פקקת עורקים המושרה על ידי ברזל כלוריד ואיסוף דגימות לניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים תלת ממדי

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד להשתמש בפציעה בתיווך FeCl₃ כדי לגרום לפקקת עורקים, וכיצד לאסוף ולהכין דגימות פגיעה עורקית בשלבים שונים של פקקת לצורך ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים.

Abstract

מחלות לב וכלי דם הן גורם מוביל לתמותה ותחלואה ברחבי העולם. פקקת חריגה היא תכונה נפוצה של מצבים סיסטמיים כמו סוכרת והשמנת יתר, ומחלות דלקתיות כרוניות כמו טרשת עורקים, סרטן ומחלות אוטואימוניות. בעת פגיעה בכלי הדם, בדרך כלל מערכת הקרישה, טסיות הדם והאנדותל פועלים באופן מתוזמר למניעת דימום על ידי יצירת קריש במקום הפגיעה. הפרעות בתהליך זה מובילות לדימום מוגזם או פקקת בלתי מבוקרת / פעילות אנטי-טרומבוטית לא מספקת, המתורגמת לחסימת כלי דם ולהמשך שלה. מודל פציעת התרדמה המושרה על ידי FeCl₃ הוא כלי רב ערך בחקירת האופן שבו פקקת מתחילה ומתקדמת in vivo. מודל זה כולל נזק/דנודציה של אנדותל והיווצרות קריש דם לאחר מכן באתר הפגוע. הוא מספק בדיקה כמותית רגישה ביותר לניטור נזק לכלי דם והיווצרות קריש דם בתגובה לדרגות שונות של נזק לכלי הדם. לאחר אופטימיזציה של טכניקה סטנדרטית זו, ניתן להשתמש בה כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס פקקת, כמו גם את השינויים האולטרה-מבניים בטסיות הדם בפקקת הולכת וגדלה. בדיקה זו שימושית גם כדי ללמוד את היעילות של סוכני antithrombotic ו antiplatelet. מאמר זה מסביר כיצד ליזום ולנטר פקקת עורקים FeCl₃ וכיצד לאסוף דגימות לניתוח במיקרוסקופ אלקטרונים.

Introduction

פקקת היא היווצרות של קריש דם שחוסם באופן חלקי או מלא כלי דם, ומעכב את הזרימה הטבעית של הדם. זה מוביל לאירועים קרדיווסקולריים חמורים וקטלניים, כגון מחלת לב איסכמית ושבץ. מחלות לב וכלי דם הן הגורם המוביל לתחלואה ולתמותה, וגורמות לאחד מכל ארבעה מקרי מוות ברחבי העולם ^1,2,3. למרות פקקת מתבטאת כתפקוד לקוי של מערכת כלי הדם, זה יכול להיות תוצאה של זיהום מיקרוביאלי או ויראלי הבסיסי, הפרעה חיסונית, ממאירות, או מצב מטבולי. זרימת הדם נשמרת על ידי אינטראקציה מורכבת בין מרכיבים שונים של מערכת כלי הדם, כולל תאי אנדותל, תאי דם אדומים/לבנים, טסיות דם וגורמי קרישה⁴. במקרה של פגיעה בכלי הדם, טסיות הדם מתקשרות עם חלבוני הדבק על המטריצה התת-אנדותלית ומשחררות את תכולתן הגרגירית, אשר מגייסת יותר טסיות⁵. במקביל, מפל הקרישה מופעל, המוביל להיווצרות פיברין ותצהירו. בסופו של דבר, נוצר קריש דם, המכיל טסיות דם ותאי דם אדומים הכלואים בתוך רשת פיברין⁶. למרות שתרופות נוגדות טסיות ונוגדות קרישה זמינות כדי לווסת פקקת, דימום מזויף נותר דאגה מרכזית בטיפולים אלה, הדורשים כוונון עדין של המינונים והשילובים של תרופות אלה. לכן, יש עדיין צורך דחוף לגלות תרופות אנטי טרומבוטיות חדשות⁷.

