JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Fare retinal damar sistemi, vasküler patern oluşumunun mekanizmalarını anlamada özellikle ilgi çekicidir. Bu protokol, optik diskten sabit bir mesafede floresan anjiyografi fundus görüntülerinden fare retina damarlarının çapını otomatik olarak ölçer.

Özet

Anormal damar büyümesinin sonuçta görme kaybına yol açabileceği retinopatilerde retinal vaskülatür gelişimini incelemek önemlidir. Mikroftalmi ile ilişkili transkripsiyon faktörü (Mitf) genindeki mutasyonlar hipopigmentasyon, mikroftalmi, retina dejenerasyonu ve bazı durumlarda körlüğü gösterir. Fare retinasının noninvaziv yollarla in vivo görüntülenmesi göz araştırmaları için hayati önem taşır. Bununla birlikte, küçük boyutu göz önüne alındığında, fare fundus görüntülemesi zordur ve özel araçlar, bakım ve eğitim gerektirebilir. Bu çalışmada, MATLAB ile yazılmış otomatik bir program ile farelerde retina damar çapının analiz edilmesini sağlayan benzersiz bir yazılım geliştirdik. Fundus fotoğrafları, floresein tuzu solüsyonunun intraperitoneal enjeksiyonunu takiben ticari bir fundus kamera sistemi ile elde edildi. Kontrastı artırmak için görüntüler değiştirildi ve MATLAB programı, ortalama vasküler çapın optik diskten önceden tanımlanmış bir mesafede otomatik olarak çıkarılmasına izin verdi. Yabani tip farelerde ve Mitf geninde çeşitli mutasyonlara sahip farelerde retina damar çapı analiz edilerek vasküler değişiklikler incelendi. Burada geliştirilen özel olarak yazılmış MATLAB programı pratiktir, kullanımı kolaydır ve araştırmacıların ortalama çapı ve ortalama toplam çapı ve ayrıca fare retinal damar sisteminden gelen damar sayısını rahat ve güvenilir bir şekilde analiz etmelerini sağlar.

Giriş

Muhtemelen vücutta en çok araştırılan damar yatağı retina damar sistemidir. Giderek gelişen teknik gelişmişlik ile retina damar sistemi, yaşayan hastalarda kolayca fotoğraflanmakta ve birçok araştırma alanında kullanılmaktadır1. Ek olarak, gelişim sırasında fare retinal damar sisteminin, vasküler büyümenin temel biyolojisine yönelik araştırmalar için çok etkili bir model sistem olduğu kanıtlanmıştır. Retina damar sisteminin birincil amacı, nöral dokuya nüfuz eden laminer bir kılcal ağ örgüsü yoluyla retinanın iç kısmına metabolik destek sağlamaktır2. Bununla birlikte, retinanın durumu ve sonuç olarak herhangi bir işlev bozukluğu veya atrofi, hem retina damar sisteminin çatallanması hem de arterlerin çapı üzerinde önemli etkilere sahip olabilir ve bu da retina hücreleri ile damar sistemi arasında bir etkileşim olduğunu gösterir 3,4. Prematüre retinopatisi (ROP), diyabetik retinopati (DR), yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD), glokom ve kornea neovaskülarizasyonu dahil olmak üzere çok sayıda göz rahatsızlığının anormal oküler anjiyogenez ile sonuçlanabileceği bilinmektedir5. Retina damar sistemi söz konusu olduğunda, retina dejenerasyonunun fare modelleri genellikle insan vasküler hastalıklarında görülenlerle karşılaştırılabilir değişiklikler sergiler 6,7. Temel sarmal-döngü-sarmal-fermuar transkripsiyon faktörlerinin Myc süpergen ailesi, retina pigment epitelinde (RPE) eksprese edilen mikroftalmi ile ilişkili transkripsiyon faktörü (Mitf) genini içerir8,9,10.

