JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام إصابة بوساطة FeCl3 للحث على تجلط الدم الشرياني ، وكيفية جمع وإعداد عينات إصابة الشرايين في مراحل مختلفة من تجلط الدم لتحليل المجهر الإلكتروني.

Abstract

أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفيات والمراضة في جميع أنحاء العالم. تجلط الدم الشاذ هو سمة شائعة للحالات الجهازية مثل مرض السكري والسمنة ، والأمراض الالتهابية المزمنة مثل تصلب الشرايين والسرطان وأمراض المناعة الذاتية. عند إصابة الأوعية الدموية ، عادة ما يعمل نظام التخثر والصفائح الدموية والبطانة بطريقة منسقة لمنع النزيف عن طريق تكوين جلطة في موقع الإصابة. تؤدي التشوهات في هذه العملية إما إلى نزيف مفرط أو تجلط غير منضبط / نشاط مضاد للتخثر غير كاف ، مما يترجم إلى انسداد الأوعية الدموية وعواقبها. يعد نموذج إصابة الشريان السباتي الناجم عن FeCl3 أداة قيمة في التحقق من كيفية بدء تجلط الدم وتقدمه في الجسم الحي. يتضمن هذا النموذج تلفا / تعرية بطانية وتشكيل جلطة لاحقة في الموقع المصاب. يوفر مقايسة كمية حساسة للغاية لمراقبة تلف الأوعية الدموية وتكوين الجلطات استجابة لدرجات مختلفة من تلف الأوعية الدموية. بمجرد تحسينها ، يمكن استخدام هذه التقنية القياسية لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء تجلط الدم ، وكذلك التغيرات الهيكلية في الصفائح الدموية في الخثرة المتنامية. هذا الفحص مفيد أيضا لدراسة فعالية العوامل المضادة للتخثر والمضادة للصفيحات. تشرح هذه المقالة كيفية بدء ومراقبة تجلط الدم الشرياني الناجم عن FeCl3 وكيفية جمع العينات لتحليلها بواسطة المجهر الإلكتروني.

Introduction

تجلط الدم هو تكوين جلطة دموية تسد الأوعية الدموية جزئيا أو كليا ، مما يعوق التدفق الطبيعي للدم. هذا يؤدي إلى أحداث القلب والأوعية الدموية الشديدة والمميتة ، مثل أمراض القلب الإقفارية والسكتات الدماغية. أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للمراضة والوفيات ، وتسبب واحدة من كل أربع وفيات في جميع أنحاء العالم1،2،3. على الرغم من أن تجلط الدم يتجلى كخلل في نظام الأوعية الدموية ، إلا أنه قد يكون نتيجة لعدوى ميكروبية أو فيروسية كامنة أو اضطراب مناعي أو ورم خبيث أو حالة استقلابية. يتم الحفاظ على تدفق الدم من خلال التفاعل المعقد بين المكونات المتنوعة لنظام الأوعية الدموية ، بما في ذلك الخلايا البطانية وخلايا الدم الحمراء / البيضاء والصفائح الدموية وعوامل التخثر4. عند إصابة الأوعية الدموية ، تتفاعل الصفائح الدموية مع البروتينات اللاصقة على المصفوفة تحت البطانية وتطلق محتوياتها الحبيبية ، والتي تجند المزيد من الصفائح الدموية5. في الوقت نفسه ، يتم تنشيط سلسلة التخثر ، مما يؤدي إلى تكوين الفيبرين وترسبه. في النهاية ، يتم تشكيل جلطة تحتوي على الصفائح الدموية وخلايا الدم الحمراء المحاصرة داخل شبكة الفيبرين6. على الرغم من توفر الأدوية المضادة للصفيحات ومضادات التخثر لتعديل تجلط الدم ، إلا أن النزيف الزائف لا يزال مصدر قلق كبير مع هذه العلاجات ، مما يتطلب ضبطا دقيقا لجرعات ومجموعات هذه الأدوية. وبالتالي ، لا تزال هناك حاجة ملحة لاكتشاف أدوية جديدة مضادة للتخثر7.

تمت دراسة تجلط الدم باستخدام طرق متعددة لإلحاق إصابة الأوعية الدموية: الميكانيكية (ربط الأوعية) ، الحرارية (إصابة الليزر) ، والإصابة الكيميائية (FeCl3 / تطبيق روز البنغال). تختلف طبيعة الجلطة اعتمادا على الموقع (الشرياني مقابل الوريدي) أو الطريقة أو مدى الإصابة. من بين كل هذه الأنواع ، تعد إصابة الأوعية الدموية التي يسببها FeCl3 هي الطريقة الأكثر استخداما. تم استخدامه في الفئران والجرذان والأرانب وخنازير غينيا والكلاب8،9،10،11،12. هذه الطريقة بسيطة نسبيا وسهلة الاستخدام ، وإذا تم توحيد المعلمات الرئيسية ، فهي حساسة وقابلة للتكرار في أنظمة الأوعية الدموية المختلفة (على سبيل المثال ، الشرايين [السباتي والفخذ] والأوردة [الوداجي] والشرايين [المشمرة والمساريقية]) (الجدول التكميلي 1).

