氯化铁诱导的动脉血栓形成和用于3D电子显微镜分析的样本采集

摘要

本协议描述了如何使用FeCl₃介导的损伤来诱导动脉血栓形成，以及如何在血栓形成的各个阶段收集和制备动脉损伤样品以进行电子显微镜分析。

摘要

心血管疾病是全世界死亡和发病的主要原因。异常血栓形成是糖尿病和肥胖等全身性疾病以及动脉粥样硬化、癌症和自身免疫性疾病等慢性炎症性疾病的共同特征。血管损伤时，凝血系统、血小板和内皮通常以协调的方式发挥作用，通过在损伤部位形成凝块来防止出血。这一过程中的异常导致出血过多或血栓形成不受控制/抗血栓形成活性不足，这转化为血管闭塞及其后遗症。FeCl₃诱导的颈动脉损伤模型是探索血栓形成如何在 体内启动和进展的宝贵工具。该模型涉及内皮损伤/剥落以及随后在受伤部位形成凝块。它提供了一种高度灵敏的定量测定，以监测不同程度的血管损伤和凝块形成。一旦优化，这种标准技术可用于研究血栓形成的分子机制，以及生长中的血栓中血小板的超微结构变化。该测定也可用于研究抗血栓形成和抗血小板药物的疗效。本文解释了如何启动和监测FeCl₃诱导的动脉血栓形成，以及如何收集样品通过电子显微镜进行分析。

引言

血栓形成是部分或完全阻塞血管的血凝块的形成，阻碍血液的自然流动。这会导致严重和致命的心血管事件，如缺血性心脏病和中风。心血管疾病是发病和死亡的主要原因，导致全世界四分之一的死亡¹，^2，3。虽然血栓形成表现为血管系统功能障碍，但它可能是潜在的微生物或病毒感染、免疫紊乱、恶性肿瘤或代谢疾病的结果。血液流动由血管系统不同组成部分（包括内皮细胞、红/白细胞、血小板和凝血因子）之间的复杂相互作用维持⁴.血管损伤后，血小板与内皮下基质上的粘附蛋白相互作用并释放其颗粒内容物，从而募集更多的血小板⁵。同时，凝血级联反应被激活，导致纤维蛋白形成和沉积。最终，形成凝块，包含被困在纤维^{蛋白网内的}血小板和红细胞6。虽然抗血小板和抗凝药物可用于调节血栓形成，但假性出血仍然是这些疗法的主要问题，需要微调这些药物的剂量和组合。因此，仍然迫切需要发现新的抗血栓药物⁷。

使用多种方法研究血栓形成以造成血管损伤:机械（血管结扎），热损伤（激光损伤）和化学损伤（FeCl₃ / Rose Bengal应用）。血栓形成的性质因损伤部位（动脉与静脉）、损伤方法或程度而异。在所有这些类型中，FeCl₃诱导的血管损伤是最广泛使用的方法。它已被用于小鼠，大鼠，兔子，豚鼠和狗⁸，^9，10，^11，12。该方法相对简单，易于使用，如果主要参数标准化，则在各种血管系统（例如动脉[颈动脉和股动脉]，静脉[颈动脉]和小动脉[提睾和肠系膜]）中具有敏感性和可重复性（补充表1）。

该模型也可用于进一步了解凝块形成的机制和形态。该技术独特地提供了在不同流速点阻止血栓形成的优势，以在过程闭塞之前研究该过程的中间阶段。血栓形成研究的最新进展使用该模型将注意力集中在溶栓的非药物方法¹³ 或抗血栓和/或纤维蛋白溶解剂的非侵入性递送^14，15上。一些研究小组已经表明，当血小板膜涂有这些疗法时，药物可以在热刺激下被激活以靶向凝块¹⁶。这里描述的技术可用于在单个血小板水平验证其发现等研究。在本手稿中，方案 1 描述了基本的 FeCl₃ 介导的血管损伤程序，而方案 2 描述了收集和固定血管损伤样本以通过电子显微镜进一步分析的方法。