פקקת נחקרת במספר שיטות לגרימת פגיעה בכלי הדם: מכנית (קשירת כלי דם), תרמית (פגיעה בלייזר) ופגיעה כימית (FeCl₃/Rose Bengal application). אופי הפקקת משתנה בהתאם למיקום (עורקי לעומת ורידי), שיטה או היקף הפגיעה. בין כל הסוגים הללו, FeCl 3-induced vascular injury היא השיטה הנפוצה ביותר. הוא שימש בעכברים, חולדות, ארנבות, שרקנים וכלבים 8,9,10,11,12. השיטה פשוטה יחסית, קלה לשימוש, ואם הפרמטרים העיקריים מתוקננים, היא רגישה וניתנת לשחזור במערכות כלי דם שונות (למשל, עורקים [קרוטיד ועצם הירך], ורידים [jugular] ועורקים [cremaster ו mesenteric]) (טבלה משלימה 1).

מודל זה יכול לשמש גם כדי לקדם את הבנתנו את המכניקה והמורפולוגיה של היווצרות קרישי דם. טכניקה זו מציעה באופן ייחודי את היתרון של עצירת פקקת בנקודות קצב זרימה שונות, כדי ללמוד את שלבי הביניים של התהליך לפני שהוא הופך להיות חוסם. ההתקדמות האחרונה במחקר פקקת השתמשה במודל זה כדי למקד את תשומת הלב בשיטות לא פרמקולוגיות של טרומבוליזה¹³ או משלוח לא פולשני של חומרים אנטי טרומבוטיים ו / או פיברינוליטיים^14,15. מספר קבוצות הראו כי כאשר קרומי טסיות הדם מצופות בטיפולים אלה, ניתן להפעיל את התרופות בגירוי תרמי כדי להתמקד בקרישי דם¹⁶. הטכניקות המתוארות כאן יכולות להיות שימושיות למחקרים כגון אימות ממצאיהם ברמת טסיות הדם היחידה. בכתב יד זה, פרוטוקול 1 מתאר את ההליך הבסיסי של פגיעה בכלי דם בתיווך FeCl₃, ואילו פרוטוקול 2 מתאר את השיטה לאסוף ולתקן את דגימת הפגיעה בכלי הדם לניתוח נוסף במיקרוסקופ אלקטרונים.

Protocol

כל הניסויים הנדונים כאן נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת קנטקי.

הערה: כלי ניתוח מפורטים באיור 1 ובטבלת החומרים. נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J, בני 8-10 שבועות, זכר/נקבה או זנים רלוונטיים שעברו מניפולציה גנטית (נוקאאוט או נוקין).