يمكن أيضا استخدام هذا النموذج لتعزيز فهمنا لميكانيكا ومورفولوجيا تكوين الجلطات. توفر هذه التقنية بشكل فريد ميزة إيقاف تجلط الدم عند نقاط معدل التدفق المختلفة ، لدراسة المراحل المتوسطة من العملية قبل أن تصبح انسدادية. استخدمت التطورات الحديثة في أبحاث تجلط الدم هذا النموذج لتركيز الانتباه على الطرق غير الدوائية لانحلال الخثرة13 أو التوصيل غير الجراحي للعوامل المضادة للتخثر و / أو تحلل الفيبرين14،15. أظهرت عدة مجموعات أنه عندما يتم طلاء أغشية الصفائح الدموية بهذه العلاجات ، يمكن تنشيط الأدوية عند التحفيز الحراري لاستهداف الجلطات16. يمكن أن تكون التقنيات الموضحة هنا مفيدة لدراسات مثل التحقق من صحة نتائجها على مستوى الصفائح الدموية المفردة. في هذه المخطوطة ، يصف البروتوكول 1 الإجراء الأساسي لإصابة الأوعية الدموية بوساطة FeCl3 ، بينما يصف البروتوكول 2 طريقة جمع عينة إصابة الأوعية الدموية وإصلاحها لمزيد من التحليل بواسطة المجهر الإلكتروني.

Protocol

تمت مراجعة جميع التجارب التي تمت مناقشتها هنا والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) في جامعة كنتاكي.

ملاحظة: يتم سرد الأدوات الجراحية في الشكل 1 وجدول المواد. تم استخدام الفئران C57BL / 6J ، التي تتراوح أعمارها بين 8 و 10 أسابيع ، ذكر / أنثى أو سلالات ذات صلة تم التلاعب بها وراثيا (Knockout أو Knockin).

