Trombosi arteriosa indotta da cloruro ferrico e raccolta di campioni per l'analisi al microscopio elettronico 3D

Riepilogo

Il presente protocollo descrive come utilizzare una lesione mediata da FeCl₃ per indurre trombosi arteriosa e come raccogliere e preparare campioni di lesioni arteriose nelle varie fasi della trombosi per l'analisi al microscopio elettronico.

Abstract

Le malattie cardiovascolari sono una delle principali cause di mortalità e morbilità in tutto il mondo. La trombosi aberrante è una caratteristica comune di condizioni sistemiche come il diabete e l'obesità e malattie infiammatorie croniche come l'aterosclerosi, il cancro e le malattie autoimmuni. In caso di lesione vascolare, di solito il sistema di coagulazione, le piastrine e l'endotelio agiscono in modo orchestrato per prevenire il sanguinamento formando un coagulo nel sito della lesione. Le anomalie in questo processo portano a sanguinamento eccessivo o trombosi incontrollata / insufficiente attività antitrombotica, che si traduce in occlusione dei vasi e sue sequele. Il modello di danno carotidea indotto da FeCl₃ è uno strumento prezioso per sondare come la trombosi inizia e progredisce in vivo. Questo modello comporta danni endoteliali / denudazione e successiva formazione di coaguli nel sito danneggiato. Fornisce un test quantitativo altamente sensibile per monitorare il danno vascolare e la formazione di coaguli in risposta a diversi gradi di danno vascolare. Una volta ottimizzata, questa tecnica standard può essere utilizzata per studiare i meccanismi molecolari alla base della trombosi, nonché i cambiamenti ultrastrutturali nelle piastrine in un trombo in crescita. Questo test è utile anche per studiare l'efficacia degli agenti antitrombotici e antipiastrinici. Questo articolo spiega come avviare e monitorare la trombosi arteriosa indotta da FeCl₃ e come raccogliere campioni per l'analisi mediante microscopia elettronica.

Introduzione

La trombosi è la formazione di un coagulo di sangue che blocca parzialmente o completamente un vaso sanguigno, impedendo il flusso naturale del sangue. Ciò porta a eventi cardiovascolari gravi e fatali, come cardiopatia ischemica e ictus. Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morbilità e mortalità e causano un decesso su quattro in tutto il mondo ^1,2,3. Sebbene la trombosi si manifesti come un malfunzionamento del sistema vascolare, potrebbe essere il risultato di un'infezione microbica o virale sottostante, di un disturbo immunitario, di un tumore maligno o di una condizione metabolica. Il flusso di sangue è mantenuto dalla complessa interazione tra diversi componenti del sistema vascolare, tra cui cellule endoteliali, globuli rossi / bianchi, piastrine e fattori della coagulazione⁴. In caso di danno vascolare, le piastrine interagiscono con le proteine adesive sulla matrice subendoteliale e rilasciano il loro contenuto granulare, che recluta più piastrine⁵. Contemporaneamente, viene attivata la cascata della coagulazione, portando alla formazione e alla deposizione di fibrina. In definitiva, si forma un coagulo, contenente piastrine e globuli rossi intrappolati all'interno di una maglia di fibrina⁶. Sebbene siano disponibili farmaci antiaggreganti piastrinici e anticoagulanti per modulare la trombosi, il sanguinamento spurio rimane una delle principali preoccupazioni con queste terapie, che richiedono la messa a punto dei dosaggi e delle combinazioni di questi farmaci. Pertanto, vi è ancora un urgente bisogno di scoprire nuovi farmaci antitrombotici⁷.

La trombosi viene studiata utilizzando diversi metodi per infliggere lesioni vascolari: lesioni meccaniche (legatura dei vasi), termiche (lesioni laser) e chimiche (applicazione FeCl₃ / Rose Bengal). La natura della trombosi varia a seconda della posizione (arteriosa vs venosa), del metodo o dell'estensione della lesione. Tra tutti questi tipi, il danno vascolare indotto da FeCl₃ è il metodo più utilizzato. È stato impiegato in topi, ratti, conigli, porcellini d'India e cani 8,9,10,11,12. Il metodo è relativamente semplice, facile da usare e, se i parametri principali sono standardizzati, è sensibile e riproducibile in vari sistemi vascolari (ad esempio, arterie [carotide e femorale], vene [giugulare] e arteriole [cremaster e mesenterico]) (Tabella supplementare 1).

