Артериальный тромбоз, индуцированный хлоридом железа, и сбор образцов для анализа 3D-электронной микроскопии

Резюме

Настоящий протокол описывает, как использовать FeCl-3-опосредованное повреждение для индукции артериального тромбоза, а также как собирать и подготавливать образцы артериального повреждения на различных стадиях тромбоза для анализа электронной микроскопии.

Аннотация

Сердечно-сосудистые заболевания являются одной из основных причин смертности и заболеваемости во всем мире. Аберрантный тромбоз является общей чертой системных состояний, таких как диабет и ожирение, а также хронических воспалительных заболеваний, таких как атеросклероз, рак и аутоиммунные заболевания. При повреждении сосудов обычно свертывающая система, тромбоциты и эндотелий действуют организованно, чтобы предотвратить кровотечение, образуя сгусток в месте повреждения. Аномалии в этом процессе приводят либо к чрезмерному кровотечению, либо к неконтролируемому тромбозу / недостаточной антитромботической активности, что приводит к окклюзии сосудов и ее последствиям. Модель повреждения сонной артерии, индуцированная FeCl₃, является ценным инструментом для исследования того, как тромбоз инициируется и прогрессирует in vivo. Эта модель включает повреждение / денудацию эндотелия и последующее образование сгустка в поврежденном месте. Он обеспечивает высокочувствительный количественный анализ для мониторинга повреждения сосудов и образования сгустков в ответ на различные степени повреждения сосудов. После оптимизации этот стандартный метод может быть использован для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе тромбоза, а также ультраструктурных изменений тромбоцитов в растущем тромбе. Этот анализ также полезен для изучения эффективности антитромботических и антиагрегантных средств. В этой статье объясняется, как инициировать и контролировать FeCl-3-индуцированный артериальный тромбоз и как собирать образцы для анализа с помощью электронной микроскопии.

Введение

Тромбоз - это образование сгустка крови, который частично или полностью блокирует кровеносный сосуд, препятствуя естественному току крови. Это приводит к тяжелым и смертельным сердечно-сосудистым событиям, таким как ишемическая болезнь сердца и инсульты. Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной заболеваемости и смертности и являются причиной каждой четвертой смерти во всем мире ^1,2,3. Хотя тромбоз проявляется как нарушение работы сосудистой системы, он может быть результатом основной микробной или вирусной инфекции, иммунного расстройства, злокачественных новообразований или метаболического состояния. Кровоток поддерживается сложным взаимодействием между различными компонентами сосудистой системы, включая эндотелиальные клетки, эритроциты/лейкоциты, тромбоциты и факторы свертывания^{крови 4}. При повреждении сосудов тромбоциты взаимодействуют с адгезивными белками на субэндотелиальном матриксе и высвобождают свое зернистое содержимое, которое набирает больше тромбоцитов⁵. Одновременно активируется каскад коагуляции, что приводит к образованию и отложению фибрина. В конечном итоге образуется сгусток, содержащий тромбоциты и эритроциты, попавшие в фибриновую сетку⁶. Хотя антиагреганты и антикоагулянты доступны для модуляции тромбоза, ложные кровотечения остаются серьезной проблемой при этих методах лечения, требуя точной настройки дозировок и комбинаций этих препаратов. Таким образом, по-прежнему существует острая необходимость в открытии новых антитромботических^{препаратов7}.

Тромбоз изучается с использованием нескольких методов нанесения сосудистого повреждения: механического (перевязка сосудов), термического (лазерная травма) и химического повреждения (применение FeCl₃ / Rose Bengal). Характер тромбоза варьируется в зависимости от локализации (артериальная или венозная), метода или степени повреждения. Среди всех этих типов FeCl-3-индуцированное повреждение сосудов является наиболее широко используемым методом. Он использовался у мышей, крыс, кроликов, морских свинок и собак 8,9,10,11,12. Метод относительно прост, удобен в использовании, и если основные параметры стандартизированы, он чувствителен и воспроизводим в различных сосудистых системах (например, артериях [сонных и бедренных], венах [яремных] и артериолах [кремастерных и брыжеечных]) (Дополнительная таблица 1).