1. إصابة الشريان السباتي الناجم عن FeCl3

  1. تحريض تخدير الفأر
    1. وزن الماوس.
    2. تخدير الفأر عن طريق حقن 0.2 جم / كجم من محلول ثلاثي البرومو إيثانول داخل الصفاق (i.p.). تأكد من أن محلول التخدير في درجة حرارة الغرفة (RT) قبل حقنه. هذه الجرعة كافية لتخدير الماوس لمدة 1 ساعة تقريبا.
    3. تحقق من منعكس إصبع القدم عن طريق الضغط على إصبع القدم بعد 5 دقائق من الحقن للتأكد من تخدير الماوس. إذا لم يتم تخدير الماوس ، فسوف يسحب إصبع قدمه بعيدا. إذا حدث ذلك ، فانتظر 5 دقائق وتحقق مرة أخرى.
    4. إذا كان الفأر لا يزال غير مخدر تماما ، فقم بإدارة 1/4 الجرعة الأولية وانتظر لمدة 5 دقائق.
    5. طوال الإجراء ، راقب بشكل دوري مستوى التخدير للماوس عبر قرصة إصبع القدم. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا مراقبة معدل التنفس ودرجة حرارة الجسم للحفاظ على التخدير الأمثل.
  2. شل حركة الماوس
    1. ضع الماوس على وسادة التدفئة (37 درجة مئوية) في وضع ضعيف واستخدم شريطا لاصقا لشل حركة الأطراف.
    2. استخدم خيطا جراحيا (0.1 مم) لسحب الأسنان الأمامية العلوية للفأر برفق لتمديد منطقة عنق الرحم / الرقبة. هذا مهم لتحسين تصور المنطقة الجراحية واستقرار مسبار دوبلر. حجم الخيط ليس مهما ، لأنه يستخدم فقط لسحب الأسنان الأمامية للحيوان لتمديد الرقبة.
  3. شق
    1. رش المنطقة الجراحية بنسبة 70٪ من الإيثانول أو امسحها بمسح الكحول.
    2. باستخدام قطعة قطن ، ضع كمية صغيرة من كريم إزالة الشعر على المنطقة الجراحية. انتظر لمدة 1-2 دقيقة ثم استخدم منشفة ورقية مبللة أو منديل لإزالة الكريم.
      ملاحظة: هذه الخطوة مهمة لمنطقة جراحية نظيفة.
    3. باستخدام المقص والملقط (الشكل 1B11،1B13) ، قم بعمل شق في خط الوسط من الفك السفلي إلى الشق فوق القصي. اسحب الجلد للحصول على تصور أفضل للمنطقة (الشكل 2 أ).
  4. التعرض للشريان السباتي
    1. باستخدام الملقط الجراحي وملقط التشريح الدقيق ، قم بتشريح اللفافة السطحية المتراكبة وإزالتها لكشف الشريان السباتي الأيسر (الشكل 1B12،1B13). تأكد من عدم استخدام المقص في هذه المرحلة لتجنب إصابة الأوعية الدموية الأخرى في هذه المنطقة.
    2. إزالة الأنسجة الزائدة المحيطة بالشريان السباتي. تجنب التشريح المفرط للأنسجة المحيطة ، لأن هذه المنطقة تؤوي العصب المبهم والشريان الفقري.
    3. افصل الشريان السباتي عن الأنسجة المحيطة عن طريق تشريحه بالملقط الجراحي وربط الخيوط (الشكل 1B12،1B15،2C). تأكد من عدم تمديد الشريان أو سحبه لتجنب أي إصابة ميكانيكية للشريان أو الأوعية الدموية المحيطة.
    4. ضع قطعة من البلاستيك تحت الشريان لتحديد موقع الإصابة (الشكل 2 د). استخدم ورقة شفافة ملونة لتسهيل الرؤية في المجال الجراحي.
  5. وضع مسبار التدفق
    1. ضع مسبار التدفق عبر الصوتي دوبلر في محلول ملحي (0.9٪ كلوريد الصوديوم في dH2O) لمدة 10 دقائق قبل الجراحة. أدخل الطرف الآخر من المسبار في مرفق في مقياس التدفق لتسهيل قراءة التدفق. قم بتوصيل مقياس التدفق بجهاز كمبيوتر.
      ملاحظة: بين العمليات الجراحية ، يجب أن يكون مسبار التدفق عبر الصوتي دوبلر في محلول ملحي. تأكد من الحفاظ على المسبار رطبا ونظيفا طوال العملية.
    2. ضع مسبار التدفق عبر الصوتي دوبلر بالموجات فوق الصوتية حول الشريان في أعلى البلاستيك (الشكل 2 د). تأكد من أن منطقة حامل السفينة في المسبار ليست ممتدة للغاية (الشكل 1C ، السهم الأحمر).
      ملاحظة: إذا لزم الأمر ، ادعم المسبار بوسادات شاش (الشكل 1B1) لتحقيق ارتفاع مناسب للمسبار ، مما يسهل وضع القراءة الأمثل.
    3. إذا كانت المنطقة الجراحية جافة عند هذه النقطة ، أضف بضع قطرات من محلول ملحي RT للحفاظ على رطوبة المنطقة. راقب قراءة مسبار التدفق. تختلف القراءة المثلى لكل ويمكن أن تتراوح بين 0.6-1.2 مل / دقيقة. إذا كان أقل أو غير مستقر ، فقم بتغيير موضع مسبار التدفق للحصول على القراءة المثلى.
