Trombosis arterial inducida por cloruro férrico y recolección de muestras para análisis de microscopía electrónica 3D

Resumen

El presente protocolo describe cómo utilizar una lesión mediada por FeCl₃ para inducir trombosis arterial, y cómo recoger y preparar muestras de lesión arterial en diversas etapas de trombosis para el análisis de microscopía electrónica.

Resumen

Las enfermedades cardiovasculares son una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en todo el mundo. La trombosis aberrante es una característica común de afecciones sistémicas como la diabetes y la obesidad, y enfermedades inflamatorias crónicas como la aterosclerosis, el cáncer y las enfermedades autoinmunes. Tras una lesión vascular, generalmente el sistema de coagulación, las plaquetas y el endotelio actúan de manera orquestada para prevenir el sangrado formando un coágulo en el sitio de la lesión. Las anomalías en este proceso conducen a sangrado excesivo o trombosis incontrolada / actividad antitrombótica insuficiente, lo que se traduce en oclusión de los vasos y sus secuelas. El modelo de lesión carotídea inducida por FeCl₃ es una herramienta valiosa para investigar cómo se inicia y progresa la trombosis in vivo. Este modelo implica daño endotelial/denudación y posterior formación de coágulos en el sitio lesionado. Proporciona un ensayo cuantitativo altamente sensible para monitorear el daño vascular y la formación de coágulos en respuesta a diferentes grados de daño vascular. Una vez optimizada, esta técnica estándar se puede utilizar para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes a la trombosis, así como los cambios ultraestructurales en las plaquetas en un trombo en crecimiento. Este ensayo también es útil para estudiar la eficacia de los agentes antitrombóticos y antiplaquetarios. Este artículo explica cómo iniciar y monitorear la trombosis arterial inducida por FeCl₃ y cómo recolectar muestras para su análisis por microscopía electrónica.

Introducción

La trombosis es la formación de un coágulo de sangre que bloquea parcial o completamente un vaso sanguíneo, impidiendo el flujo natural de la sangre. Esto conduce a eventos cardiovasculares graves y fatales, como cardiopatía isquémica y accidentes cerebrovasculares. Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de morbilidad y mortalidad, y causan una de cada cuatro muertes en todo el mundo ^1,2,3. Aunque la trombosis se manifiesta como un mal funcionamiento del sistema vascular, podría ser el resultado de una infección microbiana o viral subyacente, un trastorno inmunitario, una neoplasia maligna o una afección metabólica. El flujo de sangre es mantenido por la compleja interacción entre diversos componentes del sistema vascular, incluyendo células endoteliales, glóbulos rojos/blancos, plaquetas y factores de coagulación⁴. Tras la lesión vascular, las plaquetas interactúan con proteínas adhesivas en la matriz subendotelial y liberan su contenido granular, que recluta más plaquetas⁵. Al mismo tiempo, la cascada de coagulación se activa, lo que lleva a la formación y deposición de fibrina. En última instancia, se forma un coágulo, que contiene plaquetas y glóbulos rojos atrapados dentro de una malla de fibrina⁶. Aunque hay fármacos antiplaquetarios y anticoagulantes disponibles para modular la trombosis, el sangrado espurio sigue siendo una preocupación importante con estas terapias, lo que requiere un ajuste fino de las dosis y combinaciones de estos fármacos. Por lo tanto, todavía hay una necesidad urgente de descubrir nuevos fármacos antitrombóticos⁷.

La trombosis se estudia utilizando múltiples métodos para infligir lesiones vasculares: mecánicas (ligadura de vasos), térmicas (lesión con láser) y químicas (aplicación de FeCl₃ / Rosa de Bengala). La naturaleza de la trombosis varía según la ubicación (arterial vs. venosa), el método o la extensión de la lesión. Entre todos estos tipos, la lesión vascular inducida por FeCl₃ es el método más utilizado. Se ha empleado en ratones, ratas, conejos, conejillos de indias y perros 8,9,10,11,12. El método es relativamente simple, fácil de usar y, si los parámetros principales están estandarizados, es sensible y reproducible en varios sistemas vasculares (por ejemplo, arterias [carótidas y femorales], venas [yugulares] y arteriolas [cremáster y mesentérica]) (Tabla suplementaria 1).

