Ferrik Klorür Kaynaklı Arteriyel Tromboz ve 3D Elektron Mikroskobu Analizi için Numune Toplama

Özet

Bu protokol, arteriyel trombozu indüklemek için FeCl₃ aracılı bir yaralanmanın nasıl kullanılacağını ve elektron mikroskobu analizi için trombozun çeşitli aşamalarında arteriyel yaralanma örneklerinin nasıl toplanacağını ve hazırlanacağını açıklamaktadır.

Özet

Kardiyovasküler hastalıklar tüm dünyada mortalite ve morbiditenin önde gelen nedenlerinden biridir. Anormal tromboz, diyabet ve obezite gibi sistemik durumların ve ateroskleroz, kanser ve otoimmün hastalıklar gibi kronik inflamatuar hastalıkların ortak bir özelliğidir. Vasküler yaralanma üzerine, genellikle pıhtılaşma sistemi, trombositler ve endotel, yaralanma bölgesinde bir pıhtı oluşturarak kanamayı önlemek için düzenlenmiş bir şekilde hareket eder. Bu süreçteki anormallikler ya aşırı kanamaya ya da kontrolsüz tromboza / yetersiz antitrombotik aktiviteye yol açar, bu da damar tıkanıklığına ve sekellerine dönüşür. FeCl₃ ile indüklenen karotis hasar modeli, trombozun in vivo olarak nasıl başladığını ve ilerlediğini araştırmak için değerli bir araçtır. Bu model endotel hasarı/denudasyonu ve ardından yaralanan bölgede pıhtı oluşumunu içerir. Farklı derecelerde vasküler hasara yanıt olarak vasküler hasarı ve pıhtı oluşumunu izlemek için oldukça hassas, kantitatif bir tahlil sağlar. Optimize edildikten sonra, bu standart teknik, trombozun altında yatan moleküler mekanizmaları ve ayrıca büyüyen bir trombüsteki trombositlerdeki ultrayapısal değişiklikleri incelemek için kullanılabilir. Bu tahlil aynı zamanda antitrombotik ve antiplatelet ajanların etkinliğini incelemek için de yararlıdır. Bu makalede, FeCl₃ ile indüklenen arteriyel trombozun nasıl başlatılacağı ve izleneceği ve elektron mikroskobu ile analiz için örneklerin nasıl toplanacağı açıklanmaktadır.

Giriş

Tromboz, bir kan damarını kısmen veya tamamen bloke eden ve kanın doğal akışını engelleyen bir kan pıhtısı oluşumudur. Bu, iskemik kalp hastalığı ve felç gibi ciddi ve ölümcül kardiyovasküler olaylara yol açar. Kardiyovasküler hastalıklar morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenidir ve dünya çapında her dört ölümden birine neden olmaktadır ^1,2,3. Tromboz, vasküler sistemin bir arızası olarak ortaya çıkmasına rağmen, altta yatan bir mikrobiyal veya viral enfeksiyon, bağışıklık bozukluğu, malignite veya metabolik durumun bir sonucu olabilir. Kan akışı, endotel hücreleri, kırmızı / beyaz kan hücreleri, trombositler ve pıhtılaşma faktörleri⁴ dahil olmak üzere vasküler sistemin çeşitli bileşenleri arasındaki karmaşık etkileşim ile korunur. Vasküler yaralanma üzerine, trombositler subendotelyal matriks üzerindeki yapışkan proteinlerle etkileşime girer ve granüler içeriklerini serbest bırakır, bu da daha fazla trombosit alır⁵. Aynı zamanda, pıhtılaşma kaskadı aktive edilir ve fibrin oluşumuna ve birikmesine yol açar. Sonuçta, bir fibrin ağı⁶ içinde sıkışmış trombositler ve kırmızı kan hücreleri içeren bir pıhtı oluşur. Trombozu modüle etmek için antiplatelet ve antikoagülan ilaçlar mevcut olmasına rağmen, sahte kanama bu tedavilerde önemli bir endişe kaynağı olmaya devam etmekte ve bu ilaçların dozajlarının ve kombinasyonlarının ince ayarlanmasını gerektirmektedir. Bu nedenle, yeni anti-trombotik ilaçların keşfedilmesi için hala acil bir ihtiyaç vardır⁷.