Questo modello può anche essere utilizzato per approfondire la nostra comprensione della meccanica e della morfologia della formazione dei coaguli. Questa tecnica offre unicamente il vantaggio di fermare la trombosi in vari punti di portata, per studiare le fasi intermedie del processo prima che diventi occlusivo. I recenti progressi nella ricerca sulla trombosi hanno utilizzato questo modello per focalizzare l'attenzione su metodi non farmacologici di trombolisi¹³ o somministrazione non invasiva di agenti antitrombotici e/o fibrinolitici^14,15. Diversi gruppi hanno dimostrato che, quando le membrane piastriniche sono rivestite con queste terapie, i farmaci possono essere attivati dopo stimolazione termica per colpire i coaguli¹⁶. Le tecniche qui descritte possono essere utili per studi come la convalida dei loro risultati a livello piastrinico singolo. In questo manoscritto, il Protocollo 1 descrive la procedura di base di danno vascolare mediata da FeCl₃, mentre il Protocollo 2 descrive il metodo per raccogliere e fissare il campione di danno vascolare per ulteriori analisi mediante microscopia elettronica.

Protocollo

Tutti gli esperimenti discussi qui sono stati esaminati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso l'Università del Kentucky.

NOTA: Gli strumenti chirurgici sono elencati nella Figura 1 e nella Tabella dei materiali. Sono stati utilizzati topi C57BL/6J, di 8-10 settimane, ceppi maschi/femmine o rilevanti geneticamente manipolati (Knockout o Knockin).