Este modelo también se puede utilizar para ampliar nuestra comprensión de la mecánica y la morfología de la formación de coágulos. Esta técnica ofrece la ventaja única de detener la trombosis en varios puntos de velocidad de flujo, para estudiar las etapas intermedias del proceso antes de que se vuelva oclusivo. Los avances recientes en la investigación de la trombosis han utilizado este modelo para centrar la atención en métodos no farmacológicos de trombólisis¹³ o administración no invasiva de agentes antitrombóticos y/o fibrinolíticos^14,15. Varios grupos han demostrado que, cuando las membranas plaquetarias están recubiertas con estas terapias, los fármacos pueden activarse tras la estimulación térmica para atacar los coágulos¹⁶. Las técnicas descritas aquí pueden ser útiles para estudios tales como la validación de sus hallazgos a nivel de plaqueta única. En este manuscrito, el Protocolo 1 describe el procedimiento básico de lesión vascular mediada por FeCl₃, mientras que el Protocolo 2 describe el método para recolectar y fijar la muestra de lesión vascular para su posterior análisis por microscopía electrónica.

Protocolo

Todos los experimentos discutidos aquí fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Kentucky.

NOTA: Los instrumentos quirúrgicos se enumeran en la Figura 1 y en la Tabla de materiales. Se utilizaron ratones C57BL/6J, de 8-10 semanas de edad, machos/hembras o cepas genéticamente manipuladas relevantes (Knockout o Knockin).

