Medindo o diâmetro do vaso retiniano a partir de imagens de angiografia fluorescente de camundongo

Resumo

A vasculatura da retina de camundongos é particularmente interessante na compreensão dos mecanismos de formação do padrão vascular. Este protocolo mede automaticamente o diâmetro dos vasos retinianos de camundongos a partir de imagens de fundo de angiografia fluorescente a uma distância fixa do disco óptico.

Resumo

É importante estudar o desenvolvimento da vasculatura retiniana em retinopatias nas quais o crescimento anormal dos vasos pode levar à perda da visão. Mutações no gene do fator de transcrição associado à microftalmia (Mitf) mostram hipopigmentação, microftalmia, degeneração da retina e, em alguns casos, cegueira. A imagem in vivo da retina do camundongo por meios não invasivos é vital para a pesquisa ocular. No entanto, devido ao seu pequeno tamanho, a imagem do fundo do olho do camundongo é difícil e pode exigir ferramentas especializadas, manutenção e treinamento. Neste estudo, desenvolvemos um software exclusivo que permite a análise do diâmetro dos vasos retinianos em camundongos com um programa automatizado escrito em MATLAB. As fotografias de fundo de olho foram obtidas com um sistema comercial de câmera de fundo de olho após uma injeção intraperitoneal de uma solução de sal de fluoresceína. As imagens foram alteradas para aumentar o contraste, e o programa MATLAB permitiu extrair o diâmetro vascular médio automaticamente a uma distância pré-definida do disco óptico. As alterações vasculares foram examinadas em camundongos do tipo selvagem e camundongos com várias mutações no gene Mtf , analisando o diâmetro do vaso retiniano. O programa MATLAB personalizado desenvolvido aqui é prático, fácil de usar e permite que os pesquisadores analisem o diâmetro médio e o diâmetro total médio, bem como o número de vasos da vasculatura da retina do camundongo, de forma conveniente e confiável.

Introdução

Possivelmente, o leito vascular mais pesquisado no corpo é a vasculatura retiniana. Com sofisticação técnica cada vez melhor, a vasculatura retiniana é facilmente fotografada em pacientes vivos e usada em muitos campos de pesquisa¹. Além disso, a vasculatura da retina do camundongo durante o desenvolvimento provou ser um sistema modelo muito eficaz para pesquisas sobre a biologia fundamental do crescimento vascular. O objetivo principal da vasculatura retiniana é fornecer suporte metabólico à porção interna da retina por meio de uma malha capilar laminar que permeia o tecido neural². No entanto, a condição da retina e, conseqüentemente, qualquer disfunção ou atrofia, pode ter efeitos significativos tanto nas bifurcações da vasculatura retiniana quanto no diâmetro das artérias, demonstrando uma interação entre as células da retina e a vasculatura ^3,4. Sabe-se que inúmeras doenças oculares, incluindo retinopatia da prematuridade (ROP), retinopatia diabética (RD), degeneração macular relacionada à idade (DMRI), glaucoma e neovascularização da córnea, podem resultar em angiogênese ocular anormal⁵. No caso da vasculatura retiniana, os modelos de camundongos com degeneração retiniana geralmente exibem alterações comparáveis às observadas nas doenças vasculares humanas ^6,7. A família de supergenes Myc de fatores de transcrição fundamentais hélice-alça-hélice-zíper inclui o gene do fator de transcrição associado à microftalmia (Mitf) expresso no epitélio pigmentar da retina (EPR) ^{8 , 9 , 10} .