1. פגיעה בעורק התרדמה_{הנגרמת על ידי FeCl 3}

1. השראת הרדמה בעכבר
   1. שקלו את העכבר.
   2. מרדימים את העכבר על ידי הזרקת 0.2 גרם / ק"ג תמיסת tribromoethanol intraperitoneally (i.p). ודא שתמיסת ההרדמה היא בטמפרטורת החדר (RT) לפני הזרקתה. מינון זה מספיק כדי להרגיע את העכבר במשך כ 1 שעה.
   3. בדוק את רפלקס הבוהן על ידי צביטת הבוהן 5 דקות לאחר ההזרקה כדי לוודא שהעכבר מורדם. אם העכבר אינו מורדם, הוא ימשוך את הבוהן שלו משם. אם זה קורה, המתן 5 דקות ובדוק שוב.
   4. אם העכבר עדיין לא הרגיע לחלוטין, לנהל 1/4 של המנה הראשונית ולחכות 5 דקות.
   5. במהלך ההליך, מעת לעת לפקח על מישור ההרדמה של העכבר באמצעות צביטת בוהן. בנוסף, ניתן לעקוב אחר קצב הנשימה וטמפרטורת הגוף כדי לשמור על הרדמה אופטימלית.
2. לשתק את העכבר
   1. הניחו את העכבר על כרית החימום (37°C) במצב שכיבה והשתמשו בסרט הדבקה כדי לשתק את הגפיים.
   2. השתמש בחוט כירורגי (0.1 מ"מ) כדי למשוך בעדינות את השיניים הקדמיות העליונות של העכבר כדי להאריך את אזור צוואר הרחם / הצוואר. זה חשוב להדמיה טובה יותר של אזור הניתוח ויציבות של בדיקת דופלר. גודל החוט אינו חשוב, מכיוון שהוא משמש רק כדי למשוך את השיניים הקדמיות של החיה כדי להאריך את הצוואר.
3. החתך
   1. רססו את אזור הניתוח באתנול 70% או נגבו אותו במגבון אלכוהול.
   2. בעזרת צמר גפן, יש למרוח כמות קטנה של קרם להסרת שיער על אזור הניתוח. המתן 1-2 דקות ולאחר מכן השתמש במגבת נייר רטובה או טישו כדי להסיר את הקרם.
      הערה: שלב זה חשוב לאזור כירורגי נקי.
   3. בעזרת מספריים ומלקחיים (איור 1B11,1B13), בצעו חתך בקו האמצע מהלסת התחתונה לחריץ העל-חזה. משכו את העור לאחור כדי לקבל הדמיה טובה יותר של האזור (איור 2A).
4. חשיפה לעורק התרדמה
   1. באמצעות מלקחיים כירורגיים ומלקחיים לניתוח זעיר, נתחו את הפאשיה השטחית המכסה והסירו אותה כדי לחשוף את עורק התרדמה השמאלי (איור 1B12,1B13). הקפידו לא להשתמש במספריים בשלב זה כדי להימנע מפגיעה בכלי דם אחרים באזור זה.
   2. הסר רקמות נוספות העוטפות את עורק התרדמה. הימנע דיסקציה מוגזמת של הרקמה שמסביב, שכן אזור זה מכיל את עצב הואגוס ואת עורק החוליות.
   3. הפרידו את עורק התרדמה מהרקמה הסובבת אותו על-ידי ניתוחו באמצעות מלקחיים כירורגיים וקושרי תפרים (איור 1B12,1B15,2C). הקפד לא להאריך או למשוך את העורק כדי למנוע כל פגיעה מכנית בעורק או בכלי הדם שמסביב.
   4. הניחו חתיכת פלסטיק מתחת לעורק כדי לסמן את מיקום הפציעה (איור 2D). השתמש בדף שקיפות צבעוני כדי להקל על הראייה בשדה הניתוח.
5. מיקום בדיקת הזרימה
   1. הניחו את בדיקת הזרימה הטרנסונית דופלר בתמיסת מלח (0.9% NaCl ב-dH₂O) למשך כ-10 דקות לפני הניתוח. הכנס את הקצה השני של הגשושית לקובץ מצורף במד הזרימה כדי להקל על קריאת הזרימה. חבר את מד הזרימה למחשב.
      הערה: בין ניתוחים, בדיקת הזרימה הטרנסונית של דופלר צריכה להיות במי מלח. הקפידו לשמור על הבדיקה לחה ונקייה לאורך כל ההליך.
   2. הניחו את בדיקת הזרימה הטרנסונית של דופלר האולטרסאונד סביב העורק במעלה הזרם של הפלסטיק (איור 2D). ודאו שאזור מחזיק כלי השיט של הגשושית אינו מורחב מדי (איור 1C, חץ אדום).
      הערה: במידת הצורך, תמכו בבדיקה עם רפידות גזה (איור 1B1) כדי להשיג גובה מתאים של הגשוש, מה שיקל על תנוחת הקריאה האופטימלית.
   3. אם אזור הניתוח יבש בשלב זה, הוסיפו כמה טיפות של מי מלח RT כדי לשמור על האזור לח. עקוב אחר קריאת בדיקת הזרימה. הקריאה האופטימלית משתנה עבור כל בעל חיים ויכולה להיות בין 0.6-1.2 מ"ל/דקה. אם הוא פחות או לא יציב, שנה את מיקום בדיקת הזרימה כדי לקבל קריאה אופטימלית.