1. Lesión de la arteria carótida inducida por FeCl₃

1. Inducción de anestesia en ratón
   1. Pesa el ratón.
   2. Anestesiar al ratón inyectando 0,2 g/kg de solución de tribromoetanol por vía intraperitoneal (i.p.). Asegúrese de que la solución anestésica esté a temperatura ambiente (RT) antes de inyectarla. Esta dosis es suficiente para sedar al ratón durante aproximadamente 1 h.
   3. Compruebe el reflejo del dedo del pie pellizcando el dedo del pie 5 minutos después de la inyección para asegurarse de que el ratón esté sedado. Si el ratón no está sedado, tirará de su dedo del pie. Si eso sucede, espere 5 minutos y verifique nuevamente.
   4. Si el ratón aún no está completamente sedado, administre 1/4 de la dosis inicial y espere 5 minutos.
   5. A lo largo del procedimiento, controle periódicamente el plano anestésico del ratón a través de un pellizco en el dedo del pie. Además, la frecuencia respiratoria y la temperatura corporal también podrían controlarse para mantener una anestesia óptima.
2. Inmovilizar el ratón
   1. Coloque el ratón sobre la almohadilla térmica (37 °C) en posición supina y utilice cinta adhesiva para inmovilizar las extremidades.
   2. Use un hilo quirúrgico (0,1 mm) para tirar suavemente de los dientes frontales superiores del ratón para extender la región cervical/cuello. Esto es importante para una mejor visualización del área quirúrgica y la estabilidad de la sonda Doppler. El tamaño del hilo no es importante, ya que solo se usa para tirar de los dientes frontales del animal para extender el cuello.
3. Incisión
   1. Rocíe el área quirúrgica con etanol al 70% o límpiela con una toallita con alcohol.
   2. Usando un hisopo de algodón, aplique una pequeña cantidad de crema depilatoria en el área quirúrgica. Espere 1-2 minutos y luego use una toalla de papel húmeda o un pañuelo de papel para quitar la crema.
      NOTA: Este paso es importante para un área quirúrgica limpia.
   3. Usando tijeras y fórceps (Figura 1B11,1B13), haga una incisión en la línea media desde la mandíbula hasta la muesca supraesternal. Retraer la piel para obtener una mejor visualización de la zona (Figura 2A).
4. Exposición a la arteria carótida
   1. Usando fórceps quirúrgicos y pinzas de micro disección, diseccionar roma la fascia superficial superpuesta y retirarla para exponer la arteria carótida izquierda (Figura 1B12,1B13). Asegúrese de no usar tijeras en esta etapa para evitar lesionar otras vasculaturas en esta área.
   2. Retire el tejido adicional que rodea la arteria carótida. Evite la disección excesiva del tejido circundante, ya que esta área alberga el nervio vago y la arteria vertebral.
   3. Separar la arteria carótida del tejido circundante diseccionándola con fórceps quirúrgicos y de sutura (Figura 1B12,1B15,2C). Asegúrese de no extender o tirar de la arteria para evitar cualquier lesión mecánica en la arteria o la vasculatura circundante.
   4. Coloque un pedazo de plástico debajo de la arteria para marcar la ubicación de la lesión (Figura 2D). Use una hoja de transparencia de color para que sea más fácil de ver en el campo quirúrgico.
5. Colocación de la sonda de flujo
   1. Coloque la sonda de flujo transónico Doppler en solución salina (0,9% de NaCl en dH₂O) durante unos 10 minutos antes de la cirugía. Inserte el otro extremo de la sonda en un accesorio en el caudalímetro para facilitar la lectura del flujo. Conecte el caudalímetro a un ordenador.
      NOTA: Entre cirugías, la sonda de flujo transónico Doppler debe estar en solución salina. Asegúrese de mantener la sonda húmeda y limpia durante todo el procedimiento.
   2. Coloque la sonda de flujo transónico Doppler por ultrasonido alrededor de la arteria aguas arriba del plástico (Figura 2D). Asegúrese de que la región del soporte del recipiente de la sonda no esté demasiado extendida (Figura 1C, flecha roja).
      NOTA: Si es necesario, apoye la sonda con almohadillas de gasa (Figura 1B1) para lograr una altura adecuada de la sonda, facilitando la posición óptima de lectura.
   3. Si el área quirúrgica está seca en este punto, agregue unas gotas de solución salina RT para mantener el área húmeda. Monitoree la lectura de la sonda de flujo. La lectura óptima varía para cada animal y podría estar entre 0.6-1.2 ml / min. Si es menos estable o no es estable, cambie la posición de la sonda de flujo para obtener una lectura óptima.
      NOTA: Asegúrese de que el cuello del ratón no esté demasiado extendido y que el área quirúrgica esté limpia.
6. Registrar la línea base de flujo
   1. Después de colocar la sonda, controle el flujo sanguíneo durante 2 minutos para asegurarse de que el flujo sea constante. Luego, registre el flujo durante 2 minutos (Figura 3B) como línea de base. Para una descripción detallada del caudalímetro, véase Subramaniam et ^al.17.
   2. Para registrar el flujo sanguíneo, inicie el software WinDAQ. Haga clic en la opción Archivo y luego haga clic en Grabar. Cree una nueva carpeta y archivo, y comience a grabar. Para detener la grabación, haga clic en Detener en la sección de archivos.
      NOTA: El software WinDAQ está disponible gratuitamente en el editor: https://www.dataq.com/products/windaq/.
7. Herida
   1. Detenga la grabación del flujo. Asegúrese de no alterar la posición de la sonda para que las lecturas permanezcan consistentes después de la lesión.
   2. Seque bien el área con una toallita / toalla de papel.
      NOTA: Incluso un pequeño volumen de líquido residual puede alterar la concentración de la solución de FeCl₃ utilizada para infligir lesión vascular. Esto conduce a resultados variables y afecta la reproducibilidad. Cuando el área está completamente seca, la sonda no puede medir el flujo.
   3. En un bote de pesaje de plástico, coloque un papel de filtro circular (1 mm de diámetro, cortado con un punzón de oreja de 1 mm de diámetro). Añadir 1 μL de solución de FeCl₃ al 6% (hecha en_dH2O) sobre el papel de filtro.
      NOTA: Asegúrese de agregar la solución FeCl₃ justo antes de usar el papel de filtro. Remojar el papel demasiado pronto puede conducir a la evaporación de la solución de FeCl₃ y cambiar la gravedad de la lesión.
   4. Usando pinzas finas, tome el papel de filtro y colóquelo en la arteria aguas arriba de la sonda, en la parte de la arteria marcada por el plástico (Figura 2D, E). Este plástico actúa como un marcador y un espaciador. Marca el área lesionada y evita la dilución accidental del FeCl₃ al evitar el contacto con el área húmeda circundante.
      NOTA: Asegúrese de que el papel de filtro esté recto, no pellizcado ni doblado de ninguna manera. Una vez colocado en la arteria, no cambie la posición del papel de filtro; Hacerlo cambia la extensión de la lesión.
   5. Después de colocar el papel de filtro, encienda el temporizador y registre el flujo sanguíneo. Después de 3 minutos, retire el papel y agregue solución salina en el sitio de la lesión para eliminar el FeCl₃ y detener el proceso de lesión. También hace que el área sea húmeda. En esta etapa, el flujo sanguíneo debe volver al nivel basal, como se registró antes de la lesión.
   6. Monitoree y registre el flujo hasta que se reduzca al 10% de la grabación original o llegue a cero. Hay una disminución constante una vez que el trombo comienza a formarse en el sitio de la lesión (Figura 3C). Tenga en cuenta cualquier fluctuación significativa en el flujo durante este tiempo.
   7. Para estudiar la estabilidad del trombo, registre el rápido aumento en el flujo sanguíneo después de cada disminución significativa y consistente. Estos eventos se clasifican como embolización debido a trombosis inestable (Figura 4D). Después de la disminución constante del flujo, el operador puede ver la lesión en la arteria al finalizar el experimento (Figura 2F, flecha azul/óvalo punteado).
   8. El tiempo de oclusión del vaso se define como el cese completo del flujo sanguíneo durante al menos 1 minuto. Registre el momento en que se forma un trombo oclusivo, como lo muestra la lectura cero o la disminución significativa del flujo.
   9. Termine el experimento a los 30 minutos. Si el trombo no se forma dentro de los 30 minutos posteriores al monitoreo, registre el flujo, detenga el registro y retire la sonda.
   10. Limpie la sonda con etanol al 70% y un cepillo para eliminar cualquier tejido / cabello residual o residuos. Seque la sonda completamente antes de colocarla en la caja de almacenamiento. Seque la sonda completamente antes de colocarla en la caja de almacenamiento para el almacenamiento a largo plazo.
   11. Eutanasia al ratón por luxación cervical. Coloque la carcasa en la bolsa de desecho de la carcasa, etiquetada con el nombre del laboratorio y la fecha.