1. Lesione dell'arteria carotide indotta da FeCl₃

1. Induzione dell'anestesia del topo
   1. Pesare il mouse.
   2. Anestetizzare il topo iniettando 0,2 g/kg di soluzione di tribromoetanolo per via intraperitoneale (i.p.). Assicurarsi che la soluzione anestetica sia a temperatura ambiente (RT) prima di iniettarla. Questa dose è sufficiente per sedare il topo per circa 1 ora.
   3. Controllare il riflesso della punta pizzicando la punta 5 minuti dopo l'iniezione per assicurarsi che il mouse sia sedato. Se il topo non è sedato, tirerà via la punta del piede. Se ciò accade, attendere 5 minuti e controllare di nuovo.
   4. Se il topo non è ancora completamente sedato, somministrare 1/4 della dose iniziale e attendere 5 minuti.
   5. Durante la procedura, monitorare periodicamente il piano anestetico del mouse tramite un pizzico di punta. Inoltre, la frequenza respiratoria e la temperatura corporea potrebbero anche essere monitorate per mantenere un'anestesia ottimale.
2. Immobilizzare il mouse
   1. Appoggiare il mouse sul termoforo (37 °C) in posizione supina e utilizzare del nastro adesivo per immobilizzare le estremità.
   2. Utilizzare un filo chirurgico (0,1 mm) per tirare delicatamente i denti anteriori superiori del mouse per estendere la regione cervicale / collo. Questo è importante per una migliore visualizzazione dell'area chirurgica e la stabilità della sonda Doppler. La dimensione del filo non è importante, in quanto viene utilizzata solo per tirare i denti anteriori dell'animale per estendere il collo.
3. Incisione
   1. Spruzzare l'area chirurgica con etanolo al 70% o pulirla con una salvietta imbevuta di alcool.
   2. Utilizzando un batuffolo di cotone, applicare una piccola quantità di crema depilatoria sulla zona chirurgica. Attendere 1-2 minuti e quindi utilizzare un tovagliolo di carta bagnato o un fazzoletto per rimuovere la crema.
      NOTA: questo passaggio è importante per un'area chirurgica pulita.
   3. Usando forbici e pinze (Figura 1B11,1B13), praticare un'incisione mediana dalla mandibola alla tacca soprasternale. Ritrarre la pelle per ottenere una migliore visualizzazione dell'area (Figura 2A).
4. Esposizione all'arteria carotide
   1. Utilizzando una pinza chirurgica e una pinza micro dissecante, sezionare la fascia superficiale sovrapposta e rimuoverla per esporre l'arteria carotide sinistra (Figura 1B12,1B13). Assicurati di non usare le forbici in questa fase per evitare di ferire altre vascolarizzature in quest'area.
   2. Rimuovere il tessuto extra che circonda l'arteria carotide. Evitare un'eccessiva dissezione del tessuto circostante, poiché quest'area ospita il nervo vago e l'arteria vertebrale.
   3. Separare l'arteria carotide dal tessuto circostante sezionandola con pinze chirurgiche e di sutura (Figura 1B12,1B15,2C). Assicurarsi di non estendere o tirare l'arteria per evitare lesioni meccaniche all'arteria o alla vascolarizzazione circostante.
   4. Posizionare un pezzo di plastica sotto l'arteria per contrassegnare la posizione della lesione (Figura 2D). Utilizzare un foglio di trasparenza colorato per rendere più facile la visione in campo chirurgico.
5. Posizionamento della sonda di flusso
   1. Posizionare la sonda a flusso transonico Doppler in soluzione salina (0,9% NaCl in dH₂O) per circa 10 minuti prima dell'intervento. Inserire l'altra estremità della sonda in un attacco nel flussometro per facilitare la lettura del flusso. Collegare il misuratore di portata a un computer.
      NOTA: Tra un intervento chirurgico e l'altro, la sonda a flusso transonico Doppler deve essere in soluzione salina. Assicurarsi di mantenere la sonda umida e pulita durante tutta la procedura.
   2. Posizionare la sonda a flusso transonico Doppler ad ultrasuoni attorno all'arteria a monte della plastica (Figura 2D). Assicurarsi che la regione del portavasi della sonda non sia troppo estesa (Figura 1C, freccia rossa).
      NOTA: Se necessario, sostenere la sonda con garze pad (Figura 1B1) per ottenere un'altezza appropriata della sonda, facilitando la posizione di lettura ottimale.
   3. Se l'area chirurgica è asciutta a questo punto, aggiungere alcune gocce di soluzione salina RT per mantenere l'area umida. Monitorare la lettura della sonda di flusso. La lettura ottimale varia per ogni animale e potrebbe essere compresa tra 0,6-1,2 ml / min. Se è inferiore o non stabile, modificare la posizione della sonda di flusso per ottenere una lettura ottimale.
