high-sensitivity DNA kit	Aglient	DNF-474-0500
Ampure XP beads	BECKMAN	A63881
Betaine	yuanye	S18046-100g
Bleach	Mr Muscle	FnBn83BK	20% (v/v) bleach
BSA	sigma	9048-46-8
CaCl2	yuanye	S24109-500g
Cellulase R10	Yakult (Japan)	9012-54-8
Cellulase RS	Yakult (Japan)	9012-54-8
Centrifuge tube (1.5 mL)	Eppendolf	30121589
DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants	Beyotime	R0127
dNTPs (10 mM)	NEB	N0447S
DTT (0.1 M)	invitrogen	18090050
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	100092680
FACS	BD FACS Melody	BD-65745
FACS	Sony	SH800S
Filter tip  (1000 µL)	Thermo Scientific	TF112-1000-Q
Filter tip  (200 µL)	Thermo Scientific	TF140-200-Q
Filter tip (10 µL)	Thermo Scientific	TF104-10-Q
Filter tip (100 µL)	Thermo Scientific	TF113-100-Q
Fluorescent microscope	Nikon	Eclipse Ni-E
Four-Dimensional Rotating Mixer	Kylin -Bell	BE-1100
Hemicellulase	sigma	9025-56-3
IS PCR primer			5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3'
KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X)	Roche	7958935001
KCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	7447-40-7
Macerozyme R10	Yakult (Japan)	9032-75-1
Magnetic separation stand	invitrogen	12321D
Mannitol	aladdin	69-65-8
MES	aladdin	145224948
MgCl2	yuanye	R21455-500ml
Microcentrifuges	Eppendorf	Centrifuge 5425
Micro-mini-centrifuge	Titan	Timi-10k
MS	Phytotech	M519
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	illumina	FC-131-1024
oligo-dT30VN primer			5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3'
PCR instrument	Thermal cycler	A24811
Pectolyase	Yakult (Japan)	9033-35-6
Plant marker lines	Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)
Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit	invitrogen	Q33231
Qubit 2.0 fluorometer	invitrogen	Q32866
RNase inhibitor	Thermo Scientific	EO0382
RNase-free water	invitrogen	10977023
Solution A			400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl
Solution B			1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 %  (w/v)hemicellulase, 0.5 %  (w/v)pectolyase and 1 %  (w/v) Macerozyme R10 in a fresh aliquot of solution A
Sterile pestle	BIOTREAT	453463
Strainer (40 µm )	Sorfa	251100
SuperScript IV reverse transcriptase (200 U/µL)	invitrogen	18090050
SuperScript IV buffer (5x)	invitrogen	18090050
Test tube (5 mL)	BD Falcon	352052
Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL)	AXYGEN	PCR-05-C
Triton X-100	Sangon Biotech	A600198-0500
TSO primer			5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3'
Vortex	Titan	VM-T2