Göz, kulak, bağışıklık sistemi, merkezi sinir sistemi, böbrek, kemik ve deri dahil olmak üzere çok sayıda organın Mitf 9,11,12,13 tarafından düzenlendiği gösterilmiştir. Mitf geninde çeşitli mutasyonlar taşıyan farelerde RPE'nin yapısının ve işlevinin etkilendiğini, bunun da bazı retina dejenerasyonu vakalarına ve nihayetinde görme kaybına neden olduğunu keşfettik10. Son zamanlarda, Mitf mutantı ve vahşi tip fareler arasında damar sayısı ve damar çapının önemli ölçüde farklılık gösterdiği gösterilmiştir14. Araştırmacılar ve doktorlar artık retina görüntüleme gelişmeleri nedeniyle retina damar sistemini in vivo olarak kesin olarak ölçebilirler. 1800'lerden bu yana, araştırmacılar ve doktorlar retina damar sistemini görselleştirmenin yararından yararlandılar ve floresein anjiyografi (FA) hem retinal kan akışını hem de kan-retinal bariyerin bozulmasını gösterdi15.

Bu makale, MATLAB yazılımında özel olarak yazılmış bir kodla fare FA görüntülerinden retina damar çapının nasıl analiz edileceğini göstermektedir.

Protokol

Tüm deneyler İzlanda Gıda ve Veterinerlik Kurumu (MAST lisansı No. 2108002) tarafından onaylandı. Tüm hayvan çalışmaları, Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği'nin (ARVO) Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı Bildirimi'ne göre yürütülmüştür. Bu çalışmada erkek ve dişi C57BL/6J ve Mitfmi-vga9/+ fareler kullanıldı. Kontrol olarak C57BL/6J fareleri (n = 7) kullanıldı. Yabani türler ticari olarak elde edildi (Malzeme Tablosuna bakınız), ancak tüm mutant fareler (n = 7) İzlanda Üniversitesi'ndeki Biyomedikal Merkezi'ndeki hayvan tesislerinde yetiştirildi ve yetiştirildi. Bu çalışmada 3 aylık hayvanlar; Bununla birlikte, protokol 1 aylık ve daha yaşlı hayvanlar için bile geçerlidir.

1. Deneysel hazırlık

  1. Anestezi karışımını hazırlayın. Ketamin / ksilazin karışımının (25 mg / mL ketamin ve 20 mg / mL ksilazin) çalışma çözeltisini hazırlamak için 2 mL ketamin stok çözeltisinden (25 mg / mL) ve 250 μL ksilazin stok çözeltisinden (% 2) bir ampul alın (bkz.
  2. Fareyi, farenin vücut ağırlığının dört katı olan bir sıvı hacmiyle ketamin / ksilazin karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun; örneğin, 20 g ağırlığındaki bir fare, çalışma dozu ksilazin (4 mg / kg vücut ağırlığı) ve ketamin (40 mg / kg vücut ağırlığı) karışımı elde etmek için 35 μL ksilazin / ketamin çalışma çözeltisine ihtiyaç duyar.
  3. Anesteziden hemen sonra göz damlası% 10 fenilefrin hidroklorür ve% 1 tropikamid ile göz bebeklerini genişletin.
  4. Hayvan tamamen uyuşturulana ve göz bebekleri geniş ölçüde genişleyene kadar bekleyin.
  5. Floresein tuzu çözeltisi hazırlayın. 1 mL floresein çözeltisine (100 mg / mL stok konsantrasyonu) 9 mL fosfat tamponlu salin (PBS; 1x) ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Nihai konsantrasyon çalışma çözeltisi 10 mg / mL'dir.

2. Kemirgen retina görüntüleme sistemi kullanılarak retina damar sisteminin in vivo görüntülenmesi

  1. Anestezi uygulanmış hayvana floresein çalışma solüsyonunu intraperitoneal olarak (5 μL / g vücut ağırlığı) uygulayın.
  2. Kornea yüzeyine bir damla% 2 metilselüloz jel uygulayın ve ardından hayvanı görüntüleme sisteminin konumlandırma aşamasına yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
  3. Retina görüntüleme fundus kamera merceğini, farenin korneasına doğrudan ve nazikçe dokunacak şekilde konumlandırın. Optik sinir başını görme alanının ortasına yerleştirmek için hizalamayı hafifçe ayarlayın.
  4. Fundus kamerasındaki yeşil floresan kanalına geçin.
  5. Görüntü almak için retina damarlarına odaklanın.
  6. İdeal zaman noktasını bulmak için, floresein enjeksiyonunu takiben 1, 3, 5 ve 10 dakikada (ancak 10 dakikadan fazla olmamak üzere) bir dizi fotoğraf çekin.
    NOT: FA tedavisi 10 dakika içinde tamamlanmalıdır, çünkü bu süreden sonra floresein çok dağınık hale gelebilir ve damarlar tespit edilemez hale gelebilir.
  7. Görüntülemenin tamamlanmasının ardından, fare hala uyuşturulurken, servikal çıkık ile ötenazi yapın.

3. Retina damarının çapının analizi

  1. MATLAB programını açın (Malzeme Tablosuna bakınız).
  2. "fundusDiameter.m" kodunu indirin ve kaydedin (bkz. Ek Kodlama Dosyası 1, Ek Kodlama Dosyası 2 ve Ek Kodlama Dosyası 3).
  3. Kodun kaydedildiği klasörü açın. Kodu sürükleyin ve MATLAB'daki Geçerli Klasörün üzerine bırakın.
  4. FFA görüntüsünü (fundus floresan anjiyografi görüntüsü) veya analiz etmek istediğiniz görüntüleri MATLAB'daki Geçerli Klasör üzerine sürükleyip bırakın.
  5. MATLAB araç çubuğundan Çalıştır aracına basın.
  6. Bir açılır pencere görünecektir. İlgilendiğiniz görüntünün dosya adını Dosya adını girin kutusuna yazın ve Tamam'a basın.
    NOT: Parametrelerin geri kalanını değiştirmeyin veya değiştirmeyin.
  7. Optik diskin merkezini seçin ve ardından optik diskin kenarını seçin. Yazılım şimdi, optik diskin merkezinden saat yönünde, optik diskin iki katı yarıçaplı bir yarıçapa sahip bir daire içindeki fare fundus görüntülerindeki piksellerin yoğunluğunu hesaplıyor (Şekil 1).
  8. Ardından, yazılımın fundustaki her bir damarın ortalama damar çapını (piksel cinsinden) damar sayısının bir fonksiyonu olarak çizdiğinden emin olun (Şekil 2).
  9. Bunu takiben, yazılımın her bir tekne için ölçüm verilerini, bu değerlerin ortalama, medyan ve standart sapmasının hesaplandığı bir Excel belgesine aktardığından emin olun (Tablo 1 ve Tablo 2).
  10. Tablodaki tüm değerleri seçerek sonuçlar tablosundaki değerleri bir elektronik tablo programına taşıyın. Değerleri e-tabloya yapıştırın.
  11. Grafikleri çizin ve tercih edilen bir elektronik tablo programına yapıştırılan verileri kullanarak istatistiksel analiz yapın (bkz. Malzeme Tablosu).

Sonuçlar

Şekil 1, test edilen tüm farelerden alınan fare FFA görüntülerine uygulanan retina damar sistemini analiz etmek için kullanılan işlemi göstermektedir. Optik diskin merkezinden dairesel, saat yönünde piksellerin yoğunluğunu ölçmek için optik diskin iki katı büyüklüğünde bir yarıçap kullanılır. Sırasıyla kullanıcı tarafından belirlenen bir eşiğin üstünde ve altında noktalarla karşılaştığında pikselleri bir başlangıç veya bitiş noktasıyla işaretl...

Tartışmalar

Bu makale, fare FA görüntülerinden retina damar çapını ve retina vaskülatürünü analiz etmek için bir yöntem sunan ilk makaledir. Retina damar sisteminin görüntülerini yakalamak için sadece fundus görüntüleme kullanıldığından, yöntemin birkaç dezavantajı vardır, bunlardan biri, bu çalışmada incelenen farelerde retina damar sisteminin yalnızca yüzeysel katmanlarındaki değişikliklerin çıkarılabilmesidir; Daha derin katmanlardaki herhangi bir farklılık henüz bilinmemektedir.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir çıkar bulunmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, İzlanda Araştırma Fonu (217796-052) (AGL) ve Helga Jónsdóttir ve Sigurlidi Kristjánsson Anma Fonu'ndan (AGL ve TE ) Doktora Sonrası Burs hibesi ile desteklenmiştir. Yazarlar, fareleri sağladığı için Prof. Eiríkur Steingrímsson'a teşekkür ediyor.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1% Tropicamide (Mydriacyl)Alcon Inc LaboratoriesMydriatic agent
2% MethocelOmniVision Eye CareHydroxypropryl methylcellulose gel
C57BL/6JJackson Laboratory000664Wild type mice
Excel for Microsoft 365Microsoft IncSoftware package
Fluorescein sodium saltSigma-Aldrich28803-100GFluorescent angiography
Matlab 8.0The MathWorks, Inc.Software package
Micron IV rodent fundus cameraPhoenix-Micron40-2200Fundus photography
Phenylephrine 10% w/vBausch & LombMydriatic agent
Phosphate Buffered Saline - 100 tabletsGibco18912-014Dilution
Sigmaplot 13Jandel Scientific SoftwareSoftware package
S-Ketamine, 25 mg/mLPfizer Inc.PAA104470Anesthesia IP

Referanslar

  1. Cheung, C. Y., Ikram, M. K., Chen, C., Wong, T. Y. Imaging retina to study dementia and stroke. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 89-107 (2017).
  2. Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
  3. Ma, Y., et al. Quantitative analysis of retinal vessel attenuation in eyes with retinitis pigmentosa. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 4306-4314 (2012).
  4. Eysteinsson, T., Hardarson, S. H., Bragason, D., Stefansson, E. Retinal vessel oxygen saturation and vessel diameter in retinitis pigmentosa. Acta Ophthalmologica. 92 (5), 449-453 (2014).
  5. Al-Latayfeh, M., Silva, P. S., Sun, J. K., Aiello, L. P. Antiangiogenic therapy for ischemic retinopathies. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (6), 006411 (2012).
  6. Wang, S., Villegas-Perez, M. P., Vidal-Sanz, M., Lund, R. D. Progressive optic axon dystrophy and vacuslar changes in rd mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (2), 537-545 (2000).
  7. Liu, H., et al. Photoreceptor cells influence retinal vascular degeneration in mouse models of retinal degeneration and diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4272-4281 (2016).
  8. Steingrimsson, E., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. Melanocytes and the microphthalmia transcription factor network. Annual Review of Genetics. 38, 365-411 (2004).
  9. Arnheiter, H. The discovery of the microphthalmia locus and its gene. Mitf. Pigment Cell & Melanoma Research. 23 (6), 729-735 (2010).
  10. Garcia-Llorca, A., Aspelund, S. G., Ogmundsdottir, M. H., Steingrimsson, E., Eysteinsson, T. The microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) gene and its role in regulating eye function. Scientific Reports. 9 (1), 15386 (2019).
  11. Bharti, K., Liu, W., Csermely, T., Bertuzzi, S., Arnheiter, H. Alternative promoter use in eye development: the complex role and regulation of the transcription factor MITF. Development. 135 (6), 1169-1178 (2008).
  12. Lu, S. Y., Li, M., Lin, Y. L. Mitf induction by RANKL is critical for osteoclastogenesis. Molecular Biology of the Cell. 21 (10), 1763-1771 (2010).
  13. Pillaiyar, T., Manickam, M., Jung, S. H. Recent development of signaling pathways inhibitors of melanogenesis. Cellular Signalling. 40, 99-115 (2017).
  14. Danielsson, S. B., Garcia-Llorca, A., Reynisson, H., Eysteinsson, T. Mouse microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) mutations affect the structure of the retinal vasculature. Acta Ophthalmologica. 100 (8), 911-918 (2022).
  15. Burns, S. A., Elsner, A. E., Gast, T. J. Imaging the retinal vasculature. Annual Review of Vision Science. 7, 129-153 (2021).
  16. Wei, W., et al. Automated vessel diameter quantification and vessel tracing for OCT angiography. Journal of Biophotonics. 13 (12), e202000248 (2020).
  17. Salas, M., et al. Compact akinetic swept source optical coherence tomography angiography at 1060 nm supporting a wide field of view and adaptive optics imaging modes of the posterior eye. Biomedical Optics Express. 9 (4), 1871-1892 (2018).
  18. Albanna, W., et al. Non-invasive evaluation of neurovascular coupling in the murine retina by dynamic retinal vessel analysis. PLoS One. 13 (10), e0204689 (2018).
  19. Moult, E. M., et al. Evaluating anesthetic protocols for functional blood flow imaging in the rat eye. Journal of Biomedical Optics. 22 (1), 16005 (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Anahtar kelime ler Retina Damar apFare Floresan AnjiyografiRetina G r nt lemeMATLAB ProgramRetina Vask ler DurumlarRetina HastalRetina Damar AnaliziOptik DiskFloresein AnjiyografiG r nt AnaliziRetina Damar l m

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır