Mouse Fluorescent Angiography 이미지에서 망막 혈관 직경 측정

요약

생쥐의 망막 혈관 구조는 혈관 패턴 형성의 메커니즘을 이해하는 데 특히 흥미롭습니다. 이 프로토콜은 광학 디스크에서 고정된 거리에서 형광 혈관 조영술 안저 영상에서 마우스 망막 혈관의 직경을 자동으로 측정합니다.

초록

비정상적인 혈관 성장이 궁극적으로 시력 상실로 이어질 수 있는 망막병증에서 망막 혈관 구조의 발달을 연구하는 것이 중요합니다. 미세안구증 관련 전사 인자(Mitf) 유전자의 돌연변이는 저색소침착, 미안구증, 망막 변성, 경우에 따라 실명을 보여줍니다. 비침습적 수단을 통한 쥐 망막의 생체 내 이미징은 눈 연구에 매우 중요합니다. 그러나 크기가 작기 때문에 쥐 안저 이미징이 어렵고 특수 도구, 유지 관리 및 교육이 필요할 수 있습니다. 이 연구에서는 MATLAB으로 작성된 자동화 프로그램을 사용하여 생쥐의 망막 혈관 직경을 분석할 수 있는 고유한 소프트웨어를 개발했습니다. 안저 사진은 플루오레세인 염 용액의 복강 내 주입 후 상업용 안저 카메라 시스템으로 획득했습니다. 콘트라스트를 향상시키기 위해 이미지를 변경했으며, MATLAB 프로그램은 광학 디스크에서 사전 정의된 거리에서 평균 혈관 직경을 자동으로 추출할 수 있도록 허용했습니다. 야생형 마우스와 Mitf 유전자에 다양한 돌연변이가 있는 마우스에서 망막 혈관 직경을 분석하여 혈관 변화를 조사하였다. 여기에서 개발된 맞춤형 MATLAB 프로그램은 실용적이고 사용하기 쉬우며, 연구자들이 쥐 망막 혈관 구조의 혈관 수뿐만 아니라 평균 직경과 평균 총 직경을 편리하고 안정적으로 분석할 수 있도록 합니다.

서문

아마도 신체에서 가장 많이 연구된 혈관층은 망막 혈관 구조일 것입니다. 끊임없이 발전하는 기술적 정교함으로 망막 혈관 구조는 살아있는 환자의 사진을 쉽게 촬영할 수 있으며 많은 연구 분야에서 사용됩니다¹. 또한, 발달 중인 쥐의 망막 혈관 구조는 혈관 성장의 기본 생물학 연구에 매우 효과적인 모델 시스템임이 입증되었습니다. 망막 혈관 구조의 주요 목적은 신경 조직을 관통하는 층상 모세혈관 그물망을 통해 망막의 내부 부분에 대사 지원을 제공하는 것입니다². 그럼에도 불구하고, 망막의 상태, 그리고 그에 따른 모든 기능 장애 또는 위축은 망막 혈관의 분기와 동맥의 지름 모두에 상당한 영향을 미칠 수 있으며, 이는 망막 세포와 혈관 구조 사이의 상호 작용을 보여줍니다 ^3,4. 미숙아 망막증(ROP), 당뇨병성 망막병증(DR), 연령 관련 황반 변성(AMD), 녹내장, 각막 신생혈관 형성 등 다양한 안과 질환이 비정상적인 안구 혈관 신생을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다⁵. 망막 혈관 구조의 경우, 망막 변성의 마우스 모델은 종종 인간 혈관 질환에서 볼 수 있는 것과 유사한 변화를 보인다 ^6,7. 기본 나선-루프-나선-지퍼 전사 인자의 Myc 슈퍼유전자 계열에는 망막 색소 상피(RPE^)에서 발현되는 미세안구증 관련 전사 인자(Mitf) 유전자가 포함됩니다^8,9,10.

눈, 귀, 면역 체계, 중추 신경계, 신장, 뼈 및 피부를 포함한 수많은 기관이 Mitf 9,11,12,13에 의해 조절되는 것으로 입증되었습니다. 우리는 Mitf 유전자에 다양한 돌연변이를 가진 마우스에서 RPE의 구조와 기능이 영향을 받아 일부 망막 변성 사례가 발생하고 궁극적으로 시력 상실이 발생한다는 것을 발견했습니다¹⁰. 최근에는 Mitf 돌연변이 마우스와 야생형 마우스 간에 혈관의 수와 혈관 직경이 유의하게 다르다는 것이 밝혀졌다¹⁴. 연구자와 의사는 이제 망막 이미징 개발로 인해 생체 내에서 망막 혈관 구조를 정확하게 정량화할 수 있습니다. 1800년대 이래로 연구자들과 의사들은 망막 혈관 구조를 시각화하는 이점을 활용해 왔으며, 형광 혈관 조영술(FA)은 망막 혈류와 혈액-망막 장벽의 퇴화를 모두 보여주었다¹⁵.

이 기사에서는 MATLAB 소프트웨어에서 사용자 지정 작성한 코드를 사용하여 마우스 FA 이미지의 망막 혈관 직경을 분석하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

모든 실험은 아이슬란드 식품 및 수의학 당국(MAST 라이선스 번호 2108002)의 승인을 받았습니다. 모든 동물 연구는 ARVO(Association for Research in Vision and Ophthalmology)의 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 성명서에 따라 수행되었습니다. 이 연구에서는 남성과 여성 C57BL/6J 및 Mitf^mi-vga9/+ 마우스를 사용했습니다. C57BL/6J 마우스(n=7)를 대조군으로 사용하였다. 야생형은 상업적으로 얻어졌지만( 재료 표 참조), 모든 돌연변이 마우스(n = 7)는 아이슬란드 대학의 생물 의학 센터의 동물 시설에서 사육되고 사육되었습니다. 본 연구에서는 3개월 된 동물을 사용했습니다. 그러나 이 프로토콜은 1개월 이상의 동물에게도 적용됩니다.

1. 실험 준비

1. 마취 혼합물을 준비합니다. 2mL 케타민 원액(25mg/mL) 및 250μL 자일라진 원액(2%) 앰플 1개를 사용하여 케타민/자일라진 혼합물(25mg/mL 케타민 및 20mg/mL 자일라진)의 작업 용액을 준비합니다( 재료 표 참조).
2. 케타민/자일라진 혼합물의 복강 내 주사로 쥐를 마취하고 쥐 체중의 4배에 달하는 액체를 주입합니다. 예를 들어, 무게가 20g인 마우스는 자일라진(체중 4mg/kg) 및 케타민(체중 40mg/kg) 혼합물의 작업 용량을 얻기 위해 35μL의 자일라진/케타민 작업 용액이 필요합니다.
3. 마취 직후 10% 페닐에프린 염산염과 1% 트로피카마이드를 점안액으로 동공을 확장합니다.
4. 동물이 완전히 마취되고 동공이 넓게 확장될 때까지 기다리십시오.
5. 플루오레세인 염 용액을 준비합니다. 9mL의 인산염 완충 식염수(PBS, 1x)를 플루오레세인 용액 1mL(100mg/mL 원액 농도)에 추가합니다( 재료 표 참조). 최종 농도 작업 용액은 10mg/mL입니다.

2. 설치류 망막 이미징 시스템을 사용한 망막 혈관의 In vivo 이미징

1. 플루오레세인 작업 용액을 마취된 동물에게 복강내(체중 5μL/g)로 투여합니다.
2. 각막 표면에 2% 메틸셀룰로오스 겔 한 방울을 도포한 다음 동물을 이미징 시스템의 포지셔닝 단계에 놓습니다( 재료 표 참조).
3. 망막 영상 안저 카메라 렌즈를 배치하여 쥐의 각막에 직접 부드럽게 닿도록 합니다. 시신경두를 시야 중앙에 배치하려면 정렬을 약간 조정합니다.
4. 안저 카메라의 녹색 형광 채널로 전환합니다.
5. 이미지를 촬영하기 위해 망막 혈관에 초점을 맞춥니다.
6. 이상적인 시점을 찾으려면 플루오레세인 주입 후 1, 3, 5, 10분(단, 10분 이하)에 여러 장의 사진을 찍습니다.
   알림: FA 처리는 10분 이내에 완료해야 하며, 그 후에는 플루오레세인이 너무 확산되어 혈관이 감지되지 않을 수 있습니다.
7. 이미징이 완료되면 쥐가 아직 마취된 상태에서 자궁 경부 탈구로 안락사시킵니다.

3. 망막혈관의 지름 분석

1. MATLAB 프로그램을 엽니다( Table of Materials 참조).
2. "fundusDiameter.m" 코드를 다운로드하여 저장합니다( 보충 코딩 파일 1, 보충 코딩 파일 2 및 보충 코딩 파일 3 참조).
3. 코드가 저장된 폴더를 엽니다. 코드를 MATLAB의 현재 폴더 위로 끌어다 놓습니다.
4. FFA 이미지(안저 형광 혈관 조영술 이미지) 또는 분석하려는 이미지를 MATLAB의 현재 폴더 위로 끌어다 놓습니다.
5. MATLAB 도구 모음에서 실행 툴을 누릅니다.
6. 팝업 창이 나타납니다. 파일 이름 입력 상자에 관심 이미지의 파일 이름을 쓰고 OK를 누릅니다.
   참고: 나머지 매개변수는 변경하거나 수정하지 마십시오.
7. 광학 디스크의 중심을 선택한 다음 광학 디스크의 가장자리를 선택합니다. 이제 소프트웨어는 광학 디스크의 중심에서 시계 방향으로 반경의 두 배인 원 안에서 마우스 안저 이미지의 픽셀 강도를 계산합니다(그림 1).
8. 다음으로, 소프트웨어가 안저에 있는 각 용기의 평균 용기 직경(픽셀 단위)을 혈관 수의 함수로 표시하는지 확인합니다(그림 2).
9. 그런 다음 소프트웨어가 각 선박에 대한 측정 데이터를 Excel 문서로 전송하여 이러한 값의 평균, 중앙값 및 표준 편차를 계산하는지 확인합니다(표 1 및 표 2).
10. 테이블의 모든 값을 선택하여 결과 테이블의 값을 스프레드시트 프로그램으로 이동합니다. 값을 스프레드시트에 붙여넣습니다.
11. 그래프를 플롯하고 선택한 스프레드시트 프로그램에 붙여넣은 데이터를 사용하여 통계 분석을 수행합니다( 재료 표 참조).

결과

그림 1은 테스트된 모든 마우스의 마우스 FFA 이미지에 적용된 망막 혈관을 분석하는 데 사용되는 프로세스를 보여줍니다. 광학 디스크의 두 배 큰 반경은 광학 디스크의 중심에서 시계 방향으로 원형 방향으로 픽셀의 강도를 측정하는 데 사용됩니다. 사용자가 지정한 임계값 위와 아래의 지점을 각각 발견할 때 픽셀을 시작 또는 끝 지점으로 표시합니다. 이것은 30번 반복되?...

토론

본 논문은 마우스 FA 이미지에서 망막 혈관 직경과 망막 혈관 구조를 분석하는 방법을 최초로 제시한 것이다. 망막 혈관의 이미지를 캡처하기 위해 안저 이미징만 사용되었기 때문에 이 방법에는 몇 가지 단점이 있으며, 그 중 하나는 이 연구에서 조사한 마우스의 망막 혈관의 표층에서의 변화만 추론할 수 있다는 것입니다. 더 깊은 층에서의 차이점은 아직 알려져 있지 않다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Tropicamide (Mydriacyl)	Alcon Inc Laboratories		Mydriatic agent
2% Methocel	OmniVision Eye Care		Hydroxypropryl methylcellulose gel
C57BL/6J	Jackson Laboratory	000664	Wild type mice
Excel for Microsoft 365	Microsoft Inc		Software package
Fluorescein sodium salt	Sigma-Aldrich	28803-100G	Fluorescent angiography
Matlab 8.0	The MathWorks, Inc.		Software package
Micron IV rodent fundus camera	Phoenix-Micron	40-2200	Fundus photography
Phenylephrine 10% w/v	Bausch & Lomb		Mydriatic agent
Phosphate Buffered Saline - 100 tablets	Gibco	18912-014	Dilution
Sigmaplot 13	Jandel Scientific Software		Software package
S-Ketamine, 25 mg/mL	Pfizer Inc.	PAA104470	Anesthesia IP