Medición del diámetro de los vasos retinianos a partir de imágenes de angiografía fluorescente de ratón

Resumen

La vasculatura de la retina del ratón es particularmente interesante para comprender los mecanismos de formación de patrones vasculares. Este protocolo mide automáticamente el diámetro de los vasos de la retina del ratón a partir de imágenes de fondo de ojo de angiografía fluorescente a una distancia fija del disco óptico.

Resumen

Es importante estudiar el desarrollo de la vasculatura de la retina en las retinopatías en las que el crecimiento anormal de los vasos puede conducir en última instancia a la pérdida de la visión. Las mutaciones en el gen del factor de transcripción asociado a la microftalmia (Mitf) muestran hipopigmentación, microftalmia, degeneración de la retina y, en algunos casos, ceguera. La obtención de imágenes in vivo de la retina del ratón por medios no invasivos es vital para la investigación ocular. Sin embargo, dado su pequeño tamaño, la obtención de imágenes del fondo de ojo del ratón es difícil y puede requerir herramientas especializadas, mantenimiento y capacitación. En este estudio, hemos desarrollado un software único que permite el análisis del diámetro de los vasos de la retina en ratones con un programa automatizado escrito en MATLAB. Las fotografías del fondo de ojo se obtuvieron con un sistema comercial de cámara de fondo de ojo después de una inyección intraperitoneal de una solución de sal de fluoresceína. Las imágenes se modificaron para mejorar el contraste, y el programa MATLAB permitió extraer automáticamente el diámetro vascular medio a una distancia predefinida del disco óptico. Los cambios vasculares se examinaron en ratones de tipo salvaje y ratones con varias mutaciones en el gen Mitf mediante el análisis del diámetro de los vasos de la retina. El programa MATLAB desarrollado aquí es práctico, fácil de usar y permite a los investigadores analizar el diámetro medio y el diámetro total medio, así como el número de vasos de la vasculatura de la retina del ratón, de forma cómoda y fiable.

Introducción

Posiblemente el lecho vascular más investigado en el cuerpo es la vasculatura retiniana. Con una sofisticación técnica cada vez mayor, la vasculatura de la retina se puede fotografiar fácilmente en pacientes vivos y se utiliza en muchos campos de investigación¹. Además, la vasculatura de la retina del ratón durante el desarrollo ha demostrado ser un sistema modelo muy eficaz para la investigación de la biología fundamental del crecimiento vascular. El objetivo principal de la vasculatura retiniana es proporcionar apoyo metabólico a la parte interna de la retina a través de una malla capilar laminar que impregna el tejido neural². Sin embargo, el estado de la retina y, en consecuencia, cualquier disfunción o atrofia, puede tener efectos significativos tanto en las bifurcaciones de la vasculatura retiniana como en el diámetro de las arterias, demostrando una interacción entre las células de la retina y la vasculatura ^3,4. Se sabe que numerosas afecciones oculares, como la retinopatía del prematuro (ROP), la retinopatía diabética (RD), la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), el glaucoma y la neovascularización de la córnea, pueden dar lugar a una angiogénesis ocular anormal⁵. En el caso de la vasculatura retiniana, los modelos murinos de degeneración retiniana a menudo exhiben cambios comparables a los observados en las enfermedades vasculares humanas ^6,7. La familia de supergenes Myc de factores de transcripción fundamentales de hélice-bucle-hélice-cremallera incluye el gen del factor de transcripción asociado a la microftalmia (Mitf) expresado en el epitelio pigmentario de la retina (EPR)^8,9,10.

Se ha demostrado que numerosos órganos, incluidos el ojo, el oído, el sistema inmunológico, el sistema nervioso central, el riñón, los huesos y la piel, están regulados por Mitf 9,11,12,13. Hemos descubierto que la estructura y la función del EPR se ven afectadas en ratones portadores de diversas mutaciones en el gen Mitf, lo que da lugar a algunos casos de degeneración de la retina y, en última instancia, a la pérdida de visión¹⁰. Recientemente, se ha demostrado que el número de vasos y el diámetro de los vasos difieren significativamente entre los ratones mutantes Mitf y los ratones de tipo salvaje¹⁴. Los investigadores y los médicos ahora pueden cuantificar con precisión la vasculatura de la retina in vivo gracias a los avances en las imágenes de la retina. Desde el siglo XIX, los investigadores y los médicos han aprovechado el beneficio de visualizar la vasculatura de la retina, y la angiografía con fluoresceína (AF) ha demostrado tanto el flujo sanguíneo de la retina como la degradación de la barrera hematorretiniana¹⁵.

En este artículo se muestra cómo analizar el diámetro de los vasos de la retina a partir de imágenes de AF de ratón con un código escrito a medida en el software de MATLAB.

Protocolo

Todos los experimentos fueron aprobados por la Autoridad Alimentaria y Veterinaria de Islandia (licencia MAST Nº 2108002). Todos los estudios en animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Declaración de la Asociación para la Investigación de la Visión y la Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. En este estudio se utilizaron ratones machos y hembras C57BL/6J y Mitf^mi-vga9/+ . Se utilizaron ratones C57BL/6J (n = 7) como control. Los tipos silvestres se obtuvieron comercialmente (ver Tabla de Materiales), pero todos los ratones mutantes (n = 7) fueron criados y criados en instalaciones para animales en el Centro Biomédico de la Universidad de Islandia. En el presente estudio se utilizaron animales de 3 meses de edad; Sin embargo, el protocolo se aplica incluso a animales de 1 mes o más.

1. Preparación experimental

1. Prepara la mezcla de anestesia. Tome una ampolla de una solución madre de ketamina de 2 ml (25 mg/ml) y una solución madre de xilacina de 250 μl (2%) para preparar una solución de trabajo de la mezcla de ketamina y xilacina (25 mg/ml de ketamina y 20 mg/ml de xilacina) (ver Tabla de materiales).
2. Anestesiar al ratón con una inyección intraperitoneal de la mezcla de ketamina y xilacina, con un volumen de líquido que es cuatro veces el peso corporal del ratón; por ejemplo, un ratón de 20 g de peso necesita 35 μL de solución de trabajo de xilacina/ketamina para obtener una dosis de trabajo de la mezcla de xilacina (4 mg/kg de peso corporal) y ketamina (40 mg/kg de peso corporal).
3. Dilatar las pupilas con un colirio de clorhidrato de fenilefrina al 10% y tropicamida al 1% inmediatamente después de la anestesia.
4. Espere hasta que el animal esté completamente anestesiado y sus pupilas estén ampliamente dilatadas.
5. Prepara la solución de sal de fluoresceína. Añadir 9 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS; 1x) a 1 mL de solución de fluoresceína (concentración de stock de 100 mg/mL) (ver Tabla de Materiales). La solución de trabajo de concentración final es de 10 mg/mL.

2. Obtención de imágenes in vivo de la vasculatura de la retina mediante un sistema de imágenes de la retina de roedores

1. Administrar solución de trabajo con fluoresceína por vía intraperitoneal (5 μL/g de peso corporal) al animal anestesiado.
2. Aplique una gota de gel de metilcelulosa al 2% en la superficie de la córnea y luego coloque al animal en la etapa de posicionamiento del sistema de imágenes (ver Tabla de Materiales).
3. Coloque la lente de la cámara de fondo de ojo para tocar la córnea del ratón directa y suavemente. Para colocar la cabeza del nervio óptico en el centro del campo visual, ajuste ligeramente la alineación.
4. Cambie al canal fluorescente verde de la cámara de fondo de ojo.
5. Concéntrese en los vasos de la retina para tomar imágenes.
6. Para encontrar el punto de tiempo ideal, tome varias fotos a 1, 3, 5 y 10 minutos (pero no más de 10 minutos) después de la inyección de fluoresceína.
   NOTA: El tratamiento con AF debe completarse dentro de los 10 minutos, ya que después de ese tiempo la fluoresceína puede difundirse demasiado y los vasos se vuelven indetectables.
7. Al finalizar la toma de imágenes, mientras el ratón aún está anestesiado, se le practica la eutanasia mediante una dislocación cervical.

3. Análisis del diámetro de los vasos retinianos

1. Abra el programa MATLAB (consulte Tabla de materiales).
2. Descargue y guarde el código "fundusDiameter.m" (consulte Archivo de codificación complementaria 1, Archivo de codificación complementaria 2 y Archivo de codificación complementaria 3).
3. Abra la carpeta donde se guardó el código. Arrastre el código y suéltelo sobre la carpeta actual de MATLAB.
4. Arrastre y suelte la imagen FFA (imagen de angiografía por fluorescencia de fondo de ojo) o las imágenes que desee analizar sobre la carpeta actual de MATLAB.
5. Pulse la herramienta Run en la barra de herramientas de MATLAB.
6. Aparecerá una ventana emergente. Escriba el nombre de archivo de la imagen de interés en el cuadro Introducir nombre de archivo y pulse OK.
   NOTA: No cambie ni modifique el resto de los parámetros.
7. Seleccione el centro del disco óptico y, a continuación, seleccione el borde del disco óptico. El software ahora calcula la intensidad de los píxeles en las imágenes del fondo de ojo del ratón en un círculo con un radio que es el doble que el del disco óptico, en el sentido de las agujas del reloj desde el centro del disco óptico (Figura 1).
8. A continuación, asegúrese de que el software traza el diámetro medio de los vasos (en píxeles) de cada vaso en el fondo de ojo en función del número de vasos (Figura 2).
9. A continuación, asegúrese de que el software transfiera los datos de medición de cada recipiente a un documento de Excel, donde se calculan la media, la mediana y la desviación estándar de estos valores (Tabla 1 y Tabla 2).
10. Mueva los valores de la tabla de resultados a un programa de hoja de cálculo seleccionando todos los valores de la tabla. Pega los valores en la hoja de cálculo.
11. Traza los gráficos y realiza análisis estadísticos utilizando los datos pegados en un programa de hoja de cálculo de tu elección (ver Tabla de Materiales).

Resultados

La Figura 1 muestra el proceso utilizado para analizar la vasculatura de la retina, que se aplica a las imágenes de FFA de ratón de todos los ratones probados. Se utiliza un radio dos veces más grande que el disco óptico para medir la intensidad de los píxeles en una dirección circular en el sentido de las agujas del reloj desde el centro del disco óptico. Marca los píxeles con un punto inicial o final cuando se encuentra con puntos por encima y por debajo de un umbral especificado p...

Discusión

El presente artículo es el primero en presentar un método para analizar el diámetro de los vasos retinianos y la vasculatura retiniana a partir de imágenes de AF de ratón. Dado que solo se utilizaron imágenes de fondo de ojo para capturar imágenes de la vasculatura de la retina, el método tiene varios inconvenientes, uno de los cuales es que solo se pueden inferir alteraciones en las capas superficiales de la vasculatura de la retina en los ratones examinados en este estudio; Todavía se desconocen las diferencia...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Tropicamide (Mydriacyl)	Alcon Inc Laboratories		Mydriatic agent
2% Methocel	OmniVision Eye Care		Hydroxypropryl methylcellulose gel
C57BL/6J	Jackson Laboratory	000664	Wild type mice
Excel for Microsoft 365	Microsoft Inc		Software package
Fluorescein sodium salt	Sigma-Aldrich	28803-100G	Fluorescent angiography
Matlab 8.0	The MathWorks, Inc.		Software package
Micron IV rodent fundus camera	Phoenix-Micron	40-2200	Fundus photography
Phenylephrine 10% w/v	Bausch & Lomb		Mydriatic agent
Phosphate Buffered Saline - 100 tablets	Gibco	18912-014	Dilution
Sigmaplot 13	Jandel Scientific Software		Software package
S-Ketamine, 25 mg/mL	Pfizer Inc.	PAA104470	Anesthesia IP