      ملاحظة: تأكد من أن عنق الماوس ليس ممتدا جدا ، وأن منطقة الجراحة نظيفة.
  6. تسجيل خط أساس التدفق
    1. بعد وضع المسبار ، راقب تدفق الدم لمدة 2 دقيقة للتأكد من أن التدفق ثابت. بعد ذلك ، سجل التدفق لمدة 2 دقيقة (الشكل 3 ب) كخط أساس. للحصول على وصف تفصيلي لمقياس التدفق ، راجع Subramaniam et al.17.
    2. لتسجيل تدفق الدم، ابدأ تشغيل برنامج WinDAQ. انقر فوق خيار الملف ثم انقر فوق تسجيل. قم بإنشاء مجلد وملف جديدين ، وابدأ التسجيل. لإيقاف التسجيل ، انقر فوق إيقاف في قسم الملف.
      ملاحظة: يتوفر برنامج WinDAQ مجانا من الناشر: https://www.dataq.com/products/windaq/.
  7. الإصابة
    1. أوقف تسجيل التدفق. تأكد من عدم تغيير موضع المسبار حتى تظل القراءات متسقة بعد الإصابة.
    2. جفف المنطقة جيدا بمنشفة مبللة / ورقية.
      ملاحظة: حتى كمية صغيرة من السائل المتبقي قد تغير تركيز محلول FeCl3 المستخدم لإلحاق إصابة الأوعية الدموية. هذا يؤدي إلى نتائج متغيرة ويؤثر على التكاثر. عندما تكون المنطقة جافة تماما ، لا يستطيع المسبار قياس التدفق.
    3. في قارب وزن بلاستيكي ، ضع ورقة ترشيح دائرية (قطرها 1 مم ، مقطوعة بقطر 1 مم). أضف 1 ميكرولتر من محلول FeCl3 بنسبة 6٪ (مصنوع في dH2O) على ورق الترشيح.
      ملاحظة: تأكد من إضافة محلول FeCl3 قبل استخدام ورق الترشيح مباشرة. قد يؤدي نقع الورق مبكرا جدا إلى تبخر محلول FeCl3 وتغيير شدة الإصابة.
    4. باستخدام ملقط رفيع ، التقط ورقة الترشيح وضعها على الشريان أعلى المسبار ، على جزء من الشريان الذي يتميز به البلاستيك (الشكل 2D ، E). هذا البلاستيك بمثابة علامة وفاصل. يميز المنطقة المصابة ويمنع التخفيف العرضي ل FeCl3 عن طريق تجنب ملامسة المنطقة الرطبة المحيطة.
      ملاحظة: تأكد من أن ورق الترشيح مستقيم وغير مقروص أو مطوي بأي شكل من الأشكال. بمجرد وضعها على الشريان ، لا تغير موضع ورق الترشيح ؛ القيام بذلك يغير مدى الإصابة.
    5. بعد وضع ورقة الترشيح ، ابدأ المؤقت وسجل تدفق الدم. بعد 3 دقائق ، قم بإزالة الورق وإضافة محلول ملحي في موقع الإصابة لإزالة FeCl3 وإيقاف عملية الإصابة. كما أنه يجعل المنطقة رطبة. في هذه المرحلة ، يجب أن يعود تدفق الدم إلى مستوى خط الأساس ، كما هو مسجل قبل الإصابة.
    6. راقب وسجل التدفق حتى ينخفض إلى 10٪ من التسجيل الأصلي أو يصل إلى الصفر. هناك انخفاض ثابت بمجرد أن تبدأ الجلطة في التكون في موقع الإصابة (الشكل 3C). لاحظ أي تقلبات كبيرة في التدفق خلال هذا الوقت.
    7. لدراسة استقرار الجلطة ، سجل الزيادة السريعة في تدفق الدم بعد كل انخفاض كبير وثابت. تصنف هذه الأحداث على أنها انصمام بسبب تجلط الدم غير المستقر (الشكل 4 د). بعد الانخفاض المستمر في التدفق ، يكون المشغل قادرا على رؤية الإصابة على الشريان عند انتهاء التجربة (الشكل 2F ، سهم أزرق / بيضاوي منقط).
    8. يتم تعريف وقت انسداد الأوعية الدموية على أنه التوقف التام لتدفق الدم لمدة 1 دقيقة على الأقل. سجل الوقت الذي تتشكل فيه خثرة انسداد ، كما هو موضح في القراءة الصفرية أو الانخفاض الكبير في التدفق.
    9. قم بإنهاء التجربة في 30 دقيقة. إذا لم تتشكل الجلطة في غضون 30 دقيقة من المراقبة ، فقم بتسجيل التدفق وإيقاف التسجيل وإزالة المسبار.
    10. نظف المسبار بنسبة 70٪ من الإيثانول وفرشاة لإزالة أي أنسجة / شعر أو حطام متبقي. جفف المسبار تماما قبل وضعه في صندوق التخزين. جفف المسبار تماما قبل وضعه في صندوق التخزين للتخزين على المدى الطويل.
    11. القتل الرحيم للفأر عن طريق خلع عنق الرحم. ضع الذبيحة في كيس التخلص من الذبيحة ، المسمى باسم المختبر والتاريخ.