      NOTA: Assicurarsi che il collo del mouse non sia troppo esteso e che l'area chirurgica sia pulita.
6. Registrare la linea di base del flusso
   1. Dopo aver posizionato la sonda, monitorare il flusso sanguigno per 2 minuti per assicurarsi che il flusso sia costante. Quindi, registrare il flusso per 2 minuti (Figura 3B) come linea di base. Per una descrizione dettagliata del flussometro, fare riferimento a Subramaniam et ^al.17.
   2. Per registrare il flusso sanguigno, avviare il software WinDAQ. Fare clic sull'opzione File e quindi fare clic su Registra. Crea una nuova cartella e un nuovo file e inizia a registrare. Per interrompere la registrazione, fare clic su Stop nella sezione file.
      NOTA: il software WinDAQ è disponibile gratuitamente presso l'editore: https://www.dataq.com/products/windaq/.
7. Ferita
   1. Interrompere la registrazione del flusso. Assicurarsi di non alterare la posizione della sonda in modo che le letture rimangano coerenti dopo l'infortunio.
   2. Asciugare accuratamente l'area con una salvietta/tovagliolo di carta.
      NOTA: Anche un piccolo volume di liquido residuo può alterare la concentrazione della soluzione di FeCl₃ utilizzata per infliggere lesioni vascolari. Ciò porta a risultati variabili e influisce sulla riproducibilità. Quando l'area è completamente asciutta, la sonda non è in grado di misurare il flusso.
   3. In una barca di pesatura di plastica, mettere una carta da filtro circolare (diametro 1 mm, tagliata con un pugno auricolare di 1 mm di diametro). Aggiungere 1 μL di soluzione al 6% di FeCl₃ (prodotta in dH₂O) sulla carta da filtro.
      NOTA: Assicurarsi di aggiungere la soluzione FeCl₃ appena prima di utilizzare la carta da filtro. Immergere la carta troppo presto può portare all'evaporazione della soluzione di FeCl₃ e modificare la gravità della lesione.
   4. Utilizzando una pinza fine, raccogliere la carta da filtro e metterla sull'arteria a monte della sonda, sulla parte dell'arteria segnata dalla plastica (Figura 2D,E). Questa plastica funge da marcatore e distanziatore. Segna l'area lesa e previene la diluizione accidentale del FeCl₃ evitando il contatto con l'area umida circostante.
      NOTA: assicurarsi che la carta da filtro sia dritta, non pizzicata o piegata in altro modo. Una volta posizionato sull'arteria, non modificare la posizione della carta da filtro; Ciò modifica l'entità della lesione.
   5. Dopo aver posizionato la carta da filtro, avviare il timer e registrare il flusso sanguigno. Dopo 3 minuti, rimuovere la carta e aggiungere soluzione salina nel sito della lesione per rimuovere il FeCl₃ e interrompere il processo di lesione. Rende anche l'area umida. In questa fase, il flusso sanguigno dovrebbe tornare al livello basale, come registrato prima dell'infortunio.
   6. Monitora e registra il flusso fino a quando non si riduce al 10% della registrazione originale o raggiunge lo zero. C'è una diminuzione costante una volta che il trombo inizia a formarsi nel sito della lesione (Figura 3C). Notare eventuali fluttuazioni significative nel flusso durante questo periodo.
   7. Per studiare la stabilità del trombo, registrare il rapido aumento del flusso sanguigno dopo ogni diminuzione significativa e coerente. Questi eventi sono classificati come embolizzazione dovuta a trombosi instabile (Figura 4D). Dopo la costante diminuzione del flusso, l'operatore è in grado di vedere la lesione sull'arteria al termine dell'esperimento (Figura 2F, freccia blu / ovale tratteggiato).
   8. Il tempo di occlusione vascolare è definito come la completa cessazione del flusso sanguigno per almeno 1 minuto. Registrare il momento in cui si forma un trombo occlusivo, come mostrato dalla lettura zero o da una significativa diminuzione del flusso.
   9. Terminare l'esperimento a 30 min. Se il trombo non si forma entro 30 minuti dal monitoraggio, registrare il flusso, interrompere la registrazione e rimuovere la sonda.
   10. Pulire la sonda con etanolo al 70% e una spazzola per rimuovere eventuali residui di tessuto / capelli o detriti. Asciugare completamente la sonda prima di riporla nella confezione. Asciugare completamente la sonda prima di riporla nella scatola per la conservazione a lungo termine.
   11. Eutanasia del topo per dislocazione cervicale. Posizionare la carcassa nel sacchetto di smaltimento della carcassa, etichettato con il nome del laboratorio e la data.

2. Raccolta e preparazione di campioni per studi di microscopia elettronica a scansione facciale a blocchi seriali (SBF-SEM) dopo la lesione indotta da FeCl₃

NOTA: Il protocollo EM presentato è appropriato per la preparazione del campione per SBF-SEM. Questa tecnica di imaging offre una capacità senza precedenti di studiare la struttura tridimensionale delle piastrine in un coagulo. Con questa tecnica, il campione viene visualizzato come una serie di immagini SEM a blocchi sequenziali, generate man mano che si procede attraverso il campione. I punti chiave per questa preparazione sono: 1) il campione deve essere colorato con metalli pesanti pre-incorporati; e 2) il campione incorporato in plastica deve essere tagliato in modo appropriato per il montaggio all'interno del SEM (vedere la Figura 6 per una visualizzazione dei campioni rifilati). La colorazione post-incorporamento non è possibile all'interno del SEM. Quando si raccoglie un campione da una lesione vascolare indotta da FeCl₃ per l'analisi EM, è necessario apportare le seguenti modifiche durante l'esecuzione dell'intervento chirurgico. Le modifiche nel protocollo chirurgico FeCl₃ presentato sono applicabili anche a qualsiasi forma di microscopia elettronica. Le condizioni di anestesia e i passaggi per fare un'incisione ed esporre l'arteria carotide sono gli stessi del protocollo 1.

1. Dopo aver esposto l'arteria carotide, contrassegnare il sito della lesione circondando liberamente la regione tra due fili chirurgici (dimensioni: 0,1 mm) (Figura 5A,B).
2. Posizionare la sonda sotto l'arteria, distale dal filo inferiore (Figura 5C).
3. Inserire il pezzo di plastica sotto l'arteria tra i due fili per contrassegnare il sito per la lesione FeCl₃ (Figura 5C).
4. Effettuare misurazioni del flusso prima di eseguire lesioni per annotare il flusso basale. Queste misurazioni vengono utilizzate per decidere in quale fase verrà raccolto il campione.
   NOTA: Assicurarsi che il fissativo (3% paraformaldeide / PFA + 0,1% glutaraldeide, entrambi realizzati in 1x PBS) sia pronto e a RT. In alternativa, potrebbe essere utilizzata anche la fissazione con glutaraldeide al 2,5% in uno sfondo salino.
   ATTENZIONE: Sia la paraformaldeide che la glutaraldeide sono altamente tossiche e irritanti. Durante la manipolazione, guanti, una visiera e maschere devono essere utilizzati per proteggere dall'esposizione. Tutte le soluzioni fissative sono tossiche e le fasi di fissazione devono essere eseguite in una cappa aspirante.
5. Eseguire la lesione posizionando carta da filtro imbevuta di FeCl 3 sull'arteria (viene utilizzato l'8% di FeCl 3) per₃ minuti (anche questa volta potrebbe variare). Dopo 3 minuti, rimuovere la carta da filtro e aggiungere soluzione salina nel sito della lesione per rimuovere eventuali residui di FeCl₃ in eccesso. Questo passaggio è necessario per prevenire l'entità variabile della lesione e per facilitare il conteggio del flusso da parte della sonda (Figura 5D).
6. Monitorare la lettura del flusso. Quando il flusso scende al di sotto del 50% del valore iniziale, rimuovere la sonda. Asciugare rapidamente l'area e aggiungere il fissativo nell'area per fissare esternamente l'area della lesione.
7. Tenere prontamente l'arteria vicino all'area della lesione con una pinza e tagliare a valle del filo inferiore e a monte del filo superiore. Se necessario, chiedi a un'altra persona di aiutarti a tagliare un'estremità. Metti il tessuto sul piatto di coltura di tessuto di plastica nello stesso orientamento in cui è stato raccolto e aggiungi alcune gocce del fissativo.
   NOTA: Il taglio dell'arteria provoca un sanguinamento esteso immediato, quindi assicurati di tenere l'arteria prima di tagliarla la prima volta. In questo scenario, il mouse è dissanguato. Il topo viene eutanasia per dissanguamento e dislocazione cervicale.
8. Usando un bisturi, pulire il tessuto extra intorno all'arteria. Fai attenzione a registrare l'orientamento del flusso sanguigno. Per marcare ciò, tagliare un'estremità orizzontalmente e l'altra affusolata/obliqua (Figura 5E).
9. Conservare il campione in fissativo (3% PFA e 0,1% glutaraldeide) per 1 ora a RT. Quindi, conservare il campione in PFA all'1% a 4 °C fino a inviarlo su ghiaccio umido al laboratorio di lavorazione del campione per l'analisi EM.
   NOTA: i campioni non devono essere congelati. Le sfide per questo metodo di raccolta dei campioni sono:
   1. La lettura iniziale potrebbe non essere ottimale o potrebbe fluttuare dopo l'infortunio. Ciò può influire sull'entità della lesione che viene scelta per l'arresto per l'analisi EM. Per risolvere questo problema, assicurarsi di registrare la lettura della linea di base per alcuni minuti, dopo aver provato varie posizioni di posizionamento della sonda per decidere quale posizione è ottimale.
   2. Il tempo per arrestare la lesione aggiungendo fissativo esterno e taglio effettivo della sezione arteriosa per l'analisi può aggiungere variabilità all'estensione della trombosi. Sii veloce durante la raccolta del campione dopo il fissaggio esterno.
10. Ricevi i campioni per l'elaborazione per l'analisi EM in PFA all'1% su ghiaccio umido. Risciacquare i campioni per 3 minuti, su ghiaccio, con tampone di cacodilato da 0,1 M per avviare ulteriori elaborazioni.
11. Fissare i campioni per 1 h su ghiaccio in tampone cacodilato 0,1 M + 2,5% glutaraldeide + 2 mM CaCl₂.
12. Eliminare il fissativo e lavare i campioni con tampone freddo di cacodilato di sodio 0,1 M contenente 2 mM CaCl₂ (5 x 3 min) (Figura 6A).
13. Fissare i campioni con soluzione di osmio (ferrocianuro di potassio al 3% [K 4 C 6 N₆Fe] +tampone cacodilato 0,3 M + 4 mM CaCl 2 miscelato con un volume uguale di tetrossido acquoso di osmio al 4% [OsO₄; in ddH₂ O]) per 1 ora su ghiaccio.
14. Mentre i campioni si fissano, preparare una soluzione fresca di tricloroacetaldeide idrato (TCH) all'1% in ddH₂O. Incubare la soluzione a 60 °C per 1 ora mescolando delicatamente.
15. Dopo il fissaggio, lavare i campioni con ddH₂O a RT per 5 x 3 minuti.
16. Incubare i campioni in soluzione filtrata all'1% di TCH (prodotta in ddH₂O) per 20 minuti a RT.
17. Lavare i campioni con ddH₂O a RT (5 x 3 min).
18. Fissare i campioni in tetrossido di osmio al 2% in ddH₂O per 30 minuti a RT.
19. Lavare i campioni con ddH₂O a RT per 5 x 3 minuti ciascuno.
20. Porre i campioni in acetato di uranile all'1% (acquoso) e incubare per una notte a 4 °C.
21. Lavare i campioni con ddH₂O a RT per 5 x 3 minuti ciascuno e lavorarli con la colorazione in blocco dell'aspartato di piombo di Walton.
22. In blocco Colorazione dell'aspartato di piombo di Walton³:
    1. Produrre 30 mM di soluzione di acido L-aspartico in ddH₂O.
       NOTA: L'acido aspartico si dissolve più rapidamente se il pH viene aumentato a 3,8. Questa soluzione madre è stabile per 1-2 mesi se refrigerata.
    2. Produrre 20 mM di soluzione di nitrato di piombo in 10 mL di acido aspartico e regolare il pH a 5,5 con 1 N KOH.
    3. Porre i campioni in una soluzione di aspartato di piombo a 60 °C per 30 minuti, dopo cinque lavaggi con ddH₂O a RT, ciascuno per 3 minuti.
23. Disidratare i campioni con una serie di etanolo graduato. Utilizzare la disidratazione chimica secondo il protocollo Valdivia¹⁸.
    1. Lavare i campioni in ciascuna delle seguenti soluzioni per disidratare progressivamente il campione (Figura 6B):
       Alcool etilico al 25% per 3 min
       50% di alcol etilico per 3 min
       Alcool etilico al 75% per 3 min
       Alcool etilico al 95% per 3 min
       Alcool etilico al 100% per 10 minuti e ripetere il passaggio due volte (totale di tre lavaggi).
24. Lavare i campioni in ossido di propilene (PO) al 100% per 10 minuti e ripetere il passaggio due volte (totale di tre lavaggi).
25. Incubare in 50%/50% PO/resina con attivatore DMP 30 durante la notte a RT e incorporare in Araldite 502/incorporare 100% Araldite 502/embed 812/DDSA con attivatore DMP30 per 48 ore.