      הערה: ודא שצוואר העכבר אינו מוארך מדי, ושאזור הניתוח נקי.
6. הקלט את קו הבסיס של הזרימה
   1. לאחר ביצוע הבדיקה, עקוב אחר זרימת הדם במשך 2 דקות כדי לוודא שהזרימה יציבה. לאחר מכן, תיעדו את הזרימה במשך 2 דקות (איור 3B) כקו בסיס. לתיאור מפורט של מד הזרימה, עיין ב- Subramaniam et ^al.17.
   2. כדי להקליט את זרימת הדם, הפעל את תוכנת WinDAQ. לחץ על קובץ אפשרות ולאחר מכן לחץ על הקלט. צור תיקיה וקובץ חדשים והתחל להקליט. כדי לעצור את ההקלטה, לחץ על עצור בקטע הקובץ.
      הערה: תוכנת WinDAQ זמינה באופן חופשי מהמוציא לאור: https://www.dataq.com/products/windaq/.
7. פציעה
   1. עצור את הקלטת הזרימה. הקפד לא לשנות את מיקום הבדיקה כך שהקריאות יישארו עקביות לאחר הפציעה.
   2. יבשו את האזור ביסודיות עם מגבון/מגבת נייר.
      הערה: אפילו כמות קטנה של נוזל שיורי עלולה לשנות את הריכוז של תמיסת FeCl₃ המשמשת לגרימת פגיעה בכלי הדם. זה מוביל לתוצאות משתנות ומשפיע על יכולת השחזור. כאשר האזור יבש לחלוטין, הגשושית אינה מסוגלת למדוד את הזרימה.
   3. בסירת שקילה מפלסטיק, שים נייר סינון עגול (קוטר 1 מ"מ, חתוך עם ניקוב אוזניים בקוטר 1 מ"מ). יש להוסיף 1 μL של תמיסת FeCl₃ 6% (מיוצרת ב-dH₂O) על נייר הסינון.
      הערה: הקפד להוסיף פתרון FeCl₃ ממש לפני השימוש בנייר הסינון. השריית הנייר מוקדם מדי עלולה להוביל לאידוי תמיסת FeCl₃ ולשנות את חומרת הפגיעה.
   4. בעזרת מלקחיים עדינים, הרימו את נייר הסינון והניחו אותו על העורק במעלה הזרם של הגשוש, על החלק של העורק המסומן על-ידי הפלסטיק (איור 2D,E). פלסטיק זה משמש כסמן וספייסר. הוא מסמן את האזור הפגוע ומונע דילול מקרי של FeCl₃ על ידי הימנעות ממגע עם האזור הלח שמסביב.
      הערה: ודא שנייר הסינון ישר, לא מכווץ או מקופל בדרך אחרת. לאחר שהונח על העורק, אל תשנה את המיקום של נייר הסינון; פעולה זו משנה את היקף הפגיעה.
   5. לאחר הנחת נייר הסינון, הפעל את הטיימר ורשום את זרימת הדם. לאחר 3 דקות, הסר את הנייר והוסף מי מלח במקום הפציעה כדי להסיר את FeCl₃ ולעצור את תהליך הפציעה. זה גם עושה את האזור לח. בשלב זה, זרימת הדם צריכה לחזור לרמה הבסיסית, כפי שנרשם לפני הפציעה.
   6. נטר והקלט את הזרימה עד שהיא מצטמצמת ל -10% מההקלטה המקורית או מגיעה לאפס. יש ירידה מתמדת ברגע שהפקקת מתחילה להיווצר באתר הפציעה (איור 3C). שימו לב לתנודות משמעותיות בזרימה במהלך תקופה זו.
   7. כדי ללמוד את יציבות פקקת, לרשום את העלייה המהירה בזרימת הדם לאחר כל ירידה משמעותית ועקבית. האירועים האלה מסווגים כתסחיף עקב פקקת לא יציבה (איור 4D). לאחר ירידה עקבית בזרימה, המפעיל מסוגל לראות את הפגיעה בעורק בסיום הניסוי (איור 2F, חץ כחול/אליפסה מנוקדת).
   8. זמן חסימת כלי הדם מוגדר כהפסקה מוחלטת של זרימת הדם למשך דקה אחת לפחות. רשום את הזמן שבו נוצר פקקת חסימה, כפי שמוצג על ידי קריאת אפס או ירידה משמעותית בזרימה.
   9. סיים את הניסוי ב -30 דקות. אם הפקקת אינה נוצרת תוך 30 דקות מהניטור, הקלט את הזרימה, עצור את ההקלטה והסר את הבדיקה.
   10. נקו את הבדיקה עם אתנול 70% ומברשת כדי להסיר שאריות רקמה/שיער או לכלוך. יבש את הבדיקה לחלוטין לפני הצבתה בקופסת האחסון. יבשו את הבדיקה לחלוטין לפני הכנסתה לקופסת האחסון לאחסון לטווח ארוך.
   11. הרדימו את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם. הניחו את הפגר בשקית לסילוק הפגרים, עם תווית שם המעבדה והתאריך.