2. جمع وإعداد العينات لدراسات المجهر الإلكتروني الماسح للوجه التسلسلي (SBF-SEM) بعد الإصابة التي يسببها FeCl3

ملاحظة: بروتوكول EM المقدم مناسب لإعداد العينة ل SBF-SEM. توفر تقنية التصوير هذه قدرة غير مسبوقة على دراسة البنية ثلاثية الأبعاد للصفائح الدموية في الجلطة. باستخدام هذه التقنية ، يتم تصور العينة كسلسلة من صور SEM المتسلسلة ، والتي يتم إنشاؤها مع تقدم المرء عبر العينة. النقاط الرئيسية لهذا التحضير هي: 1) يجب أن تكون العينة ملطخة بالمعادن الثقيلة قبل التضمين ؛ و 2) يجب قطع العينة البلاستيكية المدمجة بشكل مناسب للتركيب داخل SEM (انظر الشكل 6 للحصول على صورة مرئية للعينات المشذبة). تلطيخ ما بعد التضمين غير ممكن داخل SEM. عند جمع عينة من إصابة الأوعية الدموية التي يسببها FeCl3 لتحليل EM ، يجب إجراء التغييرات التالية أثناء إجراء الجراحة. التعديلات في بروتوكول جراحة FeCl3 المقدمة تنطبق أيضا على أي شكل من أشكال المجهر الإلكتروني. شروط التخدير وخطوات إجراء شق وكشف الشريان السباتي هي نفسها كما في البروتوكول 1.

