Артериальный тромбоз, индуцированный хлоридом железа, и сбор образцов для анализа 3D-электронной микроскопии

Резюме

Настоящий протокол описывает, как использовать FeCl-3-опосредованное повреждение для индукции артериального тромбоза, а также как собирать и подготавливать образцы артериального повреждения на различных стадиях тромбоза для анализа электронной микроскопии.

Аннотация

Сердечно-сосудистые заболевания являются одной из основных причин смертности и заболеваемости во всем мире. Аберрантный тромбоз является общей чертой системных состояний, таких как диабет и ожирение, а также хронических воспалительных заболеваний, таких как атеросклероз, рак и аутоиммунные заболевания. При повреждении сосудов обычно свертывающая система, тромбоциты и эндотелий действуют организованно, чтобы предотвратить кровотечение, образуя сгусток в месте повреждения. Аномалии в этом процессе приводят либо к чрезмерному кровотечению, либо к неконтролируемому тромбозу / недостаточной антитромботической активности, что приводит к окклюзии сосудов и ее последствиям. Модель повреждения сонной артерии, индуцированная FeCl₃, является ценным инструментом для исследования того, как тромбоз инициируется и прогрессирует in vivo. Эта модель включает повреждение / денудацию эндотелия и последующее образование сгустка в поврежденном месте. Он обеспечивает высокочувствительный количественный анализ для мониторинга повреждения сосудов и образования сгустков в ответ на различные степени повреждения сосудов. После оптимизации этот стандартный метод может быть использован для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе тромбоза, а также ультраструктурных изменений тромбоцитов в растущем тромбе. Этот анализ также полезен для изучения эффективности антитромботических и антиагрегантных средств. В этой статье объясняется, как инициировать и контролировать FeCl-3-индуцированный артериальный тромбоз и как собирать образцы для анализа с помощью электронной микроскопии.

Введение

Тромбоз - это образование сгустка крови, который частично или полностью блокирует кровеносный сосуд, препятствуя естественному току крови. Это приводит к тяжелым и смертельным сердечно-сосудистым событиям, таким как ишемическая болезнь сердца и инсульты. Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной заболеваемости и смертности и являются причиной каждой четвертой смерти во всем мире ^1,2,3. Хотя тромбоз проявляется как нарушение работы сосудистой системы, он может быть результатом основной микробной или вирусной инфекции, иммунного расстройства, злокачественных но....

протокол

Все эксперименты, обсуждаемые здесь, были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Кентукки.

ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургические инструменты перечислены на рисунке 1 и в таблице материалов. Использовали мышей C57BL/6J в возрасте 8-10 недель, самцов/самок или соответствующие генетически модифицированные (нокаутные или нокаутные) штаммы.

1. FeCl3-индуцированное повреждение сонной артерии

1. Индукция анестезии мыши
   1. Взвесьте мышь.
   2. Обезболивают мышей, вводя....

Результаты

Данные обычно представляются как время до окклюзии или время, необходимое для формирования полностью окклюзионного тромба. Эти данные могут быть построены в виде кривой выживаемости Каплана-Мейера (рис. 4A)¹⁹, точечной диаграммы с полосами, показывающими конечный кровоток в.......

Обсуждение

Местное применение FeCl₃ в сосудистой сети для индукции тромбоза является широко используемым методом и играет важную роль в установлении ролей различных рецепторов тромбоцитов, сигнальных путей лиганда и их ингибиторов^{20,21,22,23<.......}

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline	Fisher Scientific	BP358-212	NaCl used to make a solution of 0.9% saline
1 mL Syringe	Becton, Dickinson and Company	309659
190 Proof Ethanol	KOPTEC	V1101	Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery
2,2,2 Tribromoethanol	Sigma Aldrich	48402
25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0)	DEKNATEL	136082-1204
26G x 3/8 Needle	Becton, Dickinson and Company	305110
2-methyl-2-butanol	Sigma Aldrich	240486
7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL	Globe Scientific Inc.	135010
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)	Medline	MDS090735
Araldite GY 502	Electron microscopy Services	10900
Cell Culture Dish 35mm X 10mm	Corning Incorporated	430165
Compact Scale	Ward's Science	470314-390
Dissecting Scissors, 12.5 cm long	World Precision Instrument	15922-G
DMP-30 activator	Electron microscopy Services	13600
Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA	Electron microscopy Services	13700
Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag	Crown Products	PP-RB-200
Doppler FlowProbe	Transonic Systems Inc.	MA0.5PSB
EMBED 812 resin	Electron microscopy Services	14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof	Electron microscopy Services	15055
Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips	Integra Miltex	18-784
Filter Paper	VWR	28310-106
Fine Scissors - Sharp-Blunt	Fine Science Tools	14028-10
Finger Loop Ear Punches	Fine Science Tools	24212-01
Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply	Dukal Corporation	2128
Glutaraldehyde (10% solution)	Electron microscopy Services	16120
Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10	Integra® Miltex®	4110
Iron (III) Chloride	SIGMA-ALDRICH	157740-100G
Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3	Integra Lifesciences	157510
L-aspartic acid	Sigma Fisher	A93100
L-aspartic acid	Fisher Scientific	BP374-100
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L-62
LEICA S8AP0 Microscope	LEICA	No longer available	No longer available from the company
LEICA S8AP0 Microscope Stand	LEICA	10447255	No longer available from the company
Light-Duty Tissue Wipers	VWR	82003-822
Micro Dissecting Forceps; 1x2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical Instrument Company	RS-5157
Osmium Tetroxide 4% aqueous solution	Electron microscopy Services	19150
Paraformaldehyde (16% solution)	Electron microscopy Services	15710
Potassium ferricyanide	SIGMA-ALDRICH	P-8131
Propylene Oxide, ACS reagent	Electron microscopy Services	20401
Rainin Classic Pipette PR-10	Rainin	17008649
Research Flowmeter	Transonic Systems Inc.	T402B01481	Model: T402
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear	Scotch	305289
Small Animal Heated Pad	K&H Manufacturing Inc.	Model: HM10
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4	Electron microscopy Services	11623
Sterile Cotton Tipped Applicators	Puritan Medical Products	25-806 1WC
Steromaster Illuminator	Fisher Scientific	12-562-21	No longer available from the company
Surgical Dumont #7 Forceps	Fine Science Tools	11271-30
Thiocarbohydrazide (TCH)	SIGMA-ALDRICH	88535
Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL)	VWR	76323-394
Uranyl Acetate	Electron microscopy Services	22400
Veet Gel Cream Hair Remover	Reckitt Benckiser	3116875
White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm	Fisher Scientific	S38975
WinDAQ/100 Software for Windows	DATAQ Instruments, Inc.	Version 3.38	Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/
ZEISS AxioCam Icc 1	ZEISS	57615