2. Recolección y preparación de muestras para estudios de microscopía electrónica de barrido facial en bloque en serie (SBF-SEM) después de la lesión inducida por FeCl₃

NOTA: El protocolo EM presentado es apropiado para la preparación de muestras para SBF-SEM. Esta técnica de imagen ofrece una capacidad sin precedentes para estudiar la estructura tridimensional de las plaquetas en un coágulo. Con esta técnica, la muestra se visualiza como una serie de imágenes SEM de bloques secuenciales, generadas a medida que se avanza a través de la muestra. Los puntos clave para esta preparación son: 1) la muestra debe teñirse con metales pesados previamente incrustados; y 2) la muestra de plástico incrustada debe recortarse adecuadamente para su montaje dentro del SEM (consulte la Figura 6 para obtener una visualización de las muestras recortadas). La tinción posterior a la incrustación no es posible dentro del SEM. Al recolectar una muestra de una lesión vascular inducida por FeCl₃ para el análisis EM, se deben realizar los siguientes cambios al realizar la cirugía. Las modificaciones en el protocolo quirúrgico FeCl₃ presentado también son aplicables a cualquier forma de microscopía electrónica. Las condiciones de anestesia y los pasos para hacer una incisión y exponer la arteria carótida son los mismos que en el Protocolo 1.