  1. بعد تعريض الشريان السباتي ، حدد موقع الإصابة عن طريق تطويق المنطقة بشكل فضفاض بين خيطين جراحيين (الحجم: 0.1 مم) (الشكل 5 أ ، ب).
  2. ضع المسبار تحت الشريان ، بعيدا عن الخيط السفلي (الشكل 5C).
  3. أدخل القطعة البلاستيكية تحت الشريان بين الخيطين لتحديد موقع إصابة FeCl3 (الشكل 5C).
  4. خذ قياسات التدفق قبل إجراء الإصابة لملاحظة التدفق القاعدي. تستخدم هذه القياسات لتحديد المرحلة التي سيتم فيها جمع العينة.
    ملاحظة: تأكد من أن المثبت (3٪ بارافورمالدهيد / PFA + 0.1٪ جلوتارالدهيد ، كلاهما مصنوع في 1x PBS) جاهز وفي RT. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا استخدام التثبيت بنسبة 2.5٪ جلوتارالدهيد في خلفية مالحة.
    تنبيه: كل من بارافورمالدهيد وجلوتارالدهيد شديدا السمية ومهيجا. أثناء التعامل معها ، يجب استخدام القفازات ودرع العين والأقنعة للحماية من التعرض. جميع المحاليل المثبتة سامة ، ويجب تنفيذ خطوات التثبيت في غطاء الدخان.
  5. قم بإجراء الإصابة عن طريق وضع ورق ترشيح FeCl 3 المنقوع على الشريان (يتم استخدام 8٪ FeCl 3) لمدة3 دقائق (قد تختلف هذه المرة أيضا). بعد 3 دقائق ، قم بإزالة ورق الترشيح وإضافة محلول ملحي في موقع الإصابة لإزالة أي بقايا زائدة FeCl3. هذه الخطوة ضرورية لمنع المدى المتغير للإصابة ولتسهيل حساب التدفق بواسطة المسبار (الشكل 5 د).
  6. مراقبة قراءة التدفق. عندما ينخفض التدفق إلى أقل من 50٪ من القيمة الأولية ، قم بإزالة المسبار. جفف المنطقة بسرعة وأضف المثبت في المنطقة لإصلاح منطقة الإصابة خارجيا.
  7. أمسك الشريان على الفور بالقرب من منطقة الإصابة بالملقط ، واقطع مجرى الخيط السفلي والمنبع من الخيط العلوي. إذا لزم الأمر ، اطلب من شخص آخر المساعدة في قطع أحد طرفيه. ضع المنديل على طبق زراعة الأنسجة البلاستيكية في نفس الاتجاه الذي تم جمعه فيه ، وأضف بضع قطرات من المثبت.
    ملاحظة: يؤدي قطع الشريان إلى حدوث نزيف فوري واسع النطاق ، لذا تأكد من إمساك الشريان قبل قطعه في المرة الأولى. في هذا السيناريو، يتم التخلص من الماوس. يتم القتل الرحيم للفأر عن طريق الاستنزاف وخلع عنق الرحم.
  8. باستخدام مشرط ، قم بتنظيف الأنسجة الزائدة حول الشريان. انتبه لتسجيل اتجاه تدفق الدم. لتمييز ذلك ، قم بقص أحد طرفيه أفقيا والآخر مستدق / مائل (الشكل 5E).
  9. احتفظ بالعينة في المثبت (3٪ PFA و 0.1٪ جلوتارالدهيد) لمدة 1 ساعة في RT. بعد ذلك ، قم بتخزين العينة في 1٪ PFA عند 4 درجات مئوية حتى إرسالها على الثلج الرطب إلى معمل معالجة العينات لتحليل EM.
    ملاحظة: لا ينبغي تجميد العينات. التحديات التي تواجه هذه الطريقة في جمع العينات هي:
    1. قد لا تكون القراءة الأولية مثالية أو قد تتقلب بعد الإصابة. قد يؤثر هذا على مدى الإصابة التي يتم اختيارها للقبض عليها لتحليل EM. لمعالجة هذه المشكلة ، تأكد من تسجيل قراءة خط الأساس لبضع دقائق ، بعد تجربة أوضاع مختلفة لوضع المسبار لتحديد الموضع الأمثل.
    2. قد يضيف وقت إيقاف الإصابة عن طريق إضافة قطع مثبت خارجي وفعلي للقسم الشرياني للتحليل تباينا في مدى تجلط الدم. كن سريعا أثناء جمع العينات بعد التثبيت خارجيا.
  10. تلقي العينات للمعالجة لتحليل EM في 1٪ PFA على الثلج الرطب. اشطف العينات لمدة 3 دقائق ، على الثلج ، باستخدام 0.1 متر كاكوديلات عازلة لبدء مزيد من المعالجة.
  11. ثبت العينات لمدة ساعة واحدة على الجليد في 0.1 M كاكوديلات عازلة + 2.5٪ جلوتارالدهيد + 2 mM CaCl2.
  12. تخلص من المثبت واغسل العينات بمحلول كاكوديلات الصوديوم البارد 0.1 متر الذي يحتوي على 2 mM CaCl2 (5 × 3 دقائق) (الشكل 6A).
  13. ثبت العينات بمحلول الأوزميوم (3٪ فيروسيانيد البوتاسيوم [K 4 C 6 N6Fe] + 0.3 M cacodylate buffer + 4 mM CaCl 2 ممزوجا بحجم متساو من 4٪ رابع أكسيد الأوزميوم المائي [OsO4؛ في ddH2 O]) لمدة 1 ساعة على الجليد.
  14. أثناء تثبيت العينات ، اصنع محلول هيدرات ثلاثي كلورو أسيتالديهيد (TCH) طازج بنسبة 1٪ في ddH2O. احتضان المحلول عند 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة أثناء الخلط برفق.
  15. بعد التثبيت ، اغسل العينات باستخدام ddH2O في RT لمدة 5 × 3 دقائق.
  16. احتضان العينات في محلول TCH المصفى 1٪ (مصنوع في ddH2O) لمدة 20 دقيقة في RT.
  17. اغسل العينات باستخدام ddH2O في RT (5 × 3 دقائق).
  18. ثبت العينات في رابع أكسيد الأوزميوم 2٪ في ddH2O لمدة 30 دقيقة في RT.
  19. اغسل العينات باستخدام ddH2O في RT لمدة 5 × 3 دقائق لكل منها.
  20. ضع العينات في أسيتات يورانيل 1٪ (مائي) واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  21. اغسل العينات باستخدام ddH2O في RT لمدة 5 × 3 دقائق لكل منها ، وقم بمعالجتها باستخدام تلطيخ الأسبارتات الرصاص من Walton.
  22. En bloc تلطيخ الأسبارتات الرصاص والتون3:
    1. اصنع 30 mM L- محلول حمض الأسبارتيك في ddH2O.
      ملاحظة: يذوب حمض الأسبارتيك بسرعة أكبر إذا تم رفع الرقم الهيدروجيني إلى 3.8. حل المخزون هذا مستقر لمدة 1-2 أشهر إذا تم تبريده.
    2. اصنع محلول نترات الرصاص 20 mM في 10 مل من مخزون حمض الأسبارتيك ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 5.5 مع 1 N KOH.
    3. ضع العينات في محلول أسبارتات الرصاص على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، بعد خمس غسلات باستخدام ddH2O في RT ، كل منها لمدة 3 دقائق.
  23. تجفيف العينات مع سلسلة الإيثانول المتدرجة. استخدم الجفاف الكيميائي بواسطة بروتوكول Valdivia18.
    1. اغسل العينات في كل من المحاليل التالية لتجفيف العينة تدريجيا (الشكل 6 ب):
      25٪ كحول إيثيلي لمدة 3 دقائق
      50٪ كحول إيثيلي لمدة 3 دقائق
      75٪ كحول إيثيلي لمدة 3 دقائق
      95٪ كحول إيثيلي لمدة 3 دقائق
      100٪ كحول إيثيلي لمدة 10 دقائق ، وكرر الخطوة مرتين (إجمالي ثلاث غسلات).
  24. اغسل العينات في 100٪ أكسيد البروبيلين (PO) لمدة 10 دقائق ، وكرر الخطوة مرتين (إجمالي ثلاث غسلات).
  25. احتضان 50٪ / 50٪ PO / راتنج مع منشط DMP 30 طوال الليل في RT ، وقم بتضمينه في 100٪ Araldite 502 / embed 812 / DDSA مع منشط DMP30 لمدة 48 ساعة.