Tromboz, vasküler yaralanmaya neden olmak için birden fazla yöntem kullanılarak incelenir: mekanik (damar ligasyonu), termal (lazer yaralanması) ve kimyasal yaralanma (FeCl₃ / Rose Bengal uygulaması). Trombozun doğası, yaralanmanın lokalizasyonuna (arteriyel ve venöz), yönteme veya derecesine bağlı olarak değişir. Tüm bu tipler arasında FeCl_3'e bağlı vasküler yaralanma en yaygın kullanılan yöntemdir. Farelerde, sıçanlarda, tavşanlarda, kobaylarda ve köpeklerde kullanılmıştır 8,9,10,11,12. Yöntem nispeten basittir, kullanımı kolaydır ve ana parametreler standartlaştırılırsa, çeşitli vasküler sistemlerde (örneğin, arterler [karotis ve femoral], damarlar [juguler] ve arterioller [cremaster ve mezenterik]) duyarlı ve tekrarlanabilirdir (Ek Tablo 1).

Bu model, pıhtı oluşumunun mekaniği ve morfolojisi hakkındaki anlayışımızı ilerletmek için de kullanılabilir. Bu teknik, trombozu çeşitli akış hızı noktalarında durdurma avantajını, işlemin tıkanmadan önce ara aşamalarını incelemek için benzersiz bir şekilde sunar. Tromboz araştırmalarındaki son gelişmeler, bu modeli tromboliz^13'ün farmakolojik olmayan yöntemlerine veya anti-trombotik ve / veya fibrinolitik ajanların non-invaziv olarak verilmesine odaklanmak için kullanmıştır^14,15. Birkaç grup, trombosit membranları bu terapötiklerle kaplandığında, ilaçların pıhtıları hedeflemek için termal stimülasyon üzerine aktive edilebileceğini göstermiştir¹⁶. Burada açıklanan teknikler, bulgularının tek trombosit düzeyinde doğrulanması gibi çalışmalar için yararlı olabilir. Bu makalede, Protokol 1 temel FeCl₃ aracılı vasküler yaralanma prosedürünü tanımlarken, Protokol 2 elektron mikroskobu ile daha fazla analiz için vasküler yaralanma örneğini toplama ve düzeltme yöntemini açıklamaktadır.

Protokol

Burada tartışılan tüm deneyler, Kentucky Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

NOT: Cerrahi aletler Şekil 1 ve Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir. C57BL/6J fareler, 8-10 haftalık, erkek/dişi veya ilgili genetik olarak manipüle edilmiş (Nakavt veya Knockin) suşlar kullanıldı.

1. FeCl_3'e bağlı karotis arter yaralanması

1. Fare anestezi indüksiyonu
   1. Fareyi tartın.
   2. İntraperitoneal olarak 0,2 g/kg tribromoetanol çözeltisi enjekte ederek fareyi uyuşturun (yani ). Enjekte etmeden önce anestezik çözeltinin oda sıcaklığında (RT) olduğundan emin olun. Bu doz, fareyi yaklaşık 1 saat sakinleştirmek için yeterlidir.
   3. Farenin yatıştırıldığından emin olmak için enjeksiyondan 5 dakika sonra ayak parmağını sıkıştırarak ayak parmağı refleksini kontrol edin. Fare sakinleştirilmezse, ayak parmağını çekecektir. Bu durumda, 5 dakika bekleyin ve tekrar kontrol edin.
   4. Fare hala tamamen yatıştırılmamışsa, ilk dozun 1 / 4'ünü uygulayın ve 5 dakika bekleyin.
   5. İşlem boyunca, farenin anestezik düzlemini bir ayak parmağı tutamağı ile periyodik olarak izleyin. Ek olarak, optimum anesteziyi korumak için solunum hızı ve vücut ısısı da izlenebilir.
2. Fareyi hareketsiz hale getirin
   1. Fareyi sırtüstü pozisyonda ısıtma yastığına (37 ° C) yerleştirin ve ekstremiteleri hareketsiz hale getirmek için yapışkan bant kullanın.
   2. Servikal/boyun bölgesini uzatmak üzere farenin üst ön dişlerini nazikçe çekmek için bir cerrahi iplik (0,1 mm) kullanın. Bu, cerrahi alanın daha iyi görüntülenmesi ve Doppler probunun stabilitesi için önemlidir. İplik boyutu önemli değildir, çünkü boynu uzatmak için sadece hayvanın ön dişlerini çekmek için kullanılır.
3. Kesi
   1. Ameliyat bölgesine %70 etanol püskürtün veya alkollü mendille silin.
   2. Bir pamuklu çubuk kullanarak, cerrahi bölgeye az miktarda epilasyon kremi sürün. 1-2 dakika bekleyin ve ardından kremayı çıkarmak için ıslak bir kağıt havlu veya mendil kullanın.
      NOT: Bu adım temiz bir cerrahi bölge için önemlidir.
   3. Makas ve forseps kullanarak (Şekil 1B11,1B13), mandibuladan suprasternal çentiğe doğru bir orta hat insizyonu yapın. Bölgenin daha iyi görselleştirilmesini sağlamak için cildi geri çekin (Şekil 2A).
4. Karotis arter maruziyeti
   1. Cerrahi forseps ve mikro diseksiyon forsepsleri kullanarak, üst üste binen yüzeyel fasyayı künt diseke edin ve sol karotis arteri açığa çıkarmak için çıkarın (Şekil 1B12,1B13). Bu bölgedeki diğer vaskülatürlere zarar vermemek için bu aşamada makas kullanmadığınızdan emin olun.
   2. Karotis arteri çevreleyen ekstra dokuyu çıkarın. Çevreleyen dokunun aşırı diseksiyonundan kaçının, çünkü bu alan vagus sinirini ve vertebral arteri barındırır.
   3. Karotis arteri cerrahi ve dikiş bağlayıcı forseps ile diseke ederek çevre dokudan ayırın (Şekil 1B12,1B15,2C). Arterde veya çevresindeki vaskülatürde herhangi bir mekanik yaralanmayı önlemek için arteri uzatmadığınızdan veya çekmediğinizden emin olun.
   4. Yaralanmanın yerini işaretlemek için arterin altına bir parça plastik yerleştirin (Şekil 2D). Cerrahi alanda görmeyi kolaylaştırmak için renkli bir saydamlık tabakası kullanın.
5. Akış probunun yerleştirilmesi
   1. Doppler transonik akım probunu ameliyattan yaklaşık 10 dakika önce tuzlu su çözeltisine (dH₂O'da %0.9 NaCl) yerleştirin. Akışın okunmasını kolaylaştırmak için probun diğer ucunu debimetredeki bir ataşmana yerleştirin. Debimetreyi bir bilgisayara takın.
      NOT: Ameliyatlar arasında Doppler transonik akım probu tuzlu su içinde olmalıdır. İşlem boyunca probu nemli ve temiz tuttuğunuzdan emin olun.
   2. Ultrason Doppler transonik akım probunu plastiğin yukarı akımındaki arterin etrafına yerleştirin (Şekil 2D). Probun kap tutucu bölgesinin çok uzamış olmadığından emin olun (Şekil 1C, kırmızı ok).
      NOT: Gerekirse, probun uygun bir yüksekliğini elde etmek için probu gazlı bezlerle destekleyin (Şekil 1B1) ve optimum okuma pozisyonunu kolaylaştırın.
   3. Cerrahi alan bu noktada kuruysa, bölgeyi nemli tutmak için birkaç damla RT salin ekleyin. Akış probu okumasını izleyin. En uygun okuma her hayvan için değişir ve 0.6-1.2 mL / dak arasında herhangi bir yerde olabilir. Daha az veya kararlı değilse, optimum bir okuma elde etmek için akış probu konumunu değiştirin.
      NOT: Farenin boynunun çok uzamış olmadığından ve ameliyat alanının temiz olduğundan emin olun.
6. Akış taban çizgisini kaydetme
   1. Probu yerleştirdikten sonra, akışın sabit olduğundan emin olmak için kan akışını 2 dakika boyunca izleyin. Ardından, akışı 2 dakika boyunca kaydedin (Şekil 3B) temel olarak. Debimetrenin ayrıntılı bir açıklaması için, Subramaniam ve ^ark.17'ye bakınız.
   2. Kan akışını kaydetmek için WinDAQ yazılımını başlatın. Dosya seçeneğine tıklayın ve ardından Kaydet'e tıklayın. Yeni bir klasör ve dosya oluşturun ve kayda başlayın. Kaydı durdurmak için, dosya bölümünde Durdur'a tıklayın.
      NOT: WinDAQ yazılımı yayımcıdan ücretsiz olarak edinilebilir: https://www.dataq.com/products/windaq/.
7. Yaralanma
   1. Akışın kaydını durdurun. Prob pozisyonunu değiştirmediğinizden emin olun, böylece okumalar yaralanmadan sonra tutarlı kalır.
   2. Bölgeyi bir mendil/kağıt havlu ile iyice kurulayın.
      NOT: Küçük bir kalıntı sıvı hacmi bile vasküler yaralanmaya neden olmak için kullanılan FeCl₃ çözeltisinin konsantrasyonunu değiştirebilir. Bu, değişken sonuçlara yol açar ve tekrarlanabilirliği etkiler. Alan tamamen kuruduğunda, prob akışı ölçemez.
   3. Plastik bir tartım teknesine dairesel bir filtre kağıdı koyun (1 mm çapında, 1 mm çapında kulak delme ile kesilmiş). Filtre kağıdına 1 μL% 6 FeCl₃ çözeltisi (dH₂O cinsinden yapılmış) ekleyin.
      NOT: Filtre kağıdını kullanmadan hemen önce FeCl₃ çözeltisi eklediğinizden emin olun. Kağıdın çok erken ıslatılması FeCl₃ çözeltisinin buharlaşmasına neden olabilir ve yaralanmanın ciddiyetini değiştirebilir.
   4. İnce forseps kullanarak, filtre kağıdını alın ve probun yukarı akışındaki artere, arterin plastik ile işaretlenmiş kısmına koyun (Şekil 2D, E). Bu plastik bir işaretleyici ve bir ara parça görevi görür. Yaralı bölgeyi işaretler ve çevredeki nemli alanla temastan kaçınarak FeCl_3'ün yanlışlıkla seyreltilmesini önler.
      NOT: Filtre kağıdının düz olduğundan, sıkışmadığından veya herhangi bir şekilde katlanmadığından emin olun. Artere yerleştirildikten sonra, filtre kağıdının konumunu değiştirmeyin; bunu yapmak yaralanmanın boyutunu değiştirir.
   5. Filtre kağıdını yerleştirdikten sonra, zamanlayıcıyı başlatın ve kan akışını kaydedin. 3 dakika sonra, kağıdı çıkarın ve FeCl_3'ü çıkarmak ve yaralanma sürecini durdurmak için yaralanma bölgesine salin ekleyin. Ayrıca bölgeyi nemli hale getirir. Bu aşamada, kan akışı, yaralanma öncesi kaydedildiği gibi başlangıç seviyesine geri dönmelidir.
   6. Orijinal kaydın %10'una düşene veya sıfıra ulaşana kadar akışı izleyin ve kaydedin. Trombüs yaralanma bölgesinde oluşmaya başladığında sürekli bir azalma olur (Şekil 3C). Bu süre zarfında akıştaki önemli dalgalanmalara dikkat edin.
   7. Trombüsün stabilitesini incelemek için, her önemli ve tutarlı azalmadan sonra kan akışındaki hızlı artışı kaydedin. Bu olaylar kararsız tromboza bağlı embolizasyon olarak sınıflandırılır (Şekil 4D). Akıştaki tutarlı azalmadan sonra, operatör deneyin sonunda arterdeki yaralanmayı görebilir (Şekil 2F, mavi ok / noktalı oval).
   8. Damar tıkanma süresi, kan akışının en az 1 dakika süreyle tamamen durması olarak tanımlanır. Sıfır okuma veya akıştaki önemli azalma ile gösterildiği gibi, tıkayıcı bir trombüsün oluştuğu zamanı kaydedin.
   9. Denemeyi 30 dakikada sonlandırın. Trombüs izlemeden sonraki 30 dakika içinde oluşmazsa, akışı kaydedin, kaydı durdurun ve probu çıkarın.
   10. Probu %70 etanol ve bir fırça ile temizleyerek artık doku/saç veya kalıntıları temizleyin. Probu saklama kutusuna yerleştirmeden önce tamamen kurutun. Probu uzun süreli depolama için saklama kutusuna yerleştirmeden önce tamamen kurutun.
   11. Servikal çıkık ile fareyi ötenazi yapın. Karkası, laboratuvarın adı ve tarihi ile etiketlenmiş karkas imha torbasına yerleştirin.

2. FeCl₃ kaynaklı Yaralanma sonrası seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu (SBF-SEM) çalışmaları için numunelerin toplanması ve hazırlanması

NOT: Sunulan EM protokolü SBF-SEM için numune hazırlama için uygundur. Bu görüntüleme tekniği, bir pıhtıdaki trombositlerin üç boyutlu yapısını incelemek için benzeri görülmemiş bir yetenek sunar. Bu teknikle, numune, numune boyunca ilerledikçe oluşturulan bir dizi sıralı blok SEM görüntüsü olarak görselleştirilir. Bu preparat için kilit noktalar şunlardır: 1) numune önceden gömülmüş ağır metallerle boyanmalıdır; ve 2) plastik gömülü numune, SEM içinde montaj için uygun şekilde kesilmelidir (kesilmiş numunelerin görseli için Şekil 6'ya bakınız). Gömme sonrası boyama SEM içinde mümkün değildir. EM analizi için FeCl₃ kaynaklı damar yaralanmasından bir örnek toplarken, ameliyat yapılırken aşağıdaki değişikliklerin yapılması gerekir. Sunulan FeCl₃ cerrahi protokolündeki modifikasyonlar, herhangi bir elektron mikroskobu formuna da uygulanabilir. Anestezi koşulları ve kesi yapma ve karotis arteri açığa çıkarma adımları Protokol 1'deki ile aynıdır.

1. Karotis arteri açığa çıkardıktan sonra, iki cerrahi iplik arasındaki bölgeyi gevşek bir şekilde çevreleyerek yaralanma bölgesini işaretleyin (boyut: 0.1 mm) (Şekil 5A, B).
2. Probu arterin altına, alt iplikten distal olarak yerleştirin (Şekil 5C).
3. FeCl₃ yaralanması bölgesini işaretlemek için plastik parçayı iki iplik arasındaki arterin altına yerleştirin (Şekil 5C).
4. Bazal akışı not etmek için yaralanma yapmadan önce akış ölçümleri yapın. Bu ölçümler, numunenin hangi aşamada toplanacağına karar vermek için kullanılır.
   NOT: Fiksatif (her ikisi de 1x PBS'de yapılmış% 3 paraformaldehit / PFA +% 0.1 glutaraldehit) hazır olduğundan ve RT'de olduğundan emin olun. alternatif olarak, tuzlu bir arka planda% 2.5 glutaraldehit ile fiksasyon da kullanılabilir.
   DİKKAT: Hem paraformaldehit hem de glutaraldehit oldukça toksik ve tahriş edicidir. Onları tutarken, maruz kalmaktan korunmak için eldivenler, göz kalkanı ve maskeler kullanılmalıdır. Tüm fiksatif çözeltiler zehirlidir ve sabitleme adımları bir duman davlumbazında gerçekleştirilmelidir.
5. FeCl₃ ıslatılmış filtre kağıdını artere 3 dakika boyunca (% 8 FeCl₃ kullanılır) yerleştirerek yaralanmayı gerçekleştirin (bu süre de değişebilir). 3 dakika sonra, filtre kağıdını çıkarın ve fazla kalan FeCl_3'ü çıkarmak için yaralanma bölgesine salin ekleyin. Bu adım, yaralanmanın değişken derecesini önlemek ve prob tarafından akış sayımını kolaylaştırmak için gereklidir (Şekil 5D).
6. Akış okumasını izleyin. Akış başlangıç değerinin% 50'sinin altına düştüğünde, probu çıkarın. Alanı hızla kurutun ve yaralanma bölgesini harici olarak düzeltmek için bölgeye fiksatif ekleyin.
7. Arteri forseps ile yaralanma bölgesinin yakınında derhal tutun ve alt ipliğin aşağı akışını ve üst ipliğin yukarı akışını kesin. Gerekirse, başka bir kişiden bir ucu kesmeye yardım etmesini isteyin. Dokuyu plastik doku kültürü kabına toplandığı gibi aynı yönde koyun ve birkaç damla fiksatif ekleyin.
   NOT: Arterin kesilmesi anında geniş kanamaya neden olur, bu nedenle ilk kez kesmeden önce arteri tuttuğunuzdan emin olun. Bu senaryoda, fare exsanguinated edilir. Fare, ekssanguinasyon ve servikal çıkık ile ötenazi yapılır.
8. Bir neşter kullanarak, arterin etrafındaki ekstra dokuyu temizleyin. Kan akışının yönünü kaydetmeye dikkat edin. Bunu işaretlemek için, bir ucunu yatay olarak ve diğer ucunu sivrilmiş/eğik olarak kesin (Şekil 5E).
9. Numuneyi RT'de 1 saat boyunca fiksatif (% 3 PFA ve% 0.1 glutaraldehit) içinde tutun. Daha sonra, numuneyi EM analizi için numune işleme laboratuvarına ıslak buz üzerinde gönderene kadar 4 °C'de %1 PFA'da saklayın.
   NOT: Numuneler dondurulmamalıdır. Bu numune toplama yönteminin zorlukları şunlardır:
   1. İlk okuma optimal olmayabilir veya yaralanmadan sonra dalgalanabilir. Bu, EM analizi için tutuklamak üzere seçilen yaralanmanın derecesini etkileyebilir. Bu sorunu çözmek için, hangi konumun en uygun olduğuna karar vermek için probu yerleştirmenin çeşitli konumlarını denedikten sonra, taban çizgisi okumasını birkaç dakika boyunca kaydettiğinizden emin olun.
   2. Analiz için arteriyel bölümün harici fiksatif ve gerçek kesimini ekleyerek yaralanmayı durdurma zamanı, tromboz derecesine değişkenlik katabilir. Harici olarak sabitledikten sonra numune toplama sırasında hızlı olun.
10. Islak buz üzerinde %1 PFA'da EM analizi için işlenmek üzere numuneleri alın. Daha fazla işleme başlamak için numuneleri buz üzerinde, 0,1 M kakodilat tamponu ile 3 dakika durulayın.
11. Numuneleri buz üzerinde 1 saat boyunca 0,1 M kakodilat tamponu +% 2,5 glutaraldehit + 2 mM CaCl_2'de sabitleyin.
12. Fiksatifi atın ve numuneleri 2 mM CaCl₂ (5 x 3 dakika) içeren soğuk 0,1 M sodyum kakodilat tamponu ile yıkayın (Şekil 6A).
13. Numuneleri ozmiyum çözeltisi (% 3 potasyum ferrosiyanür [K 4 C 6 N₆Fe] +0.3 M kakodilat tamponu + 4 mM CaCl 2 ile eşit hacimde% 4 sulu osmiyum tetroksit [OsO₄; ddH₂ O] cinsinden) buz üzerinde 1 saat boyunca sabitleyin.
14. Numuneler sabitlenirken, ddH₂O'da taze% 1 trikloroasetaldehit hidrat (TCH) çözeltisi yapın.
15. Sabitledikten sonra, numuneleri RT'de ddH₂O ile 5 x 3 dakika yıkayın.
16. Numuneleri filtrelenmiş% 1 TCH çözeltisinde (ddH₂O'da yapılmış) RT'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
17. Numuneleri RT'de ddH₂O ile yıkayın (5 x 3 dk).
18. Numuneleri RT'de 30 dakika boyunca ddH 2 O'da%₂ozmiyum tetroksit içinde sabitleyin.
19. Numuneleri RT'de ddH₂O ile her biri 5 x 3 dakika yıkayın.
20. Numuneleri% 1 uranil asetat (sulu) içine yerleştirin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
21. Numuneleri RT'de ddH₂O ile her biri 5 x 3 dakika yıkayın ve en blok Walton'un kurşun aspartat boyaması ile işleyin.
22. En blok Walton'un kurşun aspartat boyama³:
    1. _ddH2O'da 30 mM L-aspartik asit çözeltisi yapın.
       NOT: pH 3.8'e yükseltilirse aspartik asit daha hızlı çözünür. Bu stok çözeltisi soğutulursa 1-2 ay boyunca kararlıdır.
    2. 10 mL aspartik asit stoğunda 20 mM kurşun nitrat çözeltisi yapın ve pH'ı 1 N KOH ile 5,5'e ayarlayın.
    3. Numuneleri 30 dakika boyunca 60 ° C'de kurşun aspartat çözeltisine yerleştirin, ardından RT'de ddH₂O ile her biri 3 dakika boyunca beş yıkama yapın.
23. Numuneleri derecelendirilmiş bir etanol serisi ile dehidrate edin. Valdivia protokolü¹⁸ ile kimyasal dehidrasyon kullanın.
    1. Numuneyi aşamalı olarak kurutmak için numuneleri aşağıdaki çözeltilerin her birinde yıkayın (Şekil 6B):
       3 dakika boyunca %25 etil alkol
       3 dakika boyunca %50 etil alkol
       3 dakika boyunca %75 etil alkol
       3 dakika boyunca %95 etil alkol
       10 dakika boyunca% 100 etil alkol ve adımı iki kez tekrarlayın (toplam üç yıkama).
24. Numuneleri 10 dakika boyunca %100 propilen oksit (PO) içinde yıkayın ve adımı iki kez tekrarlayın (toplam üç yıkama).
25. RT'de bir gecede DMP 30 aktivatörü ile %50/%50 PO/reçine içinde inkübe edin ve 48 saat boyunca DMP30 aktivatörü ile %100 Araldite 502/embed 812/DDSA içine yerleştirin.

Sonuçlar

Veriler genellikle oklüzyona kadar geçen süre veya tamamen tıkayıcı bir trombüs oluşturmak için gereken süre olarak sunulur. Bu veriler bir Kaplan-Meier hayatta kalma eğrisi (Şekil 4A)¹⁹, kan akışının durması veya bir deneyin sona ermesi sırasında terminal kan akışını gösteren çubuklu bir nokta grafiği (Şekil 4B) veya bir çizgi grafik (Şekil 4C) olarak çizilebilir. Trombüs stabi...

Tartışmalar

FeCl_3'ün trombozu indüklemek için vaskülatüre topikal olarak uygulanması yaygın olarak kullanılan bir tekniktir ve çeşitli trombosit reseptörleri, ligand sinyal yolları ve bunların inhibitörleri^20,21,22,23 için roller belirlemede etkili olmuştur. FeCl_3'ün tromboza neden olduğu mekanizma çok yönlüdür; Önceden, endotel denudasyonu trombozun bir nedeni ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline	Fisher Scientific	BP358-212	NaCl used to make a solution of 0.9% saline
1 mL Syringe	Becton, Dickinson and Company	309659
190 Proof Ethanol	KOPTEC	V1101	Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery
2,2,2 Tribromoethanol	Sigma Aldrich	48402
25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0)	DEKNATEL	136082-1204
26G x 3/8 Needle	Becton, Dickinson and Company	305110
2-methyl-2-butanol	Sigma Aldrich	240486
7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL	Globe Scientific Inc.	135010
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)	Medline	MDS090735
Araldite GY 502	Electron microscopy Services	10900
Cell Culture Dish 35mm X 10mm	Corning Incorporated	430165
Compact Scale	Ward's Science	470314-390
Dissecting Scissors, 12.5 cm long	World Precision Instrument	15922-G
DMP-30 activator	Electron microscopy Services	13600
Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA	Electron microscopy Services	13700
Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag	Crown Products	PP-RB-200
Doppler FlowProbe	Transonic Systems Inc.	MA0.5PSB
EMBED 812 resin	Electron microscopy Services	14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof	Electron microscopy Services	15055
Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips	Integra Miltex	18-784
Filter Paper	VWR	28310-106
Fine Scissors - Sharp-Blunt	Fine Science Tools	14028-10
Finger Loop Ear Punches	Fine Science Tools	24212-01
Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply	Dukal Corporation	2128
Glutaraldehyde (10% solution)	Electron microscopy Services	16120
Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10	Integra® Miltex®	4110
Iron (III) Chloride	SIGMA-ALDRICH	157740-100G
Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3	Integra Lifesciences	157510
L-aspartic acid	Sigma Fisher	A93100
L-aspartic acid	Fisher Scientific	BP374-100
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L-62
LEICA S8AP0 Microscope	LEICA	No longer available	No longer available from the company
LEICA S8AP0 Microscope Stand	LEICA	10447255	No longer available from the company
Light-Duty Tissue Wipers	VWR	82003-822
Micro Dissecting Forceps; 1x2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical Instrument Company	RS-5157
Osmium Tetroxide 4% aqueous solution	Electron microscopy Services	19150
Paraformaldehyde (16% solution)	Electron microscopy Services	15710
Potassium ferricyanide	SIGMA-ALDRICH	P-8131
Propylene Oxide, ACS reagent	Electron microscopy Services	20401
Rainin Classic Pipette PR-10	Rainin	17008649
Research Flowmeter	Transonic Systems Inc.	T402B01481	Model: T402
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear	Scotch	305289
Small Animal Heated Pad	K&H Manufacturing Inc.	Model: HM10
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4	Electron microscopy Services	11623
Sterile Cotton Tipped Applicators	Puritan Medical Products	25-806 1WC
Steromaster Illuminator	Fisher Scientific	12-562-21	No longer available from the company
Surgical Dumont #7 Forceps	Fine Science Tools	11271-30
Thiocarbohydrazide (TCH)	SIGMA-ALDRICH	88535
Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL)	VWR	76323-394
Uranyl Acetate	Electron microscopy Services	22400
Veet Gel Cream Hair Remover	Reckitt Benckiser	3116875
White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm	Fisher Scientific	S38975
WinDAQ/100 Software for Windows	DATAQ Instruments, Inc.	Version 3.38	Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/
ZEISS AxioCam Icc 1	ZEISS	57615