Mesure du diamètre des vaisseaux rétiniens à partir d’images d’angiographie par fluorescence de souris

Résumé

Le système vasculaire rétinien de souris est particulièrement intéressant pour comprendre les mécanismes de formation des motifs vasculaires. Ce protocole mesure automatiquement le diamètre des vaisseaux rétiniens de souris à partir d’images de fond d’œil d’angiographie fluorescente à une distance fixe du disque optique.

Résumé

Il est important d’étudier le développement de la vascularisation rétinienne dans les rétinopathies dans lesquelles une croissance anormale des vaisseaux peut finalement entraîner une perte de vision. Les mutations du gène du facteur de transcription associé à la microphtalmie (Mitf) montrent une hypopigmentation, une microphtalmie, une dégénérescence rétinienne et, dans certains cas, une cécité. L’imagerie in vivo de la rétine de la souris par des moyens non invasifs est vitale pour la recherche oculaire. Cependant, en raison de sa petite taille, l’imagerie du fond d’œil de la souris est difficile et peut nécessiter des outils spécialisés, de l’entretien et de la formation. Dans cette étude, nous avons développé un logiciel unique permettant d’analyser le diamètre des vaisseaux rétiniens chez la souris avec un programme automatisé écrit dans MATLAB. Des photographies du fond d’œil ont été obtenues à l’aide d’un système commercial de caméra de fond d’œil à la suite d’une injection intrapéritonéale d’une solution de sel de fluorescéine. Les images ont été modifiées pour améliorer le contraste, et le programme MATLAB a permis d’extraire automatiquement le diamètre vasculaire moyen à une distance prédéfinie du disque optique. Les changements vasculaires ont été examinés chez des souris de type sauvage et des souris présentant diverses mutations dans le gène Mitf en analysant le diamètre des vaisseaux rétiniens. Le programme MATLAB personnalisé développé ici est pratique, facile à utiliser et permet aux chercheurs d’analyser le diamètre moyen et le diamètre total moyen, ainsi que le nombre de vaisseaux du système vasculaire rétinien de souris, de manière pratique et fiable.

Introduction

Le lit vasculaire le plus étudié dans le corps est peut-être le système vasculaire rétinien. Grâce à une sophistication technique en constante amélioration, le système vasculaire rétinien est facilement photographié chez des patients vivants et utilisé dans de nombreux domaines de recherche¹. De plus, le système vasculaire rétinien de souris au cours du développement s’est avéré être un système modèle très efficace pour la recherche sur la biologie fondamentale de la croissance vasculaire. L’objectif principal du système vasculaire rétinien est de fournir à la partie interne de la rétine un soutien métabolique par le biais d’un réseau capillaire laminaire qui imprègne le tissu neural². Néanmoins, l’état de la rétine, et par conséquent tout dysfonctionnement ou atrophie, peut avoir des effets significatifs sur les bifurcations du système vasculaire rétinien et le diamètre des artères, démontrant une interaction entre les cellules rétiniennes et le système vasculaire ^3,4. On sait que de nombreuses affections oculaires, notamment la rétinopathie du prématuré (RDP), la rétinopathie diabétique (RD), la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), le glaucome et la néovascularisation cornéenne, peuvent entraîner une angiogenèse oculaire anormale⁵. Dans le cas du système vasculaire rétinien, les modèles murins de dégénérescence rétinienne présentent souvent des changements comparables à ceux observés dans les maladies vasculaires humaines ^6,7. La famille des supergènes Myc de facteurs de transcription fondamentaux hélice-boucle-hélice-fermeture éclair comprend le gène du facteur de transcription associé à la microphtalmie (Mitf) exprimé dans l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR)^8,9,10.