1. Después de exponer la arteria carótida, marque el sitio de la lesión rodeando ligeramente la región entre dos hilos quirúrgicos (tamaño: 0.1 mm) (Figura 5A, B).
2. Coloque la sonda debajo de la arteria, distal desde el hilo inferior (Figura 5C).
3. Inserte la pieza de plástico debajo de la arteria entre los dos hilos para marcar el sitio para la lesión de FeCl₃ (Figura 5C).
4. Tome medidas de flujo antes de realizar una lesión para observar el flujo basal. Estas mediciones se utilizan para decidir en qué etapa se recogerá la muestra.
   NOTA: Asegúrese de que el fijador (3% paraformaldehído/PFA + 0.1% glutaraldehído, ambos hechos en 1x PBS) esté listo y en RT. Alternativamente, también se podría usar la fijación con glutaraldehído al 2.5% en un fondo salino.
   PRECAUCIÓN: Tanto el paraformaldehído como el glutaraldehído son altamente tóxicos e irritantes. Mientras los manipula, se deben usar guantes, un protector ocular y máscaras para protegerse de la exposición. Todas las soluciones fijadoras son tóxicas, y los pasos de fijación deben llevarse a cabo en una campana extractora.
5. Realice la lesión colocando papel de filtro empapado en FeCl 3 en la arteria (se usa 8% de FeCl 3) durante₃ minutos (este tiempo también podría variar). Después de 3 minutos, retire el papel de filtro y agregue solución salina en el sitio de la lesión para eliminar cualquier exceso de FeCl₃ residual. Este paso es necesario para prevenir la extensión variable de la lesión y para facilitar el conteo de flujo por la sonda (Figura 5D).
6. Monitoree la lectura del flujo. Cuando el flujo caiga por debajo del 50% del valor inicial, retire la sonda. Seque rápidamente el área y agregue el fijador en el área para reparar externamente el área de la lesión.
7. Sostenga rápidamente la arteria cerca del área de la lesión con fórceps y corte aguas abajo del hilo inferior y aguas arriba del hilo superior. Si es necesario, pídale a otra persona que le ayude a cortar un extremo. Coloque el pañuelo en el plato de cultivo de tejido plástico en la misma orientación en que se recogió y agregue unas gotas del fijador.
   NOTA: Cortar la arteria causa sangrado extenso inmediato, así que asegúrese de sostener la arteria antes de cortarla la primera vez. En este escenario, el ratón está desangrado. El ratón es sacrificado por exsanguinación y dislocación cervical.
8. Con un bisturí, limpie el tejido adicional alrededor de la arteria. Tenga cuidado de registrar la orientación del flujo sanguíneo. Para marcar eso, corte un extremo horizontalmente y el otro cónico/oblicuo (Figura 5E).
9. Mantener la muestra en fijador (3% PFA y 0,1% glutaraldehído) durante 1 h en RT. Luego, almacene la muestra en PFA al 1% a 4 °C hasta enviarla en hielo húmedo al laboratorio de procesamiento de muestras para el análisis EM.
   NOTA: Las muestras no deben congelarse. Los desafíos para este método de recolección de muestras son:
   1. La lectura inicial puede no ser óptima o puede fluctuar después de la lesión. Esto puede afectar el grado de lesión que se elige detener para el análisis EM. Para solucionar este problema, asegúrese de registrar la lectura de línea base durante unos minutos, después de probar varias posiciones de colocación de la sonda para decidir qué posición es óptima.
   2. El tiempo para detener la lesión mediante la adición de fijador externo y el corte real de la sección arterial para el análisis puede agregar variabilidad a la extensión de la trombosis. Sea rápido durante la recolección de muestras después de la fijación externa.
10. Reciba las muestras para su procesamiento para el análisis EM en PFA al 1% en hielo húmedo. Enjuague las muestras durante 3 minutos, en hielo, con tampón de cacodilato 0,1 M para iniciar el procesamiento posterior.
11. Fijar las muestras durante 1 h en hielo en tampón de cacodilato 0,1 M + glutaraldehído al 2,5% + CaCl₂ mM.
12. Deseche el fijador y lave las muestras con tampón de cacodilato de sodio 0,1 M frío que contenga 2 mM de CaCl₂ (5 x 3 min) (Figura 6A).
13. Fijar las muestras con solución de osmio (ferrocianuro potásico al 3% [K 4 C 6N₆Fe] + tampón cacodilato 0,3 M + CaCl₂ 4 mM mezclado con un volumen igual de tetróxido de osmio acuoso al₄% [_OsO4; en_ddH2O]) durante 1 h sobre hielo.
14. Mientras se fijan las muestras, preparar una solución fresca de hidrato de tricloroacetaldehído al 1% (TCH) en_ddH2O. Incubar la solución a 60 °C durante 1 h mientras se mezcla suavemente.
15. Después de la fijación, lavar las muestras con_ddH2Oa RT durante 5 x 3 min.
16. Incubar las muestras en solución filtrada de TCH al 1% (hecha en_ddH2O) durante 20 min a RT.
17. Lavar las muestras con_ddH2Oa RT (5 x 3 min).
18. Fijar las muestras en tetróxido de osmio al 2% en_ddH2Odurante 30 min a RT.
19. Lave las muestras con_ddH2Oa RT durante 5 x 3 min cada una.
20. Colocar las muestras en acetato de uranilo al 1% (acuoso) e incubar durante la noche a 4 °C.
21. Lave las muestras con_ddH2Oa RT durante 5 x 3 minutos cada una, y procese con tinción de aspartato de plomo de Walton en bloque .
22. En bloque Tinción 3 de aspartato de plomo^de Walton:
    1. Hacer 30 mM de solución de ácido L-aspártico en_ddH2O.
       NOTA: El ácido aspártico se disuelve más rápidamente si el pH se eleva a 3,8. Esta solución madre es estable durante 1-2 meses si se refrigera.
    2. Haga 20 mM de solución de nitrato de plomo en 10 ml de cepas de ácido aspártico y ajuste el pH a 5.5 con 1 N KOH.
    3. Colocar las muestras en solución de aspartato de plomo a 60 °C durante 30 min, después de cinco lavados con_ddH2Oa RT, cada uno durante 3 min.
23. Deshidratar las muestras con una serie de etanol graduado. Utilice la deshidratación química por el protocolo^{Valdivia 18}.
    1. Lave las muestras en cada una de las siguientes soluciones para deshidratar progresivamente la muestra (Figura 6B):
       25% de alcohol etílico durante 3 min
       50% alcohol etílico durante 3 min
       75% de alcohol etílico durante 3 min
       95% de alcohol etílico durante 3 min
       100% alcohol etílico durante 10 min, y repetir el paso dos veces (total de tres lavados).
24. Lave las muestras en óxido de propileno (PO) al 100% durante 10 minutos y repita el paso dos veces (total de tres lavados).
25. Incubar en 50%/50% PO/resina con activador DMP 30 durante la noche en RT, e incrustar en 100% Araldite 502/embed 812/DDSA con activador DMP30 durante 48 h.