Эта модель также может быть использована для дальнейшего понимания механики и морфологии образования сгустков. Этот метод однозначно предлагает преимущество остановки тромбоза в различных точках скорости потока, чтобы изучить промежуточные стадии процесса, прежде чем он станет окклюзионным. Последние достижения в исследованиях тромбоза использовали эту модель, чтобы сосредоточить внимание на нефармакологических методах тромболизиса¹³ или неинвазивной доставки антитромботических и/или фибринолитических агентов^14,15. Несколько групп показали, что, когда мембраны тромбоцитов покрыты этими терапевтическими средствами, лекарства могут быть активированы при термической стимуляции для воздействия на сгустки¹⁶. Описанные здесь методы могут быть полезны для таких исследований, как подтверждение их результатов на уровне отдельных тромбоцитов. В этой рукописи Протокол 1 описывает базовую процедуру повреждения сосудов, опосредованную FeCl₃, в то время как Протокол 2 описывает метод сбора и фиксации образца сосудистого повреждения для дальнейшего анализа с помощью электронной микроскопии.

протокол

Все эксперименты, обсуждаемые здесь, были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Кентукки.

ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургические инструменты перечислены на рисунке 1 и в таблице материалов. Использовали мышей C57BL/6J в возрасте 8-10 недель, самцов/самок или соответствующие генетически модифицированные (нокаутные или нокаутные) штаммы.

1. FeCl3-индуцированное повреждение сонной артерии

1. Индукция анестезии мыши
   1. Взвесьте мышь.
   2. Обезболивают мышей, вводя 0,2 г/кг раствора трибромэтанола внутрибрюшинно (внутривенно). Перед введением убедитесь, что раствор анестетика имеет комнатную температуру (ЛТ). Этой дозы достаточно, чтобы успокоить мышь примерно на 1 ч.
   3. Проверьте рефлекс пальца ноги, ущипнув палец через 5 минут после инъекции, чтобы убедиться, что мышь успокоена. Если мышь не успокоена, она отдернет палец ноги. Если это произойдет, подождите 5 минут и проверьте еще раз.
   4. Если мышь все еще не полностью успокоена, введите 1/4 начальной дозы и подождите 5 минут.
   5. На протяжении всей процедуры периодически контролируйте плоскость анестетика мыши с помощью защемления пальца ноги. Кроме того, частота дыхания и температура тела также могут контролироваться для поддержания оптимальной анестезии.
2. Обездвижить мышь
   1. Положите мышь на грелку (37 °C) в положении лежа на спине и с помощью клейкой ленты обездвижите конечности.
   2. Используйте хирургическую нить (0,1 мм), чтобы осторожно потянуть за верхние передние зубы мыши, чтобы расширить область шейки матки / шеи. Это важно для лучшей визуализации операционной области и стабильности допплеровского зонда. Размер нити не важен, так как она используется только для вытягивания передних зубов животного для удлинения шеи.
3. Надрез
   1. Опрыскайте операционную область 70% этанолом или протрите спиртовой салфеткой.
   2. С помощью ватного тампона нанесите небольшое количество крема для удаления волос на операционную область. Подождите 1-2 минуты, а затем используйте влажное бумажное полотенце или салфетку, чтобы удалить крем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг важен для чистой хирургической области.
   3. С помощью ножниц и щипцов (рис. 1В11,1В13) сделайте срединный разрез от нижней челюсти до надгрудинной выемки. Втяните кожу, чтобы получить лучшую визуализацию области (рис. 2A).
4. Обнажение сонной артерии
   1. С помощью хирургических щипцов и микрорассекающих щипцов тупого рассекают накладывающуюся поверхностную фасцию и удаляют ее, чтобы обнажить левую сонную артерию (рис. 1B12,1B13). Убедитесь, что на этом этапе вы не используете ножницы, чтобы не повредить другие сосуды в этой области.
   2. Удалите лишнюю ткань, окружающую сонную артерию. Избегайте чрезмерного рассечения окружающих тканей, так как в этой области находится блуждающий нерв и позвоночная артерия.
   3. Отделите сонную артерию от окружающих тканей, рассекая ее хирургическими щипцами и щипцами для наложения швов (рис. 1B12,1B15,2C). Следите за тем, чтобы не растягивать и не тянуть артерию, чтобы избежать механического повреждения артерии или окружающей сосудистой сети.
   4. Поместите кусок пластика под артерию, чтобы отметить место травмы (рис. 2D). Используйте цветной прозрачный лист, чтобы его было легче видеть в операционном поле.
5. Размещение датчика расхода
   1. Поместите допплеровский трансзвуковой проточный зонд в физиологический раствор (0,9% NaCl в dH₂O) примерно на 10 минут перед операцией. Вставьте другой конец зонда в насадку расходомера, чтобы облегчить считывание расхода. Подключите расходомер к компьютеру.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В промежутках между операциями доплеровский трансзвуковой датчик потока должен находиться в физиологическом растворе. Следите за тем, чтобы зонд был влажным и чистым на протяжении всей процедуры.
   2. Поместите ультразвуковой допплеровский датчик трансзвукового потока вокруг артерии выше по течению от пластика (рис. 2D). Убедитесь, что область держателя сосуда зонда не слишком вытянута (рис. 1C, красная стрелка).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости поддержите зонд марлевыми подушечками (рис. 1B1), чтобы достичь соответствующей высоты зонда, облегчая оптимальное положение считывания.
   3. Если к этому моменту хирургическая область сухая, добавьте несколько капель физиологического раствора, чтобы сохранить область влажной. Следите за показаниями датчика расхода. Оптимальные показания варьируются для каждого животного и могут составлять от 0,6 до 1,2 мл / мин. Если он менее стабилен или нестабилен, измените положение датчика потока, чтобы получить оптимальные показания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что шея мыши не слишком вытянута, а область операции чистая.
6. Запишите базовый план потока
   1. После установки зонда следите за кровотоком в течение 2 минут, чтобы убедиться, что поток устойчив. Затем запишите поток в течение 2 минут (рис. 3B) в качестве базового уровня. Подробное описание расходомера см. в Subramaniam et ^al.17.
   2. Чтобы записать кровоток, запустите программное обеспечение WinDAQ. Нажмите на опцию «Файл», а затем нажмите « Запись». Создайте новую папку и файл и начните запись. Чтобы остановить запись, нажмите « Стоп» в разделе «Файл».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение WinDAQ находится в свободном доступе у издателя: https://www.dataq.com/products/windaq/.
7. Травма
   1. Остановите запись потока. Следите за тем, чтобы не изменить положение зонда, чтобы показания оставались постоянными после травмы.
   2. Тщательно вытрите область салфеткой / бумажным полотенцем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Даже небольшой объем остаточной жидкости может изменить концентрацию раствора FeCl₃, используемого для нанесения сосудистого повреждения. Это приводит к переменным результатам и влияет на воспроизводимость. Когда область полностью высохла, зонд не в состоянии измерить расход.
   3. В пластиковую лодку для взвешивания положите круглую фильтровальную бумагу (диаметр 1 мм, вырезанная ушным перфоратором диаметром 1 мм). Добавьте 1 мкл 6% раствора FeCl₃ (приготовленного в dH₂O) на фильтровальную бумагу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно добавьте раствор FeCl₃ непосредственно перед использованием фильтровальной бумаги. Слишком раннее замачивание бумаги может привести к испарению раствора FeCl₃ и изменению тяжести травмы.
   4. Используя тонкие щипцы, возьмите фильтровальную бумагу и положите ее на артерию выше по течению от зонда, на той части артерии, которая отмечена пластиком (рис. 2D, E). Этот пластик выступает в роли маркера и прокладки. Он отмечает поврежденный участок и предотвращает случайное разбавление FeCl₃ , избегая контакта с окружающей влажной областью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что фильтровальная бумага прямая, не зажата и не сложена каким-либо иным образом. После размещения на артерии не меняйте положение фильтровальной бумаги; Это изменяет степень травмы.
   5. Поместив фильтровальную бумагу, запустите таймер и запишите кровоток. Через 3 минуты удалите бумагу и добавьте физиологический раствор в место повреждения, чтобы удалить FeCl₃ и остановить процесс повреждения. Это также делает область влажной. На этом этапе кровоток должен вернуться к исходному уровню, как это было зафиксировано до травмы.
   6. Контролируйте и записывайте поток до тех пор, пока он не уменьшится до 10% от исходной записи или не достигнет нуля. Наблюдается устойчивое снижение, как только тромб начинает образовываться в месте повреждения (рис. 3C). Обратите внимание на любые значительные колебания потока в течение этого времени.
   7. Чтобы изучить стабильность тромба, фиксируйте быстрое увеличение кровотока после каждого значительного и последовательного снижения. Эти события классифицируются как эмболизация из-за нестабильного тромбоза (рис. 4D). После последовательного уменьшения потока оператор может увидеть повреждение артерии в конце эксперимента (рис. 2F, синяя стрелка/пунктирный овал).
   8. Время окклюзии сосудов определяется как полное прекращение кровотока не менее чем на 1 мин. Запишите время, в которое образуется окклюзионный тромб, о чем свидетельствует нулевое показание или значительное уменьшение потока.
   9. Завершите эксперимент на 30 минуте. Если тромб не образуется в течение 30 минут после мониторинга, то запишите поток, остановите запись и извлеките зонд.
   10. Очистите зонд 70% этанолом и щеткой, чтобы удалить остатки ткани/волос или мусора. Полностью высушите зонд, прежде чем помещать его в ящик для хранения. Полностью высушите зонд, прежде чем помещать его в ящик для длительного хранения.
   11. Усыпить мышь вывихом шейки матки. Поместите тушу в пакет для утилизации туши, помеченный названием лаборатории и датой.

2. Сбор и подготовка образцов для серийной блочной сканирующей электронной микроскопии (SBF-SEM) после повреждения, вызванного FeCl₃

ПРИМЕЧАНИЕ: Представленный протокол EM подходит для подготовки образцов для SBF-SEM. Этот метод визуализации предлагает беспрецедентную возможность изучения трехмерной структуры тромбоцитов в сгустке. С помощью этого метода образец визуализируется в виде серии последовательных блочных изображений SEM, генерируемых по мере прохождения образца. Ключевыми моментами для этой подготовки являются: 1) образец должен быть окрашен тяжелыми металлами с предварительным встраиванием; и 2) пластиковый закладной образец должен быть соответствующим образом обрезан для монтажа в СЭМ (см. Рисунок 6 для изображения обрезанных образцов). Окрашивание после встраивания в СЭМ невозможно. При сборе образца из повреждения сосуда, вызванного FeCl₃, для ЭМ-анализа необходимо внести следующие изменения во время выполнения операции. Представленные модификации хирургического протокола FeCl₃ также применимы к любой форме электронной микроскопии. Условия анестезии и этапы разреза и обнажения сонной артерии такие же, как и в Протоколе 1.

1. Обнажив сонную артерию, отметьте место травмы, свободно опоясав область между двумя хирургическими нитями (размер: 0,1 мм) (рис. 5A, B).
2. Поместите зонд под артерию, дистальнее нижней нити (рис. 5C).
3. Вставьте пластиковую деталь под артерию между двумя нитями, чтобы отметить место повреждения FeCl₃ (рис. 5C).
4. Перед выполнением травмы проведите измерения потока, чтобы отметить базальный поток. Эти измерения используются для принятия решения о том, на каком этапе будет собираться образец.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что фиксатор (3% параформальдегид / PFA + 0,1% глутаровый альдегид, оба изготовлены в 1x PBS) готов и находится в RT. В качестве альтернативы можно также использовать фиксацию с 2,5% глутарового альдегида на физиологическом фоне.
   ВНИМАНИЕ: И параформальдегид, и глутаровый альдегид очень токсичны и раздражают. При обращении с ними следует использовать перчатки, щиток для глаз и маски для защиты от воздействия. Все фиксирующие растворы токсичны, и этапы фиксации следует проводить в вытяжном шкафу.
5. Выполните травму, поместив пропитанную FeCl 3 фильтровальную бумагу на артерию (используется 8% FeCl 3) на₃ минуты (это время также может варьироваться). Через 3 минуты снимите фильтровальную бумагу и добавьте физиологический раствор в место повреждения, чтобы удалить избыток FeCl₃. Этот шаг необходим для предотвращения различной степени повреждения и облегчения подсчета потока с помощью зонда (рис. 5D).
6. Следите за показаниями расхода. Когда расход упадет ниже 50% от исходного значения, снимите зонд. Быстро высушите область и добавьте фиксатор в область, чтобы внешне зафиксировать область травмы.
7. Быстро зажмите артерию рядом с областью травмы щипцами и срежьте вниз по течению от нижней нити и вверх по течению от верхней нити. При необходимости попросите другого человека помочь отрезать один конец. Положите ткань на пластиковую чашку для культивирования ткани в той же ориентации, в которой она была собрана, и добавьте несколько капель фиксатора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перерезание артерии вызывает немедленное обширное кровотечение, поэтому обязательно держите артерию, прежде чем перерезать ее в первый раз. В этом случае мышь обескровливается. Мышь усыпляют путем обескровливания и вывиха шейки матки.
8. С помощью скальпеля очистите лишнюю ткань вокруг артерии. Не забывайте записывать ориентацию кровотока. Чтобы отметить это, отрежьте один конец горизонтально, а другой сужающийся/косой (рис. 5E).
9. Держите образец в фиксаторе (3% PFA и 0,1% глутарового альдегида) в течение 1 ч при ЛТ. Затем храните образец в 1% PFA при 4 ° C до отправки его на влажном льду в лабораторию обработки образцов для ЭМ-анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы не должны быть заморожены. Проблемы, связанные с этим методом отбора проб, заключаются в следующем:
   1. Первоначальные показания могут быть неоптимальными или могут колебаться после травмы. Это может повлиять на степень травмы, выбранной для остановки для ЭМ-анализа. Чтобы решить эту проблему, обязательно запишите базовые показания в течение нескольких минут, попробовав различные положения размещения зонда, чтобы решить, какое положение является оптимальным.
   2. Время, необходимое для купирования травмы путем добавления внешнего фиксатора и фактического разрезания артериального участка для анализа, может добавить вариабельность степени тромбоза. Будьте быстры во время отбора проб после внешней фиксации.
10. Получение образцов для обработки для ЭМ-анализа в 1% PFA на влажном льду. Промойте образцы в течение 3 минут на льду с 0,1 М какодилатным буфером, чтобы начать дальнейшую обработку.
11. Зафиксируйте образцы на 1 ч на льду в 0,1 М какодилатном буфере + 2,5% глутарового альдегида + 2 мМ_CaCl2.
12. Выбросьте фиксатор и промойте образцы холодным 0,1 М буфером какодилата натрия, содержащим 2 мМ CaCl2 (5 x 3 мин_{) (}рис. 6А).
13. Зафиксировать образцы раствором осмия (3% ферроцианид калия [K 4 C 6 N₆Fe] + 0,3 М какодилатный буфер + 4 мМ CaCl 2, смешанный с равным объемом 4% водного тетраоксида осмия [OsO₄; в ddH₂ O]) в течение 1 ч на льду.
14. Пока образцы фиксируются, сделайте свежий 1% раствор гидрата трихлорацетальдегида (TCH) в ddH₂O. Инкубируйте раствор при 60 ° C в течение 1 ч, осторожно перемешивая.
15. После фиксации промойте образцы ddH₂O при RT в течение 5 x 3 мин.
16. Инкубируют образцы в отфильтрованном 1% растворе TCH (изготовленном в ddH₂O) в течение 20 мин при РТ.
17. Промойте образцы ddH₂O при RT (5 x 3 мин).
18. Зафиксируйте образцы в 2% тетраоксиде осмия в ddH₂O в течение 30 мин при ЛТ.
19. Промойте образцы ddH₂O при RT в течение 5 x 3 мин каждый.
20. Поместите образцы в 1% уранилацетат (водный) и инкубируйте в течение ночи при температуре 4 ° C.
21. Промойте образцы ddH₂O при RT в течение 5 x 3 мин каждый и обработайте их с помощью окрашивания аспартатом свинца по Уолтону.
22. Монолитный Окрашивание свинцовым аспартатом Уолтона³:
    1. Сделайте 30 мМ раствора L-аспарагиновой кислоты в ddH₂O.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Аспарагиновая кислота растворяется быстрее, если рН повышен до 3,8. Этот стоковый раствор стабилен в течение 1-2 месяцев при хранении в холодильнике.
    2. Сделайте 20 мМ раствора нитрата свинца в 10 мл аспарагиновой кислоты и отрегулируйте рН до 5,5 с помощью 1 N KOH.
    3. Поместите образцы в раствор аспартата свинца при 60 ° C на 30 мин, после пяти промывок ddH₂O при RT, каждая в течение 3 мин.
23. Обезвоживайте образцы с помощью градуированной серии этанола. Используйте химическое обезвоживание по протоколу^{Вальдивии 18}.
    1. Промойте образцы в каждом из следующих растворов, чтобы постепенно обезвоживать образец (рис. 6B):
       25% этиловый спирт в течение 3 мин
       50% этиловый спирт в течение 3 мин
       75% этиловый спирт в течение 3 мин
       95% этиловый спирт в течение 3 мин
       100% этиловый спирт в течение 10 минут и повторите шаг дважды (всего три стирки).
24. Промойте образцы в 100% оксиде пропилена (PO) в течение 10 минут и повторите этот шаг дважды (всего три стирки).
25. Инкубируйте в 50%/50% PO/смоле с активатором DMP 30 в течение ночи при RT и встраивайте в 100% Araldite 502/embed 812/DDSA с активатором DMP30 в течение 48 часов.