Numerosos órgãos, incluindo olho, ouvido, sistema imunológico, sistema nervoso central, rim, osso e pele, demonstraram ser regulados pelo Mitf 9,11,12,13. Descobrimos que a estrutura e a função do EPR são afetadas em camundongos portadores de várias mutações no gene Mitf, resultando em alguns casos de degeneração da retina e, em última análise, perda de visão¹⁰. Recentemente, foi demonstrado que o número de vasos e o diâmetro dos vasos diferem significativamente entre camundongos mutantes Mitf e do tipo selvagem¹⁴. Pesquisadores e médicos agora podem quantificar com precisão a vasculatura da retina in vivo devido aos desenvolvimentos da imagem da retina. Desde 1800, pesquisadores e médicos têm aproveitado o benefício de visualizar a vasculatura retiniana, e a angiografia fluoresceínica (AF) mostrou tanto o fluxo sanguíneo retiniano quanto a degradação da barreira hemato-retiniana¹⁵.

Este artigo demonstra como analisar o diâmetro do vaso retiniano a partir de imagens de FA de camundongos com um código escrito sob medida no software MATLAB.

Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pela Autoridade Alimentar e Veterinária da Islândia (licença MAST nº 2108002). Todos os estudos em animais foram conduzidos de acordo com a Declaração da Associação para Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e Visual. Camundongos C57BL/6J machos e fêmeas e Mitf^mi-vga9/+ foram utilizados neste estudo. Camundongos C57BL/6J (n = 7) foram usados como controle. Os tipos selvagens foram obtidos comercialmente (ver Tabela de Materiais), mas todos os camundongos mutantes (n = 7) foram criados e criados em instalações para animais no Centro Biomédico da Universidade da Islândia. No presente estudo, foram utilizados animais com 3 meses de idade; no entanto, o protocolo se aplica mesmo a animais de 1 mês ou mais.

1. Preparação experimental

1. Prepare a mistura anestésica. Tome uma ampola de uma solução estoque de cetamina de 2 mL (25 mg / mL) e 250 μL de solução estoque de xilazina (2%) para preparar uma solução de trabalho de mistura de cetamina / xilazina (25 mg / mL de cetamina e 20 mg / mL de xilazina) (ver Tabela de Materiais).
2. Anestesie o camundongo com uma injeção intraperitoneal da mistura de cetamina / xilazina, com um volume de fluido quatro vezes o peso corporal do camundongo; por exemplo, um camundongo com 20 g de peso precisa de 35 μL de solução de trabalho de xilazina / cetamina para obter uma dose de trabalho de xilazina (4 mg / kg de peso corporal) e cetamina (40 mg / kg de peso corporal).
3. Dilate as pupilas com um colírio de cloridrato de fenilefrina a 10% e tropicamida a 1% imediatamente após a anestesia.
4. Espere até que o animal esteja totalmente anestesiado e suas pupilas estejam amplamente dilatadas.
5. Prepare a solução salina de fluoresceína. Adicione 9 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS; 1x) a 1 mL de solução de fluoresceína (concentração estoque de 100 mg / mL) (consulte a Tabela de Materiais). A solução de trabalho de concentração final é de 10 mg/mL.

2. Imagem in vivo da vasculatura retiniana usando um sistema de imagem de retina de roedores

1. Administrar a solução de trabalho de fluoresceína por via intraperitoneal (5 μL/g de peso corporal) ao animal anestesiado.
2. Aplique uma gota de gel de metilcelulose a 2% na superfície da córnea e, em seguida, coloque o animal no estágio de posicionamento do sistema de imagem (consulte a Tabela de Materiais).
3. Posicione a lente da câmera de fundo de olho de imagem da retina para tocar a córnea do mouse direta e suavemente. Para colocar a cabeça do nervo óptico no meio do campo visual, ajuste levemente o alinhamento.
4. Mude para o canal fluorescente verde na câmera de fundo de olho.
5. Concentre-se nos vasos da retina para tirar imagens.
6. Para encontrar o ponto de tempo ideal, tire várias fotos em 1, 3, 5 e 10 min (mas não mais do que 10 min) após a injeção de fluoresceína.
   NOTA: O tratamento com ácido sulfúrico deve ser concluído em 10 minutos, pois após esse tempo a fluoresceína pode se tornar muito difusa e os vasos se tornarem indetectáveis.
7. Após a conclusão da imagem, enquanto o camundongo ainda está anestesiado, eutanasia-o por luxação cervical.

3. Análise do diâmetro do vaso retiniano

1. Abra o programa MATLAB (consulte Tabela de Materiais).
2. Baixe e salve o código "fundusDiameter.m" (consulte Arquivo de Codificação Suplementar 1, Arquivo de Codificação Suplementar 2 e Arquivo de Codificação Suplementar 3).
3. Abra a pasta onde o código foi salvo. Arraste o código e solte-o sobre a pasta atual no MATLAB.
4. Arraste e solte a imagem FFA (imagem de angiografia de fluorescência do fundo de olho) ou imagens que se deseja analisar na pasta atual no MATLAB.
5. Pressione a ferramenta Executar na barra de ferramentas do MATLAB.
6. Uma janela pop-up aparecerá. Escreva o nome do arquivo da imagem de interesse na caixa Digite o nome do arquivo e pressione OK.
   NOTA: Não altere ou modifique o restante dos parâmetros.
7. Selecione o centro do disco óptico e, em seguida, selecione a borda do disco óptico. O software agora calcula a intensidade dos pixels nas imagens do fundo do mouse em um círculo com um raio que é o dobro do disco óptico, no sentido horário a partir do centro do disco óptico (Figura 1).
8. Em seguida, certifique-se de que o software plote o diâmetro médio do vaso (em pixels) de cada vaso no fundo como uma função do número do vaso (Figura 2).
9. Em seguida, certifique-se de que o software transfira os dados de medição de cada embarcação para um documento Excel, onde a média, a mediana e o desvio padrão desses valores são calculados (Tabela 1 e Tabela 2).
10. Mova os valores da tabela de resultados para um programa de planilha selecionando todos os valores na tabela. Cole os valores na planilha.
11. Plote os gráficos e execute análises estatísticas usando os dados colados em um programa de planilha de sua escolha (consulte Tabela de Materiais).

Resultados

A Figura 1 mostra o processo utilizado para analisar a vasculatura retiniana, que é aplicado às imagens FFA de camundongos de todos os camundongos testados. Um raio duas vezes maior que o disco óptico é usado para medir a intensidade dos pixels em uma direção circular no sentido horário a partir do centro do disco óptico. Ele marca pixels com um ponto inicial ou final quando se depara com pontos acima e abaixo de um limite especificado pelo usuário, respectivamente. Isso é repetido...

Discussão

O presente artigo é o primeiro a apresentar um método para analisar o diâmetro dos vasos retinianos e a vasculatura retiniana a partir de imagens de AF de camundongos. Como apenas a imagem do fundo de olho foi utilizada para capturar imagens da vasculatura retiniana, o método apresenta várias desvantagens, uma das quais é que só se pode inferir alterações nas camadas superficiais da vasculatura retiniana nos camundongos examinados neste estudo; Quaisquer diferenças nas camadas mais profundas ainda são desconhe...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Tropicamide (Mydriacyl)	Alcon Inc Laboratories		Mydriatic agent
2% Methocel	OmniVision Eye Care		Hydroxypropryl methylcellulose gel
C57BL/6J	Jackson Laboratory	000664	Wild type mice
Excel for Microsoft 365	Microsoft Inc		Software package
Fluorescein sodium salt	Sigma-Aldrich	28803-100G	Fluorescent angiography
Matlab 8.0	The MathWorks, Inc.		Software package
Micron IV rodent fundus camera	Phoenix-Micron	40-2200	Fundus photography
Phenylephrine 10% w/v	Bausch & Lomb		Mydriatic agent
Phosphate Buffered Saline - 100 tablets	Gibco	18912-014	Dilution
Sigmaplot 13	Jandel Scientific Software		Software package
S-Ketamine, 25 mg/mL	Pfizer Inc.	PAA104470	Anesthesia IP