النتائج

يتم تقديم البيانات بشكل عام كوقت للانسداد ، أو الوقت اللازم لتشكيل خثرة انسداد كامل. يمكن رسم هذه البيانات كمنحنى بقاء كابلان-ماير (الشكل 4 أ)19 ، أو مخطط نقطي به أشرطة توضح تدفق الدم النهائي في وقت توقف تدفق الدم أو إنهاء التجربة (الشكل 4 ب) ، أو كرسم بياني خطي (

Discussion

التطبيق الموضعي ل FeCl3 على الأوعية الدموية للحث على تجلط الدم هو تقنية مستخدمة على نطاق واسع ، وكان له دور فعال في إنشاء أدوار لمستقبلات الصفائح الدموية المختلفة ، ومسارات إشارات الرباط ، ومثبطاتها20،21،22،23. الآلية ...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح يتعلق بهذه الدراسة.

ملفات تعريف ORCID: S.J.: 0000-0001-6925-2116 ؛ سو.د.: 00000-0001-5577-0473.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون أعضاء مختبر وايت هارت على اطلاعهم الدقيق على هذه المخطوطة. تم دعم العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة ، NHLBI (HL56652 ، HL138179 ، و HL150818) ، وجائزة الاستحقاق من وزارة شؤون المحاربين القدامى إلى S.W.W. ، R01 HL 155519 إلى BS ، ومنحة برنامج NIBIB الداخلي إلى R.D.L.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% Saline Fisher Scientific BP358-212NaCl used to make a solution of 0.9% saline 
1 mL Syringe Becton, Dickinson and Company 309659
190 Proof Ethanol KOPTECV1101 Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery 
2,2,2 TribromoethanolSigma Aldrich48402
25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0)DEKNATEL136082-1204
26G x 3/8 Needle Becton, Dickinson and Company 305110
2-methyl-2-butanolSigma Aldrich240486
7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mLGlobe Scientific Inc.135010
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)MedlineMDS090735
Araldite GY 502 Electron microscopy Services 10900
Cell Culture Dish 35mm X 10mm Corning Incorporated 430165
Compact Scale Ward's Science 470314-390
Dissecting Scissors, 12.5 cm longWorld Precision Instrument15922-G
DMP-30 activator Electron microscopy Services 13600
Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSAElectron microscopy Services 13700
Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bagCrown Products PP-RB-200
Doppler FlowProbeTransonic Systems Inc.MA0.5PSB
EMBED 812 resin Electron microscopy Services 14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof Electron microscopy Services 15055
Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide TipsIntegra Miltex18-784
Filter Paper VWR28310-106
Fine Scissors - Sharp-BluntFine Science Tools 14028-10
Finger Loop Ear Punches Fine Science Tools 24212-01
Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply Dukal Corporation2128
Glutaraldehyde (10% solution)Electron microscopy Services 16120
Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10Integra® Miltex®4110
Iron (III) Chloride SIGMA-ALDRICH157740-100G
Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3Integra Lifesciences 157510
L-aspartic acidSigma Fisher A93100
L-aspartic acidFisher Scientific BP374-100
Lead Nitrate Fisher Scientific L-62
LEICA S8AP0 MicroscopeLEICANo longer availableNo longer available from the company
LEICA S8AP0 Microscope Stand LEICA10447255No longer available from the company
Light-Duty Tissue Wipers VWR82003-822
Micro Dissecting Forceps; 1x2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" LengthRoboz Surgical Instrument CompanyRS-5157
Osmium Tetroxide 4% aqueous solution Electron microscopy Services 19150
Paraformaldehyde (16% solution)Electron microscopy Services 15710
Potassium ferricyanideSIGMA-ALDRICHP-8131
Propylene Oxide, ACS reagent Electron microscopy Services 20401
Rainin Classic Pipette PR-10Rainin17008649
Research Flowmeter Transonic Systems Inc.T402B01481Model: T402
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", ClearScotch 305289
Small Animal Heated PadK&H Manufacturing Inc.Model: HM10
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4Electron microscopy Services 11623
Sterile Cotton Tipped Applicators Puritan Medical Products 25-806 1WC
Steromaster Illuminator Fisher Scientific 12-562-21No longer available from the company
Surgical Dumont #7 Forceps Fine Science Tools 11271-30
Thiocarbohydrazide (TCH)SIGMA-ALDRICH88535
Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL)VWR76323-394
Uranyl AcetateElectron microscopy Services 22400
Veet Gel Cream Hair RemoverReckitt Benckiser3116875
White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mmFisher Scientific S38975
WinDAQ/100 Software for WindowsDATAQ Instruments, Inc.Version 3.38Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/
ZEISS AxioCam Icc 1ZEISS57615