Результаты

Данные обычно представляются как время до окклюзии или время, необходимое для формирования полностью окклюзионного тромба. Эти данные могут быть построены в виде кривой выживаемости Каплана-Мейера (рис. 4A)¹⁹, точечной диаграммы с полосами, показывающими конечный кровоток в...

Обсуждение

Местное применение FeCl₃ в сосудистой сети для индукции тромбоза является широко используемым методом и играет важную роль в установлении ролей различных рецепторов тромбоцитов, сигнальных путей лиганда и их ингибиторов^{20,21,22,23<...}

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline	Fisher Scientific	BP358-212	NaCl used to make a solution of 0.9% saline
1 mL Syringe	Becton, Dickinson and Company	309659
190 Proof Ethanol	KOPTEC	V1101	Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery
2,2,2 Tribromoethanol	Sigma Aldrich	48402
25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0)	DEKNATEL	136082-1204
26G x 3/8 Needle	Becton, Dickinson and Company	305110
2-methyl-2-butanol	Sigma Aldrich	240486
7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL	Globe Scientific Inc.	135010
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)	Medline	MDS090735
Araldite GY 502	Electron microscopy Services	10900
Cell Culture Dish 35mm X 10mm	Corning Incorporated	430165
Compact Scale	Ward's Science	470314-390
Dissecting Scissors, 12.5 cm long	World Precision Instrument	15922-G
DMP-30 activator	Electron microscopy Services	13600
Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA	Electron microscopy Services	13700
Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag	Crown Products	PP-RB-200
Doppler FlowProbe	Transonic Systems Inc.	MA0.5PSB
EMBED 812 resin	Electron microscopy Services	14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof	Electron microscopy Services	15055
Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips	Integra Miltex	18-784
Filter Paper	VWR	28310-106
Fine Scissors - Sharp-Blunt	Fine Science Tools	14028-10
Finger Loop Ear Punches	Fine Science Tools	24212-01
Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply	Dukal Corporation	2128
Glutaraldehyde (10% solution)	Electron microscopy Services	16120
Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10	Integra® Miltex®	4110
Iron (III) Chloride	SIGMA-ALDRICH	157740-100G
Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3	Integra Lifesciences	157510
L-aspartic acid	Sigma Fisher	A93100
L-aspartic acid	Fisher Scientific	BP374-100
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L-62
LEICA S8AP0 Microscope	LEICA	No longer available	No longer available from the company
LEICA S8AP0 Microscope Stand	LEICA	10447255	No longer available from the company
Light-Duty Tissue Wipers	VWR	82003-822
Micro Dissecting Forceps; 1x2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical Instrument Company	RS-5157
Osmium Tetroxide 4% aqueous solution	Electron microscopy Services	19150
Paraformaldehyde (16% solution)	Electron microscopy Services	15710
Potassium ferricyanide	SIGMA-ALDRICH	P-8131
Propylene Oxide, ACS reagent	Electron microscopy Services	20401
Rainin Classic Pipette PR-10	Rainin	17008649
Research Flowmeter	Transonic Systems Inc.	T402B01481	Model: T402
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear	Scotch	305289
Small Animal Heated Pad	K&H Manufacturing Inc.	Model: HM10
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4	Electron microscopy Services	11623
Sterile Cotton Tipped Applicators	Puritan Medical Products	25-806 1WC
Steromaster Illuminator	Fisher Scientific	12-562-21	No longer available from the company
Surgical Dumont #7 Forceps	Fine Science Tools	11271-30
Thiocarbohydrazide (TCH)	SIGMA-ALDRICH	88535
Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL)	VWR	76323-394
Uranyl Acetate	Electron microscopy Services	22400
Veet Gel Cream Hair Remover	Reckitt Benckiser	3116875
White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm	Fisher Scientific	S38975
WinDAQ/100 Software for Windows	DATAQ Instruments, Inc.	Version 3.38	Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/
ZEISS AxioCam Icc 1	ZEISS	57615