2. איסוף והכנת דגימות למחקרי מיקרוסקופ אלקטרונים לסריקת פנים טורית (SBF-SEM) לאחר FeCl 3-induced Injury

הערה: פרוטוקול EM המוצג מתאים להכנת דגימה עבור SBF-SEM. טכניקת הדמיה זו מציעה יכולת חסרת תקדים לחקור את המבנה התלת-ממדי של טסיות הדם בקריש. בטכניקה זו, הדגימה מוצגת באופן חזותי כסדרה של תמונות SEM בלוק רציפות, הנוצרות ככל שמתקדמים בדגימה. נקודות עיקריות להכנה זו הן: 1) הדגימה חייבת להיות מוכתמת במתכות כבדות שהוטבעו מראש; ו-2) יש לחתוך את דגימת הפלסטיק המשובצת כראוי להרכבה בתוך ה-SEM (ראה איור 6 לתצוגה חזותית של דגימות גזוזות). צביעה לאחר הטבעה אינה אפשרית בתוך SEM. בעת איסוף דגימה מפגיעה בכלי דם המושרה על ידי FeCl₃ לצורך ניתוח EM, יש לבצע את השינויים הבאים בעת ביצוע הניתוח. השינויים בפרוטוקול ניתוח FeCl₃ המוצג חלים גם על כל צורה של מיקרוסקופ אלקטרונים. תנאי ההרדמה והשלבים לביצוע חתך וחשיפת עורק התרדמה זהים לפרוטוקול 1.