Il a été démontré que de nombreux organes, y compris l’œil, l’oreille, le système immunitaire, le système nerveux central, les reins, les os et la peau, sont régulés par Mitf 9,11,12,13. Nous avons découvert que la structure et la fonction de l’EPR sont affectées chez les souris porteuses de diverses mutations du gène Mitf, entraînant certains cas de dégénérescence rétinienne et, finalement, de perte de vision¹⁰. Récemment, il a été démontré que le nombre de vaisseaux et le diamètre des vaisseaux diffèrent significativement entre les souris mutantes Mitf et les souris de type sauvage¹⁴. Les chercheurs et les médecins peuvent maintenant quantifier avec précision le système vasculaire rétinien in vivo grâce aux développements de l’imagerie rétinienne. Depuis les années 1800, les chercheurs et les médecins ont profité des avantages de la visualisation du système vasculaire rétinien, et l’angiographie à la fluorescéine (AF) a montré à la fois le flux sanguin rétinien et la dégradation de la barrière hémato-rétinienne¹⁵.

Cet article explique comment analyser le diamètre des vaisseaux rétiniens à partir d’images AF de souris à l’aide d’un code personnalisé dans le logiciel MATLAB.

Protocole

Toutes les expériences ont été approuvées par l’Autorité alimentaire et vétérinaire islandaise (licence MAST n° 2108002). Toutes les études sur les animaux ont été menées conformément à la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) sur l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. Des souris C57BL/6J et Mitf^mi-vga9/+ mâles et femelles ont été utilisées dans cette étude. Des souris C57BL/6J (n = 7) ont été utilisées comme témoin. Les types sauvages ont été obtenus commercialement (voir la table des matériaux), mais toutes les souris mutantes (n = 7) ont été élevées dans des animaleries du Centre biomédical de l’Université d’Islande. Dans la présente étude, des animaux âgés de 3 mois ont été utilisés ; Cependant, le protocole s’applique même aux animaux de 1 mois et plus.

1. Préparation expérimentale

1. Préparez le mélange d’anesthésie. Prélever une ampoule d’une solution mère de kétamine de 2 mL (25 mg/mL) et d’une solution mère de xylazine de 250 μL (2 %) pour préparer une solution de travail d’un mélange de kétamine et de xylazine (25 mg/mL de kétamine et 20 mg/mL de xylazine) (voir le tableau des matières).
2. Anesthésier la souris avec une injection intrapéritonéale du mélange kétamine/xylazine, avec un volume de liquide égal à quatre fois le poids corporel de la souris ; par exemple, une souris pesant 20 g a besoin de 35 μL de solution de travail de xylazine/kétamine pour obtenir une dose de travail de xylazine (4 mg/kg de poids corporel) et de kétamine (40 mg/kg de poids corporel).
3. Dilater les pupilles avec un collyre de chlorhydrate de phényléphrine à 10 % et de tropicamide à 1 % immédiatement après l’anesthésie.
4. Attendez que l’animal soit complètement anesthésié et que ses pupilles soient largement dilatées.
5. Préparez une solution saline de fluorescéine. Ajouter 9 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; 1x) à 1 mL de solution de fluorescéine (concentration mère de 100 mg/mL) (voir le tableau des matières). La concentration finale de la solution de travail est de 10 mg/mL.

2. Imagerie in vivo du système vasculaire rétinien à l’aide d’un système d’imagerie rétinienne de rongeur

1. Administrer la solution de travail de fluorescéine par voie intrapéritonéale (5 μL/g de poids corporel) à l’animal anesthésié.
2. Appliquez une goutte de gel de méthylcellulose à 2 % sur la surface de la cornée, puis placez l’animal sur la platine de positionnement du système d’imagerie (voir le tableau des matériaux).
3. Positionnez l’objectif de la caméra d’imagerie rétinienne du fond d’œil de manière à ce qu’il touche directement et doucement la cornée de la souris. Pour placer la tête du nerf optique au milieu du champ visuel, ajustez légèrement l’alignement.
4. Passez au canal fluorescent vert sur la caméra du fond d’œil.
5. Concentrez-vous sur les vaisseaux rétiniens pour prendre des images.
6. Pour trouver le moment idéal, prenez un certain nombre de photos à 1, 3, 5 et 10 minutes (mais pas plus de 10 minutes) après l’injection de fluorescéine.
   REMARQUE : Le traitement AF doit être terminé dans les 10 minutes, car après cette période, la fluorescéine peut devenir trop diffuse et les vaisseaux deviennent indétectables.
7. À la fin de l’imagerie, alors que la souris est encore anesthésiée, euthanasiez-la par luxation cervicale.

3. Analyse du diamètre du vaisseau rétinien

1. Ouvrez le programme MATLAB (voir Table des matériaux).
2. Téléchargez et enregistrez le code « fundusDiameter.m » (voir Fichier de codage supplémentaire 1, Fichier de codage supplémentaire 2 et Fichier de codage supplémentaire 3).
3. Ouvrez le dossier dans lequel le code a été enregistré. Faites glisser le code et déposez-le sur le dossier actuel dans MATLAB.
4. Glissez-déposez l’image FFA (image d’angiographie par fluorescence du fond d’œil) ou les images que vous souhaitez analyser sur le dossier actuel dans MATLAB.
5. Appuyez sur l’outil Exécuter depuis la barre d’outils MATLAB.
6. Une fenêtre contextuelle apparaîtra. Écrivez le nom de fichier de l’image qui vous intéresse dans la zone Entrer le nom de fichier et appuyez sur OK.
   REMARQUE : Ne changez pas ou ne modifiez pas le reste des paramètres.
7. Sélectionnez le centre du disque optique, puis sélectionnez le bord du disque optique. Le logiciel calcule maintenant l’intensité des pixels dans les images du fond d’œil de la souris dans un cercle dont le rayon est le double de celui du disque optique, dans le sens des aiguilles d’une montre à partir du centre du disque optique (Figure 1).
8. Ensuite, assurez-vous que le logiciel trace le diamètre moyen (en pixels) de chaque récipient dans le fond d’œil en fonction du numéro de récipient (Figure 2).
9. Ensuite, assurez-vous que le logiciel transfère les données de mesure de chaque navire dans un document Excel, où la moyenne, la médiane et l’écart-type de ces valeurs sont calculés (tableau 1 et tableau 2).
10. Déplacez les valeurs de la table des résultats vers un tableur en sélectionnant toutes les valeurs de la table. Collez les valeurs dans la feuille de calcul.
11. Tracez les graphiques et effectuez des analyses statistiques à l’aide des données collées dans le tableur de votre choix (voir la Table des matériaux).

Résultats

La figure 1 montre le processus utilisé pour analyser le système vasculaire rétinien, qui est appliqué aux images FFA de souris de toutes les souris testées. Un rayon deux fois plus grand que le disque optique est utilisé pour mesurer l’intensité des pixels dans une direction circulaire, dans le sens des aiguilles d’une montre, à partir du centre du disque optique. Il marque les pixels avec un point de départ ou d’arrivée lorsqu’il rencontre des points au-dessus et en desso...

Discussion

Le présent article est le premier à présenter une méthode d’analyse du diamètre des vaisseaux rétiniens et de la vascularisation rétinienne à partir d’images d’AF de souris. Étant donné que seule l’imagerie du fond d’œil a été utilisée pour capturer des images du système vasculaire rétinien, la méthode présente plusieurs inconvénients, dont l’un est que l’on ne peut déduire des altérations dans les couches superficielles du système vasculaire rétinien que chez les souris examinées da...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Tropicamide (Mydriacyl)	Alcon Inc Laboratories		Mydriatic agent
2% Methocel	OmniVision Eye Care		Hydroxypropryl methylcellulose gel
C57BL/6J	Jackson Laboratory	000664	Wild type mice
Excel for Microsoft 365	Microsoft Inc		Software package
Fluorescein sodium salt	Sigma-Aldrich	28803-100G	Fluorescent angiography
Matlab 8.0	The MathWorks, Inc.		Software package
Micron IV rodent fundus camera	Phoenix-Micron	40-2200	Fundus photography
Phenylephrine 10% w/v	Bausch & Lomb		Mydriatic agent
Phosphate Buffered Saline - 100 tablets	Gibco	18912-014	Dilution
Sigmaplot 13	Jandel Scientific Software		Software package
S-Ketamine, 25 mg/mL	Pfizer Inc.	PAA104470	Anesthesia IP