Risultati

I dati sono generalmente presentati come tempo di occlusione, o tempo necessario per formare un trombo completamente occlusivo. Questi dati possono essere tracciati come una curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier (Figura 4A)¹⁹, un dot plot con barre che mostrano il flusso sanguigno terminale al momento della cessazione del flusso sanguigno o della fine di un esperimento (Figura 4B), o come un grafico a linee (Figura 4C).

Discussione

L'applicazione topica di FeCl₃ al sistema vascolare per indurre trombosi è una tecnica ampiamente utilizzata ed è stata determinante nello stabilire ruoli per vari recettori piastrinici, vie di segnalazione del ligando e loro inibitori^20,21,22,23. Il meccanismo attraverso il quale FeCl₃ provoca trombosi è sfaccettato; In precedenza, la denudazione endoteliale era consid...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline	Fisher Scientific	BP358-212	NaCl used to make a solution of 0.9% saline
1 mL Syringe	Becton, Dickinson and Company	309659
190 Proof Ethanol	KOPTEC	V1101	Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery
2,2,2 Tribromoethanol	Sigma Aldrich	48402
25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0)	DEKNATEL	136082-1204
26G x 3/8 Needle	Becton, Dickinson and Company	305110
2-methyl-2-butanol	Sigma Aldrich	240486
7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL	Globe Scientific Inc.	135010
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)	Medline	MDS090735
Araldite GY 502	Electron microscopy Services	10900
Cell Culture Dish 35mm X 10mm	Corning Incorporated	430165
Compact Scale	Ward's Science	470314-390
Dissecting Scissors, 12.5 cm long	World Precision Instrument	15922-G
DMP-30 activator	Electron microscopy Services	13600
Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA	Electron microscopy Services	13700
Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag	Crown Products	PP-RB-200
Doppler FlowProbe	Transonic Systems Inc.	MA0.5PSB
EMBED 812 resin	Electron microscopy Services	14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof	Electron microscopy Services	15055
Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips	Integra Miltex	18-784
Filter Paper	VWR	28310-106
Fine Scissors - Sharp-Blunt	Fine Science Tools	14028-10
Finger Loop Ear Punches	Fine Science Tools	24212-01
Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply	Dukal Corporation	2128
Glutaraldehyde (10% solution)	Electron microscopy Services	16120
Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10	Integra® Miltex®	4110
Iron (III) Chloride	SIGMA-ALDRICH	157740-100G
Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3	Integra Lifesciences	157510
L-aspartic acid	Sigma Fisher	A93100
L-aspartic acid	Fisher Scientific	BP374-100
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L-62
LEICA S8AP0 Microscope	LEICA	No longer available	No longer available from the company
LEICA S8AP0 Microscope Stand	LEICA	10447255	No longer available from the company
Light-Duty Tissue Wipers	VWR	82003-822
Micro Dissecting Forceps; 1x2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical Instrument Company	RS-5157
Osmium Tetroxide 4% aqueous solution	Electron microscopy Services	19150
Paraformaldehyde (16% solution)	Electron microscopy Services	15710
Potassium ferricyanide	SIGMA-ALDRICH	P-8131
Propylene Oxide, ACS reagent	Electron microscopy Services	20401
Rainin Classic Pipette PR-10	Rainin	17008649
Research Flowmeter	Transonic Systems Inc.	T402B01481	Model: T402
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear	Scotch	305289
Small Animal Heated Pad	K&H Manufacturing Inc.	Model: HM10
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4	Electron microscopy Services	11623
Sterile Cotton Tipped Applicators	Puritan Medical Products	25-806 1WC
Steromaster Illuminator	Fisher Scientific	12-562-21	No longer available from the company
Surgical Dumont #7 Forceps	Fine Science Tools	11271-30
Thiocarbohydrazide (TCH)	SIGMA-ALDRICH	88535
Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL)	VWR	76323-394
Uranyl Acetate	Electron microscopy Services	22400
Veet Gel Cream Hair Remover	Reckitt Benckiser	3116875
White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm	Fisher Scientific	S38975
WinDAQ/100 Software for Windows	DATAQ Instruments, Inc.	Version 3.38	Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/
ZEISS AxioCam Icc 1	ZEISS	57615