1. לאחר חשיפת עורק התרדמה, סמן את מקום הפציעה על-ידי הקפת האזור באופן רופף בין שני חוטים כירורגיים (גודל: 0.1 מ"מ) (איור 5A,B).
2. הניחו את הגשושית מתחת לעורק, דיסטלית מהחוט התחתון (איור 5C).
3. הכניסו את פיסת הפלסטיק מתחת לעורק בין שני החוטים כדי לסמן את האתר לפגיעה ב-FeCl₃ (איור 5C).
4. בצע מדידות זרימה לפני ביצוע פציעה כדי לציין את הזרימה הבסיסית. מדידות אלה משמשות כדי להחליט באיזה שלב תיאסף הדגימה.
   הערה: ודא שהקיבוע (3% paraformaldehyde/PFA + 0.1% glutaraldehyde, שניהם מיוצרים ב-1x PBS) מוכן וב-RT. לחלופין, ניתן להשתמש גם בקיבוע עם 2.5% גלוטראלדהיד על רקע מלוחים.
   אזהרה: גם פרפורמאלדהיד וגם גלוטראלדהיד רעילים ומגרים מאוד. בעת הטיפול בהם יש להשתמש בכפפות, מגן עיניים ומסכות כדי להגן עליהם מפני חשיפה. כל פתרונות הקיבוע רעילים, ושלבי הקיבוע צריכים להתבצע במכסה אדים.
5. בצע את הפציעה על ידי הנחת נייר פילטר FeCl 3 ספוג על העורק (8% FeCl 3 משמש) במשך₃ דקות (זמן זה יכול להשתנות גם כן). לאחר 3 דקות, הסר את נייר הסינון והוסף מי מלח במקום הפציעה כדי להסיר שאריות FeCl₃ עודפות. שלב זה נחוץ כדי למנוע את ההיקף המשתנה של הפגיעה ולהקל על ספירת הזרימה על ידי הגשושית (איור 5D).
6. עקוב אחר קריאת הזרימה. כאשר הזרימה יורדת מתחת ל-50% מהערך ההתחלתי, הסר את הבדיקה. יבשו במהירות את האזור והוסיפו את הקיבוע באזור כדי לתקן חיצונית את אזור הפציעה.
7. החזיקו מיד את העורק ליד אזור הפציעה עם מלקחיים, וחתכו במורד הזרם של החוט התחתון ובמעלה הזרם של החוט העליון. במידת הצורך, בקש מאדם אחר לעזור לחתוך קצה אחד. שים את הרקמה על צלחת תרבית רקמת פלסטיק באותו כיוון כפי שהוא נאסף, ולהוסיף כמה טיפות של קיבוע.
   הערה: חיתוך העורק גורם לדימום נרחב מיידי, לכן הקפד להחזיק את העורק לפני שחותכים אותו בפעם הראשונה. בתרחיש זה, העכבר הוא exsanguinated. העכבר מורדם על ידי exsanguination ו נקע צוואר הרחם.
8. בעזרת אזמל, נקו את הרקמה הנוספת סביב העורק. שימו לב לתעד את כיוון זרימת הדם. כדי לסמן זאת, חתכו קצה אחד אופקית ואת הקצה השני מחודד/אלכסוני (איור 5E).
9. שמור את הדגימה בקיבוע (3% PFA ו- 0.1% גלוטראלדהיד) למשך שעה אחת ב- RT. לאחר מכן, אחסנו את הדגימה ב-1% PFA בטמפרטורה של 4°C עד לשליחתה על קרח רטוב למעבדת עיבוד הדגימות לצורך ניתוח EM.
   הערה: אין להקפיא את הדגימות. האתגרים בשיטה זו של איסוף דוגמאות הם:
   1. הקריאה הראשונית עשויה שלא להיות אופטימלית או להשתנות לאחר הפציעה. הדבר עשוי להשפיע על מידת הפגיעה שנבחרה למעצר לצורך ניתוח EM. כדי לטפל בבעיה זו, הקפד להקליט את קריאת קו הבסיס במשך מספר דקות, לאחר שניסית מיקומים שונים של הצבת הגשושית כדי להחליט איזו עמדה היא אופטימלית.
   2. הזמן לעצור את הפגיעה על ידי הוספת חיתוך חיצוני מקובע ובפועל של קטע העורקי לניתוח עשוי להוסיף שונות למידת פקקת. היו זריזים במהלך איסוף הדגימה לאחר תיקון חיצוני.
10. קבל את הדגימות לעיבוד לניתוח EM ב- 1% PFA על קרח רטוב. שטפו את הדגימות במשך 3 דקות, על קרח, עם חיץ קקודילט 0.1M כדי להתחיל עיבוד נוסף.
11. תקן את הדגימות במשך שעה אחת על קרח ב 0.1 M cacodylate buffer + 2.5% glutaraldehyde + 2 mM CaCl₂.
12. השליכו את הקיבוע ושטפו את הדגימות עם חיץ נתרן קקודילט קר של 0.1 M המכיל 2 mM CaCl₂ (5 x 3 דקות) (איור 6A).
13. תקן את הדגימות עם תמיסת אוסמיום (3% אשלגן פרוציאניד [K 4 C 6 N₆Fe] +חיץ קקודילט 0.3 M + 4 mM CaCl 2 מעורבב עם נפח שווה של 4% אוסמיום טטרוקסיד מימי [OsO₄; ב- ddH₂ O]) למשך שעה אחת על קרח.
14. בזמן שהדגימות מתקבעות, הכינו תמיסת הידרט טריכלורואצטאלדהיד (TCH) טרייה 1% ב-ddH₂O. דגרו על התמיסה ב-60°C למשך שעה אחת תוך ערבוב עדין.
15. לאחר התיקון, שטפו את הדגימות עם ddH₂O ב- RT למשך 5 x 3 דקות.
16. דגרו על הדגימות בתמיסת 1% TCH מסוננת (מיוצרת ב-ddH₂O) למשך 20 דקות ב-RT.
17. שטפו את הדגימות עם ddH₂O ב-RT (5 x 3 דקות).
18. תקן את הדגימות ב 2% osmium tetroxide ב ddH₂O במשך 30 דקות ב RT.
19. שטפו את הדגימות עם ddH₂O ב-RT במשך 5 x 3 דקות כל אחת.
20. מניחים את הדגימות באורניל אצטט 1% (מימי) ודגורים למשך הלילה ב -4 מעלות צלזיוס.
21. שטפו את הדגימות עם ddH₂O ב-RT במשך 5X3 דקות כל אחת, ועבדו אותן עם צביעת עופרת אספרטט של וולטון.
22. En bloc צביעת עופרת אספרטט של וולטון³:
    1. הכינו 30 mM תמיסת חומצה L-אספרטית ב-ddH₂O.
       הערה: החומצה האספרטית מתמוססת מהר יותר אם ה-pH מועלה ל-3.8. פתרון מלאי זה יציב למשך 1-2 חודשים אם מקורר.
    2. הפוך 20 mM עופרת חנקתית פתרון ב 10 מ"ל של מלאי חומצה אספרטית, ולהתאים את ה- pH ל 5.5 עם 1 N KOH.
    3. הניחו את הדגימות בתמיסת עופרת אספרטט בטמפרטורה של 60°C למשך 30 דקות, לאחר חמש שטיפות עם ddH₂O ב-RT, כל אחת למשך 3 דקות.
23. יש לייבש את הדגימות עם סדרת אתנול מדורגת. השתמש בהתייבשות כימית לפי פרוטוקול ואלדיביה¹⁸.
    1. שטפו את הדגימות בכל אחד מהתמיסות הבאות כדי לייבש את הדגימה בהדרגה (איור 6B):
       25% אלכוהול אתילי למשך 3 דקות
       50% אלכוהול אתילי למשך 3 דקות
       75% אלכוהול אתילי למשך 3 דקות
       95% אלכוהול אתילי למשך 3 דקות
       100% אלכוהול אתילי במשך 10 דקות, וחזור על הצעד פעמיים (סה"כ שלוש כביסות).
24. שטפו את הדגימות ב-100% פרופילן אוקסיד (PO) במשך 10 דקות, וחזרו על השלב פעמיים (סה"כ שלוש שטיפות).
25. יש לדגור ב-50%/50% PO/שרף עם מפעיל DMP 30 למשך הלילה ב-RT, ולהטמיע ב-100% Araldite 502/embed 812/DDSA עם מפעיל DMP30 למשך 48 שעות.

תוצאות

הנתונים מוצגים בדרך כלל כזמן לחסימה, או הזמן הדרוש ליצירת פקקת חסימה מלאה. ניתן לשרטט את הנתונים האלה כעקומת הישרדות קפלן-מאייר (איור 4A)¹⁹, תרשים נקודתי עם עמודות המראות את זרימת הדם הסופית בזמן הפסקת זרימת הדם או סיום ניסוי (איור 4B), או כגרף קווי (איור 4C).

Discussion

היישום המקומי של FeCl₃ בכלי הדם כדי לגרום לפקקת הוא טכניקה נפוצה, והיא סייעה בקביעת תפקידים עבור קולטני טסיות שונים, מסלולי איתות ליגנד, ומעכביהם^20,21,22,23. המנגנון שבאמצעותו FeCl₃ גורם פקקת הוא רב פנים; בעבר, דנודצי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline	Fisher Scientific	BP358-212	NaCl used to make a solution of 0.9% saline
1 mL Syringe	Becton, Dickinson and Company	309659
190 Proof Ethanol	KOPTEC	V1101	Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery
2,2,2 Tribromoethanol	Sigma Aldrich	48402
25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0)	DEKNATEL	136082-1204
26G x 3/8 Needle	Becton, Dickinson and Company	305110
2-methyl-2-butanol	Sigma Aldrich	240486
7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL	Globe Scientific Inc.	135010
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)	Medline	MDS090735
Araldite GY 502	Electron microscopy Services	10900
Cell Culture Dish 35mm X 10mm	Corning Incorporated	430165
Compact Scale	Ward's Science	470314-390
Dissecting Scissors, 12.5 cm long	World Precision Instrument	15922-G
DMP-30 activator	Electron microscopy Services	13600
Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA	Electron microscopy Services	13700
Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag	Crown Products	PP-RB-200
Doppler FlowProbe	Transonic Systems Inc.	MA0.5PSB
EMBED 812 resin	Electron microscopy Services	14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof	Electron microscopy Services	15055
Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips	Integra Miltex	18-784
Filter Paper	VWR	28310-106
Fine Scissors - Sharp-Blunt	Fine Science Tools	14028-10
Finger Loop Ear Punches	Fine Science Tools	24212-01
Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply	Dukal Corporation	2128
Glutaraldehyde (10% solution)	Electron microscopy Services	16120
Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10	Integra® Miltex®	4110
Iron (III) Chloride	SIGMA-ALDRICH	157740-100G
Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3	Integra Lifesciences	157510
L-aspartic acid	Sigma Fisher	A93100
L-aspartic acid	Fisher Scientific	BP374-100
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L-62
LEICA S8AP0 Microscope	LEICA	No longer available	No longer available from the company
LEICA S8AP0 Microscope Stand	LEICA	10447255	No longer available from the company
Light-Duty Tissue Wipers	VWR	82003-822
Micro Dissecting Forceps; 1x2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical Instrument Company	RS-5157
Osmium Tetroxide 4% aqueous solution	Electron microscopy Services	19150
Paraformaldehyde (16% solution)	Electron microscopy Services	15710
Potassium ferricyanide	SIGMA-ALDRICH	P-8131
Propylene Oxide, ACS reagent	Electron microscopy Services	20401
Rainin Classic Pipette PR-10	Rainin	17008649
Research Flowmeter	Transonic Systems Inc.	T402B01481	Model: T402
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear	Scotch	305289
Small Animal Heated Pad	K&H Manufacturing Inc.	Model: HM10
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4	Electron microscopy Services	11623
Sterile Cotton Tipped Applicators	Puritan Medical Products	25-806 1WC
Steromaster Illuminator	Fisher Scientific	12-562-21	No longer available from the company
Surgical Dumont #7 Forceps	Fine Science Tools	11271-30
Thiocarbohydrazide (TCH)	SIGMA-ALDRICH	88535
Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL)	VWR	76323-394
Uranyl Acetate	Electron microscopy Services	22400
Veet Gel Cream Hair Remover	Reckitt Benckiser	3116875
White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm	Fisher Scientific	S38975
WinDAQ/100 Software for Windows	DATAQ Instruments, Inc.	Version 3.38	Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/
ZEISS AxioCam Icc 1	ZEISS	57615