研究方案

这里讨论的所有实验都经过肯塔基大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的审查和批准。

注:手术器械列于 图1 和 材料表中。使用C57BL / 6J小鼠，8-10周龄，雄性/雌性或相关的遗传操作（敲除或敲入）菌株。

1. 氯化铁₃诱发的颈动脉损伤

1. 小鼠麻醉诱导
   1. 称量鼠标。
   2. 通过腹膜内（ip）注射0.2g / kg三溴乙醇溶液来麻醉小鼠。注射前确保麻醉液处于室温（RT）。该剂量足以使小鼠镇静约1小时。
   3. 注射后5分钟通过捏住脚趾来检查脚趾反射，以确保小鼠镇静。如果鼠标没有镇静，它会把它的脚趾拉开。如果发生这种情况，请等待 5 分钟，然后再次检查。
   4. 如果小鼠仍未完全镇静，则给予初始剂量的1/4并等待5分钟。
   5. 在整个过程中，通过捏住脚趾定期监测鼠标的麻醉平面。此外，还可以监测呼吸频率和体温以维持最佳麻醉。
2. 固定鼠标
   1. 将鼠标仰卧放在加热垫（37°C）上，并使用胶带固定四肢。
   2. 使用手术线（0.1毫米）轻轻拉动小鼠的上门牙以延长颈部/颈部区域。这对于更好地可视化手术区域和多普勒探头的稳定性非常重要。线的大小并不重要，因为它仅用于拉动动物的门牙以伸展颈部。
3. 切口
   1. 用70%乙醇喷洒手术区域或用酒精湿巾擦拭。
   2. 使用棉签在手术部位涂抹少量脱毛霜。等待1-2分钟，然后用湿纸巾或纸巾去除奶油。
      注意:此步骤对于清洁手术区域很重要。
   3. 使用剪刀和镊子（图1B11，1B13），从下颌骨到胸骨上切口做一个中线切口。缩回皮肤以获得该区域的更好可视化（图2A）。
4. 颈动脉暴露
   1. 使用手术钳和显微解剖钳，钝性解剖覆盖的浅筋膜并将其移除以露出左颈动脉（图1B12，1B13）。确保在此阶段不要使用剪刀，以免伤害该区域的其他脉管系统。
   2. 去除颈动脉周围的多余组织。避免过度解剖周围组织，因为该区域藏有迷走神经和椎动脉。
   3. 用手术和缝合钳解剖颈动脉与周围组织分离（图1B12，1B15，2C）。确保不要伸展或拉动动脉，以避免对动脉或周围脉管系统造成任何机械损伤。
   4. 在动脉下放置一块塑料以标记损伤的位置（图2D）。使用彩色透明片，使其在手术区域更容易看到。
5. 流动探头的放置
   1. 手术前将多普勒跨音速流动探头置于盐溶液（dH₂O中的0.9%NaCl）中约10分钟。将探头的另一端插入流量计的附件中，以方便读取流量。将流量计连接到计算机。
      注意:在手术之间，多普勒跨音速血流探头应处于生理盐水中。确保在整个过程中保持探头湿润和清洁。
   2. 将超声多普勒跨音速流探头放置在塑料上游的动脉周围（图2D）。确保探头的容器支架区域不会太长（图1C，红色箭头）。
      注意:如果需要，用纱布垫支撑探头（图1B1），以实现探头的适当高度，从而促进最佳读取位置。
   3. 如果此时手术区域干燥，请添加几滴RT盐水以保持该区域湿润。监控流量探头读数。每种动物的最佳读数各不相同，可能在 0.6-1.2 mL/min 之间。如果不太稳定或不稳定，请更改流探头位置以获得最佳读数。
      注意:确保鼠标的颈部不要太伸展，并且手术区域干净。
6. 记录流基线
   1. 放置探针后，监测血流2分钟，以确保血流稳定。然后，记录2分钟的流量（图3B）作为基线。有关流量计的详细说明，请参阅Subramaniam等人¹⁷。
   2. 要记录血流，请启动WinDAQ软件。单击"文件"选项，然后单击 "记录"。创建一个新文件夹和文件，然后开始录制。要停止录制，请单击文件部分中的 "停止 "。
      注意:WinDAQ 软件可从发行商处免费获得:https://www.dataq.com/products/windaq/。
7. 损伤
   1. 停止流的记录。确保不要改变探头位置，以便在受伤后读数保持一致。
   2. 用湿巾/纸巾彻底擦干该区域。
      注意:即使是少量残留液体也可能改变用于造成血管损伤的FeCl₃溶液的浓度。这会导致结果不一并影响可重复性。当该区域完全干燥时，探头无法测量流量。
   3. 在塑料称重舟中，放入圆形滤纸（直径1毫米，用直径1毫米的耳孔切割）。将 1 μL 6% FeCl₃ 溶液（以 dH₂O 制成）添加到滤纸上。
      注意:确保在使用滤纸之前添加FeCl₃溶液。过早浸泡纸张可能会导致FeCl₃溶液蒸发并改变损伤的严重程度。
   4. 使用细镊子，拿起滤纸并将其放在探头上游的动脉上，在由塑料标记的动脉部分（图2D，E）。这种塑料充当标记和垫片。它标记受伤区域，并通过避免与周围潮湿区域接触来防止FeCl₃ 意外稀释。
      注:确保滤纸笔直，没有被挤压或以其他方式折叠。一旦放在动脉上，不要改变滤纸的位置;这样做会改变伤害的程度。
   5. 放置滤纸后，启动计时器并记录血流。3分钟后，取出纸张并在受伤部位添加盐水以去除FeCl₃ 并停止损伤过程。它还使该地区湿润。在这个阶段，血流量应恢复到损伤前记录的基线水平。
   6. 监控并记录流量，直到它减少到原始记录的 10% 或达到零。一旦血栓开始在损伤部位形成，就会稳步减少（图3C）。请注意在此期间流量的任何显著波动。
   7. 为了研究血栓的稳定性，记录每次显着和一致的减少后血流量的快速增加。这些事件被归类为由于不稳定血栓形成引起的栓塞（图4D）。在流量持续下降后，操作员能够在实验结束时看到动脉上的损伤（图2F，蓝色箭头/虚线椭圆形）。
   8. 血管闭塞时间定义为血流完全停止至少1分钟。记录闭塞性血栓形成的时间，如零读数或流量显着减少所示。
   9. 在30分钟时终止实验。如果在监测后30分钟内血栓没有形成，则记录流量，停止记录并取出探头。
   10. 用70%乙醇和刷子清洁探头，以去除任何残留的组织/头发或碎屑。将探头完全干燥，然后再将其放入储物盒中。将探头完全干燥，然后将其放入存储盒中以便长期存放。
   11. 通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死。将胴体放入胴体处理袋中，标有实验室名称和日期。

2. 收集和制备用于FeCl₃诱导损伤后连续块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）研究的样品

注意:所提供的EM方案适用于SBF-SEM的样品制备。这种成像技术提供了前所未有的能力来研究凝块中血小板的三维结构。使用这种技术，样品被可视化为一系列连续的块SEM图像，随着样品的进展而生成。该制备的关键点是:1）样品必须用重金属预包埋染色;2）必须适当地修剪塑料嵌入样品才能安装在SEM内（有关修剪样品的视觉效果，请参见 图6 ）。SEM内无法进行包埋后染色。从FeCl₃诱导的血管损伤中收集样本进行EM分析时，在进行手术时需要进行以下更改。所介绍的FeCl₃ 手术方案中的修改也适用于任何形式的电子显微镜检查。麻醉条件和切开和暴露颈动脉的步骤与方案1相同。

1. 暴露颈动脉后，通过松散地包围两条手术线之间的区域（尺寸:0.1 毫米）来标记损伤部位（图 5A，B）。
2. 将探头放在动脉下方，下线远端（图5C）。
3. 将塑料片插入两条线之间的动脉下方，以标记FeCl₃ 损伤的部位（图5C）。
4. 在进行损伤之前进行流量测量，以注意基础血流。这些测量用于决定在哪个阶段收集样品。
   注意:确保固定剂（3%多聚甲醛/ PFA + 0.1%戊二醛，均由1x PBS制成）已准备好并在室温下。 或者，也可以使用2.5%戊二醛在盐水背景中固定。
   注意:多聚甲醛和戊二醛都具有剧毒和刺激性。在处理它们时，应使用手套、眼罩和口罩以防止暴露。所有固定液都是有毒的，固定步骤应在通风橱中进行。
5. 通过将FeCl 3浸泡的滤纸放在动脉上（使用8%FeCl 3）₃分钟（这个时间也可能有所不同）来执行损伤。3分钟后，取出滤纸并在损伤部位加入盐水，以去除任何多余的残留FeCl₃。此步骤对于防止不同程度的伤害和促进探头的流量计数是必要的（图5D）。
6. 监控流量读数。当流量降至初始值的 50% 以下时，取下探头。快速擦干该区域，并在该区域添加固定剂以在外部固定受伤区域。
7. 及时用镊子夹住损伤区域附近的动脉，切下线下游和上线上游。如有必要，请另一个人帮助切割一端。将组织以与收集的方向相同的方向放在塑料组织培养皿上，并加入几滴固定剂。
   注意:切断动脉会导致立即大量出血，因此请确保在第一次切割动脉之前握住动脉。在这种情况下，鼠标被放血。小鼠通过放血和颈椎脱位被安乐死。
8. 使用手术刀清洁动脉周围的多余组织。注意记录血流的方向。要标记这一点，请水平切割一端，另一端逐渐变细/倾斜（图 5E）。
9. 将样品在固定剂（3%PFA和0.1%戊二醛）中在室温下保持1小时。然后，将样品储存在4°C的1%PFA中，直到将其送入湿冰上进行EM分析。
   注意:样品不应冷冻。 这种样本收集方法面临的挑战是:
   1. 初始读数可能不是最佳的，或者在受伤后可能会波动。这可能会影响选择停止进行 EM 分析的损伤程度。要解决此问题，请确保在尝试放置探头的各种位置以确定哪个位置是最佳位置后，记录几分钟的基线读数。
