Trombose Arterial Induzida por Cloreto Férrico e Coleta de Amostras para Análise de Microscopia Eletrônica 3D

Resumo

O presente protocolo descreve como usar uma lesão mediada por FeCl₃ para induzir trombose arterial e como coletar e preparar amostras de lesão arterial em vários estágios da trombose para análise por microscopia eletrônica.

Resumo

As doenças cardiovasculares são uma das principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo. A trombose aberrante é uma característica comum de condições sistêmicas, como diabetes e obesidade, e de doenças inflamatórias crônicas, como aterosclerose, câncer e doenças autoimunes. Na lesão vascular, geralmente o sistema de coagulação, as plaquetas e o endotélio atuam de forma orquestrada para evitar o sangramento, formando um coágulo no local da lesão. Anormalidades nesse processo levam a sangramento excessivo ou trombose descontrolada/atividade antitrombótica insuficiente, o que se traduz em oclusão do vaso e suas sequelas. O modelo de lesão carotídea induzida por FeCl₃ é uma ferramenta valiosa para investigar como a trombose se inicia e progride in vivo. Esse modelo envolve dano endotelial/desnudamento e subsequente formação de coágulos no local lesado. Ele fornece um ensaio quantitativo altamente sensível para monitorar o dano vascular e a formação de coágulos em resposta a diferentes graus de dano vascular. Uma vez otimizada, esta técnica padrão pode ser usada para estudar os mecanismos moleculares subjacentes à trombose, bem como as alterações ultraestruturais nas plaquetas em um trombo crescente. Este ensaio também é útil para estudar a eficácia de agentes antitrombóticos e antiplaquetários. Este artigo explica como iniciar e monitorar a trombose arterial induzida por FeCl₃ e como coletar amostras para análise por microscopia eletrônica.

Introdução

A trombose é a formação de um coágulo sanguíneo que bloqueia parcial ou completamente um vaso sanguíneo, impedindo o fluxo natural do sangue. Isso leva a eventos cardiovasculares graves e fatais, como doença cardíaca isquêmica e acidentes vasculares cerebrais. As doenças cardiovasculares são a principal causa de morbidade e mortalidade, sendo responsáveis por uma em cada quatro mortes no^mundo1,2,3. Embora a trombose se manifeste como um mau funcionamento do sistema vascular, pode ser resultado de uma infecção microbiana ou viral subjacente, distúrbio imunológico, malignidade ou condição metabólica. O fluxo sanguíneo é mantido pela complexa interação entre diversos componentes do sistema vascular, incluindo células endoteliais, hemácias/leucócitos, plaquetas e fatores de coagulação⁴. Na lesão vascular, as plaquetas interagem com proteínas adesivas na matriz subendotelial e liberam seu conteúdo granular, que recruta mais plaquetas⁵. Concomitantemente, a cascata de coagulação é ativada, levando à formação e deposição de fibrina. Em última análise, forma-se um coágulo contendo plaquetas e hemácias aprisionadas dentro de uma tela de fibrina⁶. Embora drogas antiplaquetárias e anticoagulantes estejam disponíveis para modular a trombose, o sangramento espúrio continua sendo uma grande preocupação com essas terapias, exigindo ajuste fino das dosagens e combinações dessas drogas. Assim, ainda é urgente a descoberta de novas drogas antitrombóticas⁷.

A trombose é estudada usando vários métodos para infligir lesão vascular: mecânica (ligadura do vaso), térmica (lesão a laser) e lesão química (aplicação de FeCl₃/Rosa Bengala). A natureza da trombose varia dependendo da localização (arterial vs. venosa), método ou extensão da lesão. Dentre todos esses tipos, a lesão vascular induzida por FeCl₃ é o método mais utilizado. Tem sido empregada em camundongos, ratos, coelhos, cobaias e cães 8,9,10,11,12. O método é relativamente simples, fácil de usar e, se os principais parâmetros forem padronizados, é sensível e reprodutível em vários sistemas vasculares (por exemplo, artérias [carótida e femoral], veias [jugular] e arteríolas [cremaster e mesentérica]) (Tabela Suplementar 1).

Este modelo também pode ser usado para aprofundar nossa compreensão da mecânica e morfologia da formação de coágulos. Esta técnica oferece exclusivamente a vantagem de parar a trombose em vários pontos de fluxo, para estudar os estágios intermediários do processo antes que ele se torne oclusivo. Avanços recentes na pesquisa da trombose têm utilizado esse modelo para focar a atenção em métodos não farmacológicos de^{trombólise13} ou na liberação não invasiva de agentes antitrombóticos e/ou fibrinolíticos^14,15. Vários grupos têm demonstrado que, quando as membranas plaquetárias são revestidas com essas terapêuticas, os fármacos podem ser ativados por estimulação térmica para atingir coágulos¹⁶. As técnicas aqui descritas podem ser úteis para estudos como a validação de seus achados em nível plaquetário único. Neste manuscrito, o Protocolo 1 descreve o procedimento básico de lesão vascular mediada por FeCl₃, enquanto o Protocolo 2 descreve o método de coleta e correção da amostra de lesão vascular para posterior análise por microscopia eletrônica.

Protocolo

Todos os experimentos aqui discutidos foram revisados e aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade de Kentucky.

NOTA: Os instrumentos cirúrgicos estão listados na Figura 1 e na Tabela de Materiais. Foram utilizados camundongos C57BL/6J, com 8-10 semanas de idade, machos/fêmeas ou cepas geneticamente manipuladas (Knockout ou Knockin).

1. Lesão da artéria carótida induzida por FeCl₃

1. Indução da anestesia em camundongos
   1. Pese o mouse.
   2. Anestesiar o camundongo injetando 0,2 g/kg de solução de tribromoetanol por via intraperitoneal (i.p.). Certifique-se de que a solução anestésica está à temperatura ambiente (RT) antes de injetá-la. Esta dose é suficiente para sedar o rato durante cerca de 1 h.
   3. Verifique o reflexo do dedo do pé apertando o dedo do pé 5 minutos após a injeção para se certificar de que o rato está sedado. Se o mouse não estiver sedado, ele puxará o dedo do pé para longe. Se isso acontecer, aguarde 5 min e verifique novamente.
   4. Se o rato ainda não estiver completamente sediado, administrar 1/4 da dose inicial e aguardar 5 minutos.
   5. Durante todo o procedimento, monitore periodicamente o plano anestésico do mouse através de uma pinça do dedo do pé. Além disso, a frequência respiratória e a temperatura corporal também podem ser monitoradas para manter a anestesia ideal.
2. Imobilizar o mouse
   1. Coloque o mouse sobre a almofada de aquecimento (37 °C) em decúbito dorsal e use fita adesiva para imobilizar as extremidades.
   2. Use um fio cirúrgico (0,1 mm) para puxar suavemente os dentes anteriores superiores do mouse para estender a região cervical/cervical. Isso é importante para melhor visualização da área cirúrgica e estabilidade da sonda Doppler. O tamanho do fio não é importante, pois é usado apenas para puxar os dentes da frente do animal para estender o pescoço.
3. Incisão
   1. Borrife a área cirúrgica com etanol 70% ou limpe-a com um lenço com álcool.
   2. Usando um cotonete, aplique uma pequena quantidade de creme depilatório na área cirúrgica. Aguarde 1-2 min e, em seguida, use uma toalha de papel molhada ou lenço de papel para remover o creme.
      NOTA: Este passo é importante para uma área cirúrgica limpa.
   3. Com tesoura e pinça (Figura 1B11,1B13), realizar uma incisão mediana desde a mandíbula até a fúrcula esternal. Retrair a pele para melhor visualização da área (Figura 2A).
4. Exposição da artéria carótida
   1. Com pinça cirúrgica e micropinça dissecante, disseque a fáscia superficial sobreposta e a remova com foco na exposição da artéria carótida esquerda (Figura 1B12,1B13). Certifique-se de não usar tesoura nesta fase para evitar ferir outras vasculaturas nesta área.
   2. Remova o tecido extra ao redor da artéria carótida. Evitar a dissecção excessiva do tecido circundante, uma vez que esta área abriga o nervo vago e a artéria vertebral.
   3. Separar a artéria carótida do tecido circunjacente, dissecando-a com pinça cirúrgica e de sutura (Figura 1B12,1B15,2C). Certifique-se de não estender ou puxar a artéria para evitar qualquer lesão mecânica na artéria ou na vasculatura circundante.
   4. Colocar um pedaço de plástico sob a artéria para marcar o local da lesão (Figura 2D). Use uma folha de transparência colorida para facilitar a visualização no campo cirúrgico.
5. Colocação da sonda de fluxo
   1. Colocar a sonda de fluxo transônico Doppler em solução salina (NaCl 0,9% em dH₂O) por cerca de 10 min antes da cirurgia. Insira a outra extremidade da sonda em um acessório no medidor de vazão para facilitar a leitura do fluxo. Conecte o medidor de vazão a um computador.
      OBS: Entre as cirurgias, a sonda de fluxo transônico com Doppler deve ser em soro fisiológico. Certifique-se de manter a sonda úmida e limpa durante todo o procedimento.
   2. Colocar a sonda de fluxo transônico com Doppler ultrassom ao redor da artéria a montante do plástico (Figura 2D). Certifique-se de que a região do suporte do vaso da sonda não esteja muito estendida (Figura 1C, seta vermelha).
      OBS: Se necessário, apoiar a sonda com compressas de gaze (Figura 1B1) para atingir uma altura adequada da sonda, facilitando a posição ideal de leitura.
   3. Se a área cirúrgica estiver seca neste ponto, adicione algumas gotas de soro fisiológico RT para manter a área úmida. Monitore a leitura da sonda de fluxo. A leitura ideal varia para cada animal e pode estar entre 0,6-1,2 mL/min. Se for menor ou não estável, altere a posição da sonda de fluxo para obter uma leitura ideal.
      NOTA: Certifique-se de que o pescoço do rato não está muito estendido e que a área cirúrgica está limpa.
6. Registrar a linha de base do fluxo
   1. Depois de colocar a sonda, monitore o fluxo sanguíneo por 2 minutos para garantir que o fluxo seja constante. Em seguida, registre o fluxo por 2 min (Figura 3B) como linha de base. Para uma descrição detalhada do fluxômetro, consulte Subramaniam et ^al.17.
   2. Para registrar o fluxo sanguíneo, inicie o software WinDAQ. Clique na opção Arquivo e, em seguida, clique em Gravar. Crie uma nova pasta e arquivo e comece a gravar. Para interromper a gravação, clique em Parar na seção de arquivos.
      Observação : software WinDAQ está disponível gratuitamente do editor: https://www.dataq.com/products/windaq/.
7. Lesão
   1. Pare a gravação do fluxo. Certifique-se de não alterar a posição da sonda para que as leituras permaneçam consistentes após a lesão.
   2. Seque bem a área com um toalha/toalha de papel.
      NOTA: Mesmo um pequeno volume de líquido residual pode alterar a concentração da solução de FeCl₃ usada para infligir lesão vascular. Isso leva a resultados variáveis e afeta a reprodutibilidade. Quando a área está completamente seca, a sonda não é capaz de medir o fluxo.
   3. Em um barco de pesagem de plástico, coloque um papel de filtro circular (1 mm de diâmetro, cortado com um furo de orelha de 1 mm de diâmetro). Adicionar 1 μL de solução de FeCl₃ a 6% (fabricada em dH₂O) ao papel de filtro.
      NOTA: Certifique-se de adicionar a solução de FeCl₃ imediatamente antes de usar o papel de filtro. Embeber o papel muito cedo pode levar à evaporação da solução de FeCl₃ e alterar a gravidade da lesão.
   4. Com pinça fina, pegue o papel filtro e coloque-o na artéria a montante da sonda, na parte da artéria marcada pelo plástico (Figura 2D,E). Este plástico atua como um marcador e um espaçador. Ele marca a área lesionada e evita a diluição acidental do FeCl₃, evitando o contato com a área úmida circundante.
      NOTA: Certifique-se de que o papel de filtro está reto, não beliscado ou dobrado de qualquer outra forma. Uma vez colocado na artéria, não altere a posição do papel de filtro; Isso altera a extensão da lesão.
   5. Depois de colocar o papel de filtro, ligue o temporizador e registre o fluxo sanguíneo. Após 3 min, retire o papel e adicione soro fisiológico no local da lesão para remover a FeCl₃ e interromper o processo de lesão. Também torna a área úmida. Nessa fase, o fluxo sanguíneo deve retornar ao nível basal, conforme registrado pré-lesão.
   6. Monitore e registre o fluxo até que ele reduza para 10% da gravação original ou atinja zero. Há uma diminuição constante quando o trombo começa a se formar no local da lesão (Figura 3C). Observe quaisquer flutuações significativas no fluxo durante esse período.
   7. Para estudar a estabilidade do trombo, registre o rápido aumento do fluxo sanguíneo após cada diminuição significativa e consistente. Esses eventos são classificados como embolização por trombose instável (Figura 4D). Após a diminuição consistente do fluxo, o operador é capaz de ver a lesão na artéria ao final do experimento (Figura 2F, seta azul/oval pontilhada).
   8. O tempo de oclusão do vaso é definido como a cessação completa do fluxo sanguíneo por pelo menos 1 min. Registre o tempo em que um trombo oclusivo é formado, como mostrado pela leitura de zero ou diminuição significativa do fluxo.
   9. Finalizar o experimento aos 30 min. Se o trombo não se formar dentro de 30 minutos após o monitoramento, registre o fluxo, pare a gravação e remova a sonda.
   10. Limpe a sonda com etanol 70% e uma escova para remover qualquer tecido residual/cabelo ou detritos. Seque completamente a sonda antes de colocá-la na caixa de armazenamento. Seque completamente a sonda antes de colocá-la na caixa de armazenamento para armazenamento a longo prazo.
   11. Eutanásia do camundongo por luxação cervical. Coloque a carcaça no saco de descarte de carcaça, rotulado com o nome do laboratório e a data.