References

  1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
  2. Raskob, G. E., et al. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (11), 2363-2371 (2014).
  3. Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
  4. Palta, S., Saroa, R., Palta, A. Overview of the coagulation system. Indian Journal of Anaesthesia. 58 (5), 515-523 (2014).
  5. Joshi, S., Whiteheart, S. W. The nuts and bolts of the platelet release reaction. Platelets. 28 (2), 129-137 (2017).
  6. Periayah, M. H., Halim, A. S., Mat Saad, A. Z. Mechanism action of platelets and crucial blood coagulation pathways in hemostasis. International Journal of Hematology-Oncology and Stem Cell Research. 11 (4), 319-327 (2017).
  7. Alexopoulos, D., Katogiannis, K., Sfantou, D., Lekakis, J. Combination antiplatelet treatment in coronary artery disease patients: A necessary evil or an overzealous practice. Platelets. 29 (3), 228-237 (2018).
  8. Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).
  9. Denis, C. V., et al. Towards standardization of in vivo thrombosis studies in mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (8), 1641-1644 (2011).
  10. Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thrombosis and Haemostasis. 79 (3), 656-662 (1998).
  11. Kato, Y., et al. Inhibition of arterial thrombosis by a protease-activated receptor 1 antagonist, FR171113, in the guinea pig. European Journal of Pharmacology. 473 (2-3), 163-169 (2003).
  12. Huttinger, A. L., et al. Ferric chloride-induced canine carotid artery thrombosis: a large animal model of vascular injury. Journal of Visualized Experiments. (139), e57981 (2018).
  13. Zhang, W., et al. Antithrombotic therapy by regulating the ROS-mediated thrombosis microenvironment and specific nonpharmaceutical thrombolysis Using Prussian blue nanodroplets. Small. 18 (15), 2106252 (2022).
  14. Liu, B., et al. Platelet membrane cloaked nanotubes to accelerate thrombolysis by thrombus clot-targeting and penetration. Small. , 2205260 (2022).
  15. Refaat, A., et al. Near-infrared light-responsive liposomes for protein delivery: Towards bleeding-free photothermally-assisted thrombolysis. Journal of Controlled Release. 337, 212-223 (2021).
  16. Li, S., et al. Biomimetic nanoplatelets to target delivery hirudin for site-specific photothermal/photodynamic thrombolysis and preventing venous thrombus formation. Small. 18 (51), 2203184 (2022).
  17. Subramaniam, S., Kanse, S. M. Ferric chloride-induced arterial thrombosis in mice. Current Protocols in Mouse Biology. 4 (4), 151-164 (2014).
  18. Cocchiaro, J. L., Kumar, Y., Fischer, E. R., Hackstadt, T., Valdivia, R. H. Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (27), 9379-9384 (2008).
  19. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric-estimation from incomplete observations. Journal of the American Statistical Association. 53 (282), 457-481 (1958).
  20. Chauhan, A. K., Kisucka, J., Lamb, C. B., Bergmeier, W., Wagner, D. D. von Willebrand factor and factor VIII are independently required to form stable occlusive thrombi in injured veins. Blood. 109 (6), 2424-2429 (2007).
  21. Andre, P., et al. CD40L stabilizes arterial thrombi by a beta3 integrin--dependent mechanism. Nature Medicine. 8 (3), 247-252 (2002).
  22. Ni, H., et al. Persistence of platelet thrombus formation in arterioles of mice lacking both von Willebrand factor and fibrinogen. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 385-392 (2000).
  23. Bergmeier, W., et al. The role of platelet adhesion receptor GPIbalpha far exceeds that of its main ligand, von Willebrand factor, in arterial thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16900-16905 (2006).
  24. Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126 (6), 817-824 (2015).
  25. Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (4), 779-789 (2011).
  26. Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P. F., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. Journal of Biological Chemistry. 284 (19), 13110-13118 (2009).
  27. Shim, Y., et al. Characterization of ferric chloride-induced arterial thrombosis model of mice and the role of red blood cells in thrombosis acceleration. Yonsei Medical Journal. 62 (11), 1032-1041 (2021).
  28. Ghosh, S., et al. Evaluation of the prothrombotic potential of four-factor prothrombin complex concentrate (4F-PCC) in animal models. PLoS One. 16 (10), 0258192 (2021).
  29. Wilbs, J., et al. Cyclic peptide FXII inhibitor provides safe anticoagulation in a thrombosis model and in artificial lungs. Nature Communications. 11 (1), 3890 (2020).
  30. Wei, Y., Deng, X., Sheng, G., Guo, X. B. A rabbit model of cerebral venous sinus thrombosis established by ferric chloride and thrombin injection. Neuroscience Letters. 662, 205-212 (2018).
  31. Jacob-Ferreira, A. L., et al. Antithrombotic activity of Batroxase, a metalloprotease from Bothrops atrox venom, in a model of venous thrombosis. International Journal of Biological Macromolecules. 95, 263-267 (2017).
  32. Zhou, X., et al. A rabbit model of cerebral microembolic signals for translational research: preclinical validation for aspirin and clopidogrel. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (9), 1855-1866 (2016).
  33. Yang, X., et al. Effect of evodiamine on collagen-induced platelet activation and thrombosis. BioMed Research International. 2022, 4893859 (2022).
  34. Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).
  35. Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric chloride-induced murine thrombosis models. Journal of Visualized Experiments. (115), e54479 (2016).
  36. Holly, S. P., et al. Ether lipid metabolism by AADACL1 regulates platelet function and thrombosis. Blood Advances. 3 (22), 3818-3828 (2019).
  37. Bird, J. E., et al. Prediction of the therapeutic index of marketed anti-coagulants and anti-platelet agents by guinea pig models of thrombosis and hemostasis. Thrombosis Research. 123 (1), 146-158 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

193

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved