JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الأوعية الدموية في شبكية الفأر مثيرة للاهتمام بشكل خاص في فهم آليات تشكيل نمط الأوعية الدموية. يقيس هذا البروتوكول تلقائيا قطر أوعية شبكية الفأر من صور قاع تصوير الأوعية الفلورية على مسافة ثابتة من القرص البصري.

Abstract

من المهم دراسة تطور الأوعية الدموية في شبكية العين في اعتلال الشبكية حيث يمكن أن يؤدي نمو الأوعية الدموية غير الطبيعي في النهاية إلى فقدان البصر. تظهر الطفرات في جين عامل النسخ المرتبط ب microphthalmia (Mitf) نقص التصبغ ، و microphthalmia ، وتنكس الشبكية ، وفي بعض الحالات ، العمى. يعد التصوير في الجسم الحي لشبكية العين بوسائل غير جراحية أمرا حيويا لأبحاث العين. ومع ذلك ، نظرا لصغر حجمه ، فإن تصوير قاع الفئران صعب وقد يتطلب أدوات متخصصة وصيانة وتدريبا. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير برنامج فريد يتيح تحليل قطر الأوعية الشبكية في الفئران باستخدام برنامج آلي مكتوب في MATLAB. تم الحصول على صور قاع العين باستخدام نظام كاميرا قاع العين التجاري بعد الحقن داخل الصفاق لمحلول ملح الفلوريسين. تم تغيير الصور لتحسين التباين ، وسمح برنامج MATLAB باستخراج متوسط قطر الأوعية الدموية تلقائيا على مسافة محددة مسبقا من القرص البصري. تم فحص التغيرات الوعائية في الفئران البرية والفئران مع طفرات مختلفة في جين Mitf من خلال تحليل قطر وعاء الشبكية. برنامج MATLAB المكتوب خصيصا والذي تم تطويره هنا عملي وسهل الاستخدام ، ويسمح للباحثين بتحليل متوسط القطر ومتوسط القطر الإجمالي ، بالإضافة إلى عدد الأوعية من الأوعية الدموية في شبكية الفأر ، بشكل مريح وموثوق.

Introduction

ربما يكون السرير الوعائي الأكثر بحثا في الجسم هو الأوعية الدموية في شبكية العين. مع التطور التقني المتطور باستمرار ، يتم تصوير الأوعية الدموية في شبكية العين بسهولة في المرضى الأحياء واستخدامها في العديد من مجالات البحث1. بالإضافة إلى ذلك ، أثبتت الأوعية الدموية في شبكية الفأر أثناء التطور أنها نظام نموذجي فعال للغاية للبحث في البيولوجيا الأساسية لنمو الأوعية الدموية. الغرض الأساسي من الأوعية الدموية في شبكية العين هو تزويد الجزء الداخلي من شبكية العين بدعم التمثيل الغذائي من خلال شبكة شعرية صفائحية تتخلل الأنسجة العصبية2. ومع ذلك ، فإن حالة شبكية العين ، وبالتالي أي خلل وظيفي أو ضمور ، يمكن أن يكون لها آثار كبيرة على كل من تشعب الأوعية الدموية في شبكية العين وقطر الشرايين ، مما يدل على تفاعل بين خلايا الشبكية والأوعية الدموية 3,4. من المعروف أن العديد من أمراض العين ، بما في ذلك اعتلال الشبكية الخداجي (ROP) ، واعتلال الشبكية السكري (DR) ، والتنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ، والزرق ، والأوعية الدموية الجديدة للقرنية ، يمكن أن تؤدي إلى تكوين الأوعية الدموية العينية غير الطبيعية5. في حالة الأوعية الدموية في شبكية العين ، غالبا ما تظهر نماذج الفئران من تنكس الشبكية تغييرات مماثلة لتلك التي تظهر في أمراض الأوعية الدموية البشرية 6,7. تتضمن عائلة Myc supergene لعوامل النسخ الحلزونية الحلزونية الأساسية عامل النسخ المرتبط ب microphthalmia (Mitf) المعبر عنه في ظهارة صبغة الشبكية (RPE) 8،9،10.

ثبت أن العديد من الأعضاء ، بما في ذلك العين والأذن والجهاز المناعي والجهاز العصبي المركزي والكلى والعظام والجلد ، يتم تنظيمها بواسطة Mitf9،11،12،13. لقد اكتشفنا أن بنية ووظيفة RPE تتأثر في الفئران التي تحمل طفرات مختلفة في جين Mitf ، مما يؤدي إلى بعض حالات تنكس الشبكية ، وفي النهاية فقدان البصر10. في الآونة الأخيرة ، تبين أن عدد الأوعية وقطر السفينة يختلف اختلافا كبيرا بين متحولة Mitf والفئران البرية14. يمكن للباحثين والأطباء الآن تحديد كمية الأوعية الدموية في الشبكية بدقة في الجسم الحي بسبب تطورات تصوير الشبكية. منذ أواخر القرن الثامن عشر ، استفاد الباحثون والأطباء من فائدة تصور الأوعية الدموية في شبكية العين ، وأظهر تصوير الأوعية بالفلوريسئين (FA) كلا من تدفق الدم في شبكية العين وتدهور حاجز الدموالشبكية 15.

توضح هذه المقالة كيفية تحليل قطر وعاء الشبكية من صور FA للماوس باستخدام رمز مكتوب خصيصا في برنامج MATLAB.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل هيئة الأغذية والطب البيطري الأيسلندية (ترخيص MAST رقم 2108002). أجريت جميع الدراسات على وفقا لبيان جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون (ARVO) لاستخدام في أبحاث العيون والرؤية. تم استخدام ذكور وإناث C57BL / 6J و Mitfmi-vga9 / + الفئران في هذه الدراسة. تم استخدام الفئران C57BL / 6J (n = 7) كعنصر تحكم. تم الحصول على الأنواع البرية تجاريا (انظر جدول المواد) ، ولكن تم تربية جميع الفئران الطافرة (ن = 7) وتربيتها في مرافق في المركز الطبي الحيوي بجامعة أيسلندا. في هذه الدراسة ، تم استخدام عمرها 3 أشهر. ومع ذلك ، ينطبق البروتوكول حتى على 1 شهر الأكبر سنا.

1. التحضير التجريبي

  1. تحضير خليط التخدير. خذ أمبولة واحدة من محلول مخزون الكيتامين سعة 2 مل (25 مجم / مل) ومحلول مخزون زيلازين 250 ميكرولتر (2٪) لتحضير محلول عملي من خليط الكيتامين / الزيلازين (25 مجم / مل من الكيتامين و 20 مجم / مل من الزيلازين) (انظر جدول المواد).
  2. تخدير الفأر بحقن داخل الصفاق لخليط الكيتامين / الزيلازين ، بحجم سائل يبلغ أربعة أضعاف وزن جسم الفأر ؛ على سبيل المثال ، يحتاج وزن الفأر 20 جم إلى 35 ميكرولتر من محلول عمل زيلازين / كيتامين للحصول على جرعة عملية من زيلازين (4 مغ / كغ من وزن الجسم) وخليط الكيتامين (40 مغ / كغ من وزن الجسم).
  3. قم بتوسيع حدقة العين بقطرة عين 10٪ فينيليفرين هيدروكلوريد و 1٪ تروبيكاميد مباشرة بعد التخدير.
  4. انتظر حتى يتم تخدير بالكامل ويتم توسيع تلاميذه على نطاق واسع.
  5. تحضير محلول ملح الفلوريسين. أضف 9 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ؛ 1x) إلى 1 مل من محلول الفلوريسئين (تركيز مخزون 100 مجم / مل) (انظر جدول المواد). محلول عمل التركيز النهائي هو 10 مجم / مل.

2. التصوير في الجسم الحي للأوعية الدموية في شبكية العين باستخدام نظام تصوير الشبكية للقوارض

  1. تطبيق محلول عمل الفلوريسئين داخل الصفاق (5 ميكرولتر/غرام من وزن الجسم) للحيوان المخدر.
  2. ضع قطرة من 2٪ هلام ميثيل سلولوز على سطح القرنية ثم ضع في مرحلة تحديد المواقع في نظام التصوير (انظر جدول المواد).
  3. ضع عدسة كاميرا تصوير قاع الشبكية للمس قرنية الفأر مباشرة وبرفق. لوضع رأس العصب البصري في منتصف المجال البصري ، اضبط المحاذاة قليلا.
  4. قم بالتبديل إلى قناة الفلورسنت الخضراء على كاميرا قاع العين.
  5. ركز على أوعية الشبكية لالتقاط الصور.
  6. للعثور على النقطة الزمنية المثالية ، التقط عددا من الصور في 1 و 3 و 5 و 10 دقائق (ولكن ليس أكثر من 10 دقائق) بعد حقن الفلوريسين.
    ملاحظة: يجب إكمال معالجة FA في غضون 10 دقائق ، حيث قد يصبح الفلوريسئين منتشرا جدا بعد ذلك الوقت ، وتصبح الأوعية غير قابلة للكشف.
  7. عند الانتهاء من التصوير ، بينما لا يزال الفأر مخدرا ، قم بالقتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم.

3. تحليل قطر الوعاء الشبكي

  1. افتح برنامج MATLAB (انظر جدول المواد).
  2. قم بتنزيل وحفظ رمز "fundusDiameter.m" (انظر ملف الترميز التكميلي 1 وملف الترميز التكميلي 2 وملف الترميز التكميلي 3).
  3. افتح المجلد حيث تم حفظ الرمز. اسحب الرمز وأفلته فوق المجلد الحالي في MATLAB.
  4. قم بسحب وإسقاط صورة FFA (صورة تصوير الأوعية الفلورية قاع العين) أو الصور التي يرغب المرء في تحليلها عبر المجلد الحالي في MATLAB.
  5. اضغط على الأداة "تشغيل " من شريط أدوات MATLAB.
  6. ستظهر نافذة منبثقة. اكتب اسم ملف الصورة المهمة في المربع أدخل اسم الملف واضغط على موافق.
    ملاحظة: لا تقم بتغيير أو تعديل بقية المعلمات.
  7. حدد مركز القرص البصري، ثم حدد حافة القرص البصري. يحسب البرنامج الآن شدة وحدات البكسل في صور قاع الماوس في دائرة نصف قطرها ضعف نصف قطر القرص البصري ، في اتجاه عقارب الساعة من مركز القرص البصري (الشكل 1).
  8. بعد ذلك ، تأكد من أن البرنامج يرسم متوسط قطر الوعاء (بالبكسل) لكل وعاء في قاع العين كدالة لرقم الوعاء (الشكل 2).
  9. بعد ذلك ، تأكد من أن البرنامج ينقل بيانات القياس لكل سفينة إلى مستند Excel ، حيث يتم حساب المتوسط والوسيط والانحراف المعياري لهذه القيم (الجدول 1 والجدول 2).
  10. انقل القيم من جدول النتائج إلى برنامج جدول بيانات عن طريق تحديد جميع القيم في الجدول. الصق القيم في جدول البيانات.
  11. ارسم الرسوم البيانية وقم بإجراء التحليل الإحصائي باستخدام البيانات التي تم لصقها في برنامج جدول بيانات من اختيارك (انظر جدول المواد).

النتائج

يوضح الشكل 1 العملية المستخدمة لتحليل الأوعية الدموية في شبكية العين ، والتي يتم تطبيقها على صور FFA للفأر من جميع الفئران المختبرة. يستخدم نصف قطر أكبر مرتين من القرص البصري لقياس شدة وحدات البكسل في اتجاه دائري في اتجاه عقارب الساعة من مركز القرص البصري. يقوم بتمييز وحدات ?...

Discussion

هذه المقالة هي الأولى التي تقدم طريقة لتحليل قطر الأوعية الدموية في شبكية العين والأوعية الدموية في شبكية العين من صور FA للفأر. نظرا لأنه تم استخدام تصوير قاع العين فقط لالتقاط صور للأوعية الدموية في شبكية العين ، فإن الطريقة لها العديد من العيوب ، أحدها أنه لا يمكن للمرء إلا أن يستنتج الت?...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنه لا توجد مصالح متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منحة زمالة ما بعد الدكتوراه من صندوق البحوث الأيسلندي (217796-052) (AGL) وصندوق Helga Jónsdóttir و Sigurlidi Kristjánsson التذكاري (A.G.L و T.E.). يشكر المؤلفون البروفيسور إيريكور شتاينغريمسون على توفير الفئران.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1% Tropicamide (Mydriacyl)Alcon Inc LaboratoriesMydriatic agent
2% MethocelOmniVision Eye CareHydroxypropryl methylcellulose gel
C57BL/6JJackson Laboratory000664Wild type mice
Excel for Microsoft 365Microsoft IncSoftware package
Fluorescein sodium saltSigma-Aldrich28803-100GFluorescent angiography
Matlab 8.0The MathWorks, Inc.Software package
Micron IV rodent fundus cameraPhoenix-Micron40-2200Fundus photography
Phenylephrine 10% w/vBausch & LombMydriatic agent
Phosphate Buffered Saline - 100 tabletsGibco18912-014Dilution
Sigmaplot 13Jandel Scientific SoftwareSoftware package
S-Ketamine, 25 mg/mLPfizer Inc.PAA104470Anesthesia IP

References

  1. Cheung, C. Y., Ikram, M. K., Chen, C., Wong, T. Y. Imaging retina to study dementia and stroke. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 89-107 (2017).
  2. Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
  3. Ma, Y., et al. Quantitative analysis of retinal vessel attenuation in eyes with retinitis pigmentosa. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 4306-4314 (2012).
  4. Eysteinsson, T., Hardarson, S. H., Bragason, D., Stefansson, E. Retinal vessel oxygen saturation and vessel diameter in retinitis pigmentosa. Acta Ophthalmologica. 92 (5), 449-453 (2014).
  5. Al-Latayfeh, M., Silva, P. S., Sun, J. K., Aiello, L. P. Antiangiogenic therapy for ischemic retinopathies. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (6), 006411 (2012).
  6. Wang, S., Villegas-Perez, M. P., Vidal-Sanz, M., Lund, R. D. Progressive optic axon dystrophy and vacuslar changes in rd mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (2), 537-545 (2000).
  7. Liu, H., et al. Photoreceptor cells influence retinal vascular degeneration in mouse models of retinal degeneration and diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4272-4281 (2016).
  8. Steingrimsson, E., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. Melanocytes and the microphthalmia transcription factor network. Annual Review of Genetics. 38, 365-411 (2004).
  9. Arnheiter, H. The discovery of the microphthalmia locus and its gene. Mitf. Pigment Cell & Melanoma Research. 23 (6), 729-735 (2010).
  10. Garcia-Llorca, A., Aspelund, S. G., Ogmundsdottir, M. H., Steingrimsson, E., Eysteinsson, T. The microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) gene and its role in regulating eye function. Scientific Reports. 9 (1), 15386 (2019).
  11. Bharti, K., Liu, W., Csermely, T., Bertuzzi, S., Arnheiter, H. Alternative promoter use in eye development: the complex role and regulation of the transcription factor MITF. Development. 135 (6), 1169-1178 (2008).
  12. Lu, S. Y., Li, M., Lin, Y. L. Mitf induction by RANKL is critical for osteoclastogenesis. Molecular Biology of the Cell. 21 (10), 1763-1771 (2010).
  13. Pillaiyar, T., Manickam, M., Jung, S. H. Recent development of signaling pathways inhibitors of melanogenesis. Cellular Signalling. 40, 99-115 (2017).
  14. Danielsson, S. B., Garcia-Llorca, A., Reynisson, H., Eysteinsson, T. Mouse microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) mutations affect the structure of the retinal vasculature. Acta Ophthalmologica. 100 (8), 911-918 (2022).
  15. Burns, S. A., Elsner, A. E., Gast, T. J. Imaging the retinal vasculature. Annual Review of Vision Science. 7, 129-153 (2021).
  16. Wei, W., et al. Automated vessel diameter quantification and vessel tracing for OCT angiography. Journal of Biophotonics. 13 (12), e202000248 (2020).
  17. Salas, M., et al. Compact akinetic swept source optical coherence tomography angiography at 1060 nm supporting a wide field of view and adaptive optics imaging modes of the posterior eye. Biomedical Optics Express. 9 (4), 1871-1892 (2018).
  18. Albanna, W., et al. Non-invasive evaluation of neurovascular coupling in the murine retina by dynamic retinal vessel analysis. PLoS One. 13 (10), e0204689 (2018).
  19. Moult, E. M., et al. Evaluating anesthetic protocols for functional blood flow imaging in the rat eye. Journal of Biomedical Optics. 22 (1), 16005 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

MATLAB

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved