Messung des retinalen Gefäßdurchmessers aus Fluoreszenzangiographie-Bildern der Maus

Zusammenfassung

Das retinale Gefäßsystem der Maus ist besonders interessant, um die Mechanismen der Gefäßmusterbildung zu verstehen. Dieses Protokoll misst automatisch den Durchmesser von Netzhautgefäßen der Maus aus fluoreszierenden Angiographie-Fundusbildern in einem festen Abstand zur Sehscheibe.

Zusammenfassung

Es ist wichtig, die Entwicklung des retinalen Gefäßsystems bei Retinopathien zu untersuchen, bei denen ein abnormales Gefäßwachstum letztendlich zum Verlust des Sehvermögens führen kann. Mutationen im Mikrophthalmie-assoziierten Transkriptionsfaktor (Mitf)-Gen zeigen Hypopigmentierung, Mikrophthalmie, Netzhautdegeneration und in einigen Fällen Blindheit. Die nicht-invasive In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus ist für die Augenforschung von entscheidender Bedeutung. Aufgrund ihrer geringen Größe ist die Bildgebung des Mausfundus jedoch schwierig und erfordert möglicherweise spezielle Werkzeuge, Wartung und Schulung. In dieser Studie haben wir eine einzigartige Software entwickelt, die die Analyse des retinalen Gefäßdurchmessers bei Mäusen mit einem automatisierten Programm ermöglicht, das in MATLAB geschrieben wurde. Fundusfotos wurden mit einem kommerziellen Funduskamerasystem nach einer intraperitonealen Injektion einer Fluoreszeinsalzlösung aufgenommen. Die Bilder wurden verändert, um den Kontrast zu verbessern, und das MATLAB-Programm ermöglichte die automatische Extraktion des mittleren Gefäßdurchmessers in einem vordefinierten Abstand von der Sehscheibe. Die vaskulären Veränderungen wurden bei Wildtyp-Mäusen und Mäusen mit verschiedenen Mutationen im Mitf-Gen durch Analyse des retinalen Gefäßdurchmessers untersucht. Das hier entwickelte eigens entwickelte MATLAB-Programm ist praxisnah, einfach zu bedienen und ermöglicht es den Forschern, den mittleren Durchmesser und den mittleren Gesamtdurchmesser sowie die Anzahl der Gefäße aus dem retinalen Gefäßsystem der Maus bequem und zuverlässig zu analysieren.

Einleitung

Das möglicherweise am besten erforschte Gefäßbett des Körpers ist das retinale Gefäßsystem. Mit immer besserer technischer Verfeinerung lässt sich das retinale Gefäßsystem bei lebenden Patienten leicht fotografieren und in vielen Forschungsbereichen einsetzen¹. Darüber hinaus hat sich das retinale Gefäßsystem der Maus während der Entwicklung als sehr effektives Modellsystem für die Erforschung der grundlegenden Biologie des Gefäßwachstums erwiesen. Der primäre Zweck des retinalen Gefäßsystems besteht darin, den inneren Teil der Netzhaut durch ein laminares Kapillargeflecht, das das Nervengewebe durchdringt, mit metabolischer Unterstützung zu versorgen². Nichtsdestotrotz kann der Zustand der Netzhaut und folglich jede Funktionsstörung oder Atrophie erhebliche Auswirkungen sowohl auf die Bifurkationen der retinalen Gefäße als auch auf den Durchmesser der Arterien haben, was ein Zusammenspiel zwischen den Netzhautzellen und dem Gefäßsystem zeigt ^3,4. Es ist bekannt, dass zahlreiche Augenerkrankungen, darunter Frühgeborenenretinopathie (ROP), diabetische Retinopathie (DR), altersbedingte Makuladegeneration (AMD), Glaukom und Hornhautneovaskularisation, zu einer abnormalen okulären Angiogenese führen können⁵. Im Falle des retinalen Gefäßsystems weisen Mausmodelle der Netzhautdegeneration häufig Veränderungen auf, die mit denen vergleichbar sind, die bei menschlichen Gefäßerkrankungen beobachtet werden ^6,7. Die Myc-Supergenfamilie der fundamentalen Helix-Loop-Helix-Zipper-Transkriptionsfaktoren umfasst das Mikrophthalmie-assoziierte Transkriptionsfaktor-Gen (Mitf), das im retinalen Pigmentepithel (RPE) exprimiert wird8,9,10.

Zahlreiche Organe, darunter das Auge, das Ohr, das Immunsystem, das zentrale Nervensystem, die Niere, die Knochen und die Haut, wurden nachweislich durch Mitf 9,11,12,13 reguliert.Wir haben entdeckt, dass die Struktur und Funktion des RPE bei Mäusen mit verschiedenen Mutationen im Mitf-Gen beeinträchtigt sind, was in einigen Fällen zu Netzhautdegeneration und schließlich zum Verlust des Sehvermögens führt¹⁰. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass sich die Anzahl der Gefäße und der Gefäßdurchmesser zwischen Mitf-Mutanten und Wildtyp-Mäusen signifikant unterscheiden¹⁴. Forscher und Mediziner können das retinale Gefäßsystem heute dank der Entwicklungen in der Netzhautbildgebung in vivo präzise quantifizieren. Seit den 1800er Jahren haben sich Forscher und Ärzte die Vorteile der Visualisierung der retinalen Gefäße zunutze gemacht, und die Fluoreszenzangiographie (FA) hat sowohl den retinalen Blutfluss als auch den Abbau der Blut-Netzhaut-Schranke gezeigt¹⁵.

In diesem Artikel wird gezeigt, wie der retinale Gefäßdurchmesser aus FA-Bildern von Mäusen mit einem benutzerdefinierten Code in der MATLAB-Software analysiert wird.

Protokoll

Alle Versuche wurden von der isländischen Lebensmittel- und Veterinärbehörde genehmigt (MAST-Lizenz Nr. 2108002). Alle Tierversuche wurden gemäß der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Ophthalmologie- und Sehforschung durchgeführt. In dieser Studie wurden männliche und weibliche C57BL/6J- und ^{Mitf mi-vga9/+} Mäuse verwendet. Als Kontrolle wurden C57BL/6J-Mäuse (n = 7) verwendet. Die Wildtypen wurden kommerziell gewonnen (siehe Materialtabelle), aber alle mutierten Mäuse (n = 7) wurden in Tiereinrichtungen im Biomedizinischen Zentrum der Universität Island gezüchtet und aufgezogen. In der vorliegenden Studie wurden 3 Monate alte Tiere verwendet; Das Protokoll gilt jedoch auch für Tiere ab 1 Monat.

1. Experimentelle Vorbereitung

1. Bereiten Sie die Anästhesiemischung vor. Nehmen Sie eine Ampulle mit einer 2 mL Ketamin-Stammlösung (25 mg/ml) und 250 μl Xylazin-Stammlösung (2%) zur Herstellung einer Arbeitslösung aus Ketamin/Xylazin-Gemisch (25 mg/ml Ketamin und 20 mg/ml Xylazin) (siehe Materialtabelle).
2. Betäuben Sie die Maus mit einer intraperitonealen Injektion des Ketamin/Xylazin-Gemisches mit einem Flüssigkeitsvolumen, das das Vierfache des Körpergewichts der Maus beträgt. Zum Beispiel benötigt eine Maus mit einem Gewicht von 20 g 35 μl Xylazin/Ketamin-Arbeitslösung, um eine Arbeitsdosis aus Xylazin (4 mg/kg Körpergewicht) und Ketamin-Gemisch (40 mg/kg Körpergewicht) zu erhalten.
3. Erweitern Sie die Pupillen mit einem Augentropfen aus 10 % Phenylephrinhydrochlorid und 1 % Tropicamid unmittelbar nach der Anästhesie.
4. Warten Sie, bis das Tier vollständig betäubt ist und seine Pupillen weit geweitet sind.
5. Bereiten Sie die Fluoreszeinsalzlösung vor. 9 mL phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS; 1x) zu 1 mL Fluoresceinlösung (100 mg/mL Stammkonzentration) geben (siehe Materialtabelle). Die Arbeitslösung für die Endkonzentration beträgt 10 mg/ml.

2. In-vivo-Bildgebung des retinalen Gefäßsystems mit einem Nagetier-Bildgebungssystem

1. Verabreichen Sie dem anästhesierten Tier intraperitoneal eine Fluoreszein-Arbeitslösung (5 μl/g Körpergewicht).
2. Tragen Sie einen Tropfen 2%iges Methylcellulosegel auf die Hornhautoberfläche auf und legen Sie das Tier dann auf den Positionierungstisch des Bildgebungssystems (siehe Materialtabelle).
3. Positionieren Sie das Kameraobjektiv für die Netzhautbildgebung so, dass es die Hornhaut der Maus direkt und sanft berührt. Um den Sehnervenkopf in der Mitte des Gesichtsfeldes zu platzieren, passen Sie die Ausrichtung leicht an.
4. Wechseln Sie zum grünen Leuchtstoffkanal an der Funduskamera.
5. Fokussieren Sie sich auf die Netzhautgefäße, um Bilder aufzunehmen.
6. Um den idealen Zeitpunkt zu finden, machen Sie eine Reihe von Fotos nach 1, 3, 5 und 10 Minuten (aber nicht länger als 10 Minuten) nach der Fluoreszeininjektion.
   HINWEIS: Die FA-Behandlung muss innerhalb von 10 Minuten abgeschlossen sein, da nach dieser Zeit das Fluorescein zu stark diffundiert werden kann und die Gefäße nicht mehr nachweisbar sind.
7. Nach Abschluss der Bildgebung, während die Maus noch anästhesiert ist, euthanasieren Sie sie durch Gebärmutterhalsdislokation.

3. Analyse des Gefäßdurchmessers der Netzhaut

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt den Prozess zur Analyse des retinalen Gefäßsystems, der auf Maus-FFA-Bilder aller getesteten Mäuse angewendet wird. Ein Radius, der doppelt so groß ist wie der der Papille, wird verwendet, um die Intensität von Pixeln in kreisförmiger Uhrzeigersinn vom Mittelpunkt der Papille aus zu messen. Es markiert Pixel mit einem Start- oder Endpunkt, wenn es auf Punkte über bzw. unter einem benutzerdefinierten Schwellenwert stößt. Dies wird 30 Mal wiederholt, wobei jedes Mal ...

Diskussion

Der vorliegende Artikel ist der erste, der eine Methode zur Analyse des retinalen Gefäßdurchmessers und des retinalen Gefäßsystems aus FA-Bildern von Mäusen vorstellt. Da bei den in dieser Studie untersuchten Mäusen nur Fundusbildgebung zur Aufnahme von Bildern des retinalen Gefäßsystems verwendet wurde, hat das Verfahren mehrere Nachteile, von denen einer darin besteht, dass man bei den in dieser Studie untersuchten Mäusen nur auf Veränderungen in den oberflächlichen Schichten des retinalen Gefäßsystems sch...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Tropicamide (Mydriacyl)	Alcon Inc Laboratories		Mydriatic agent
2% Methocel	OmniVision Eye Care		Hydroxypropryl methylcellulose gel
C57BL/6J	Jackson Laboratory	000664	Wild type mice
Excel for Microsoft 365	Microsoft Inc		Software package
Fluorescein sodium salt	Sigma-Aldrich	28803-100G	Fluorescent angiography
Matlab 8.0	The MathWorks, Inc.		Software package
Micron IV rodent fundus camera	Phoenix-Micron	40-2200	Fundus photography
Phenylephrine 10% w/v	Bausch & Lomb		Mydriatic agent
Phosphate Buffered Saline - 100 tablets	Gibco	18912-014	Dilution
Sigmaplot 13	Jandel Scientific Software		Software package
S-Ketamine, 25 mg/mL	Pfizer Inc.	PAA104470	Anesthesia IP