Resultados

Los datos generalmente se presentan como tiempo hasta la oclusión, o tiempo requerido para formar un trombo completamente oclusivo. Estos datos se pueden trazar como una curva de supervivencia de Kaplan-Meier (Figura 4A)¹⁹, un diagrama de puntos con barras que muestran el flujo sanguíneo terminal en el momento del cese del flujo sanguíneo o la finalización de un experimento (Figura 4B), o como un gráfico de líneas (Figura 4C).

Discusión

La aplicación tópica de FeCl₃ a la vasculatura para inducir trombosis es una técnica ampliamente utilizada, y ha sido fundamental para establecer roles para varios receptores plaquetarios, vías de señalización de ligandos y sus inhibidores^20,21,22,23. El mecanismo a través del cual FeCl₃ causa trombosis es multifacético; Anteriormente, la denudación endotelial era...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline	Fisher Scientific	BP358-212	NaCl used to make a solution of 0.9% saline
1 mL Syringe	Becton, Dickinson and Company	309659
190 Proof Ethanol	KOPTEC	V1101	Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery
2,2,2 Tribromoethanol	Sigma Aldrich	48402
25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0)	DEKNATEL	136082-1204
26G x 3/8 Needle	Becton, Dickinson and Company	305110
2-methyl-2-butanol	Sigma Aldrich	240486
7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL	Globe Scientific Inc.	135010
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)	Medline	MDS090735
Araldite GY 502	Electron microscopy Services	10900
Cell Culture Dish 35mm X 10mm	Corning Incorporated	430165
Compact Scale	Ward's Science	470314-390
Dissecting Scissors, 12.5 cm long	World Precision Instrument	15922-G
DMP-30 activator	Electron microscopy Services	13600
Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA	Electron microscopy Services	13700
Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag	Crown Products	PP-RB-200
Doppler FlowProbe	Transonic Systems Inc.	MA0.5PSB
EMBED 812 resin	Electron microscopy Services	14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof	Electron microscopy Services	15055
Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips	Integra Miltex	18-784
Filter Paper	VWR	28310-106
Fine Scissors - Sharp-Blunt	Fine Science Tools	14028-10
Finger Loop Ear Punches	Fine Science Tools	24212-01
Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply	Dukal Corporation	2128
Glutaraldehyde (10% solution)	Electron microscopy Services	16120
Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10	Integra® Miltex®	4110
Iron (III) Chloride	SIGMA-ALDRICH	157740-100G
Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3	Integra Lifesciences	157510
L-aspartic acid	Sigma Fisher	A93100
L-aspartic acid	Fisher Scientific	BP374-100
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L-62
LEICA S8AP0 Microscope	LEICA	No longer available	No longer available from the company
LEICA S8AP0 Microscope Stand	LEICA	10447255	No longer available from the company
Light-Duty Tissue Wipers	VWR	82003-822
Micro Dissecting Forceps; 1x2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical Instrument Company	RS-5157
Osmium Tetroxide 4% aqueous solution	Electron microscopy Services	19150
Paraformaldehyde (16% solution)	Electron microscopy Services	15710
Potassium ferricyanide	SIGMA-ALDRICH	P-8131
Propylene Oxide, ACS reagent	Electron microscopy Services	20401
Rainin Classic Pipette PR-10	Rainin	17008649
Research Flowmeter	Transonic Systems Inc.	T402B01481	Model: T402
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear	Scotch	305289
Small Animal Heated Pad	K&H Manufacturing Inc.	Model: HM10
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4	Electron microscopy Services	11623
Sterile Cotton Tipped Applicators	Puritan Medical Products	25-806 1WC
Steromaster Illuminator	Fisher Scientific	12-562-21	No longer available from the company
Surgical Dumont #7 Forceps	Fine Science Tools	11271-30
Thiocarbohydrazide (TCH)	SIGMA-ALDRICH	88535
Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL)	VWR	76323-394
Uranyl Acetate	Electron microscopy Services	22400
Veet Gel Cream Hair Remover	Reckitt Benckiser	3116875
White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm	Fisher Scientific	S38975
WinDAQ/100 Software for Windows	DATAQ Instruments, Inc.	Version 3.38	Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/
ZEISS AxioCam Icc 1	ZEISS	57615