   2. 通过添加外部固定剂和动脉切片的实际切割进行分析来阻止损伤的时间可能会增加血栓形成程度的可变性。外部固定后，在样品收集过程中要快速。
10. 在湿冰上接收样品以在1%PFA中进行处理EM分析。在冰上用0.1M二甲胂酸盐缓冲液冲洗样品3分钟以开始进一步处理。
11. 将样品在0.1M二甲胂酸盐缓冲液+ 2.5%戊二醛+ 2mM CaCl₂中的冰上固定1小时。
12. 弃去固定剂，并用含有2mM CaCl₂ （5 x 3分钟）的冷0.1 M二甲胂酸钠缓冲液洗涤样品（图6A）。
13. 用锇溶液（3%亚铁氰化钾[K 4 C 6 N₆Fe] + 0.3 M二甲胂酸盐缓冲液+ 4 mM CaCl 2与等体积的4%四氧化锇水溶液[OsO₄;在ddH₂ O]中）固定样品在冰上1小时。
14. 当样品固定时，在ddH₂O中制作新鲜的1%三氯乙醛水合物（TCH）溶液，将溶液在60°C孵育1小时，同时轻轻混合。
15. 固定后，在室温下用ddH₂O洗涤样品5 x 3分钟。
16. 将样品在过滤的1%TCH溶液（在ddH₂O中制成）中在室温下孵育20分钟。
17. 在室温下用ddH₂O洗涤样品（5 x 3分钟）。
18. 将样品固定在 ddH₂O 中的 2% 四氧化锇中，在室温下 30 分钟。
19. 用ddH₂O在室温下洗涤样品5 x 3分钟。
20. 将样品置于1%乙酸铀酰（水溶液）中，并在4°C下孵育过夜。
21. 用ddH₂O在室温下洗涤样品5 x 3分钟， 并用整体 沃尔顿铅天冬氨酸染色处理它们。
22. En bloc 沃尔顿先导天冬氨酸染色³:
    1. 在ddH₂O中制备30mM L-天冬氨酸溶液。
       注意:如果pH值升高到3.8，天冬氨酸溶解得更快。如果冷藏，该储备溶液可稳定保存 1-2 个月。
    2. 在 10 mL 天冬氨酸储备液中制备 20 mM 硝酸铅溶液，并用 1 N KOH 将 pH 值调节至 5.5。
    3. 将样品置于60°C的天冬氨酸铅溶液中30分钟，在室温下用ddH₂O洗涤五次，每次洗涤3分钟。
23. 用分级乙醇系列对标本进行脱水。使用瓦尔迪维亚协议¹⁸的化学脱水。
    1. 在以下每种溶液中洗涤样品以逐渐脱水样品（图6B）:
       25%乙醇3分钟
       50%乙醇3分钟
       75%乙醇3分钟
       95%乙醇3分钟
       100%乙醇10分钟，重复该步骤两次（共三次洗涤）。
24. 在100%环氧丙烷（PO）中洗涤样品10分钟，并重复该步骤两次（总共三次洗涤）。
25. 在 50%/50% PO/树脂中与 DMP 30 活化剂在室温下孵育过夜，并嵌入 100% Araldite 502/嵌入 812/DDSA 与 DMP30 活化剂中 48 小时。

结果

数据通常表示为闭塞时间，或形成完全闭塞血栓所需的时间。这些数据可以绘制为Kaplan-Meier生存曲线（图4A）¹⁹，带有条形图的点图，显示血流停止或实验终止时的最终血流（图4B），或折线图（图4C）。可以使用这种技术研究血栓稳定性。在大多数情况下，在FeCl₃损伤时，血栓逐渐形成，随着其生长，血?...

讨论

将FeCl₃局部应用于脉管系统以诱导血栓形成是一种广泛使用的技术，并且有助于建立各种血小板受体，配体信号通路及其抑制剂^的作用20，²¹，^22，23。FeCl₃引起血栓形成的机制是多方面的;以前，内皮剥蚀被认为是血栓形成的原因，然而近年来，多份报告表明红细胞和血浆蛋白在此过程?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline	Fisher Scientific	BP358-212	NaCl used to make a solution of 0.9% saline
1 mL Syringe	Becton, Dickinson and Company	309659
190 Proof Ethanol	KOPTEC	V1101	Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery
2,2,2 Tribromoethanol	Sigma Aldrich	48402
25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0)	DEKNATEL	136082-1204
26G x 3/8 Needle	Becton, Dickinson and Company	305110
2-methyl-2-butanol	Sigma Aldrich	240486
7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL	Globe Scientific Inc.	135010
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)	Medline	MDS090735
Araldite GY 502	Electron microscopy Services	10900
Cell Culture Dish 35mm X 10mm	Corning Incorporated	430165
Compact Scale	Ward's Science	470314-390
Dissecting Scissors, 12.5 cm long	World Precision Instrument	15922-G
DMP-30 activator	Electron microscopy Services	13600
Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA	Electron microscopy Services	13700
Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag	Crown Products	PP-RB-200
Doppler FlowProbe	Transonic Systems Inc.	MA0.5PSB
EMBED 812 resin	Electron microscopy Services	14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof	Electron microscopy Services	15055
Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips	Integra Miltex	18-784
Filter Paper	VWR	28310-106
Fine Scissors - Sharp-Blunt	Fine Science Tools	14028-10
Finger Loop Ear Punches	Fine Science Tools	24212-01
Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply	Dukal Corporation	2128
Glutaraldehyde (10% solution)	Electron microscopy Services	16120
Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10	Integra® Miltex®	4110
Iron (III) Chloride	SIGMA-ALDRICH	157740-100G
Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3	Integra Lifesciences	157510
L-aspartic acid	Sigma Fisher	A93100
L-aspartic acid	Fisher Scientific	BP374-100
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L-62
LEICA S8AP0 Microscope	LEICA	No longer available	No longer available from the company
LEICA S8AP0 Microscope Stand	LEICA	10447255	No longer available from the company
Light-Duty Tissue Wipers	VWR	82003-822
Micro Dissecting Forceps; 1x2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical Instrument Company	RS-5157
Osmium Tetroxide 4% aqueous solution	Electron microscopy Services	19150
Paraformaldehyde (16% solution)	Electron microscopy Services	15710
Potassium ferricyanide	SIGMA-ALDRICH	P-8131
Propylene Oxide, ACS reagent	Electron microscopy Services	20401
Rainin Classic Pipette PR-10	Rainin	17008649
Research Flowmeter	Transonic Systems Inc.	T402B01481	Model: T402
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear	Scotch	305289
Small Animal Heated Pad	K&H Manufacturing Inc.	Model: HM10
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4	Electron microscopy Services	11623
Sterile Cotton Tipped Applicators	Puritan Medical Products	25-806 1WC
Steromaster Illuminator	Fisher Scientific	12-562-21	No longer available from the company
Surgical Dumont #7 Forceps	Fine Science Tools	11271-30
Thiocarbohydrazide (TCH)	SIGMA-ALDRICH	88535
Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL)	VWR	76323-394
Uranyl Acetate	Electron microscopy Services	22400
Veet Gel Cream Hair Remover	Reckitt Benckiser	3116875
White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm	Fisher Scientific	S38975
WinDAQ/100 Software for Windows	DATAQ Instruments, Inc.	Version 3.38	Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/
ZEISS AxioCam Icc 1	ZEISS	57615