2. Coleta e preparação de amostras para estudos seriados de microscopia eletrônica de varredura facial (SBF-SEM) pós-lesão induzida por FeCl₃

OBS: O protocolo de ME apresentado é apropriado para o preparo da amostra para o SBF-MEV. Esta técnica de imagem oferece uma capacidade sem precedentes de estudar a estrutura tridimensional das plaquetas em um coágulo. Com essa técnica, a amostra é visualizada como uma série de imagens sequenciais de MEV em bloco, geradas à medida que se avança pela amostra. Os pontos-chave para essa preparação são: 1) a amostra deve ser corada com metais pesados pré-embutindo; e 2) a amostra embutida em plástico deve ser aparada adequadamente para montagem dentro do MEV (ver Figura 6 para uma visão das amostras aparadas). A coloração pós-incorporação não é possível dentro da MEV. Ao coletar uma amostra de uma lesão de vaso induzida por FeCl₃ para análise de EM, as seguintes alterações precisam ser feitas durante a realização da cirurgia. As modificações no protocolo cirúrgico de FeCl₃ apresentadas também são aplicáveis a qualquer forma de microscopia eletrônica. As condições anestésicas e os passos para incisão e exposição da artéria carótida são os mesmos do Protocolo 1.

1. Após a exposição da artéria carótida, marcar o local da lesão circundando frouxamente a região entre dois fios cirúrgicos (tamanho: 0,1 mm) (Figura 5A,B).
2. Colocar a sonda sob a artéria, distal ao fio inferior (Figura 5C).
3. Inserir a peça plástica sob a artéria entre os dois fios para marcar o local da lesão da FeCl₃ (Figura 5C).
4. Realizar medições de fluxo antes de realizar a lesão para observar o fluxo basal. Essas medidas são usadas para decidir em qual estágio a amostra será coletada.
   OBS: Certifique-se de que o fixador (paraformaldeído a 3%/PFA + glutaraldeído a 0,1%, ambos fabricados em 1x PBS) esteja pronto e em RT. Alternativamente, a fixação com glutaraldeído a 2,5% em fundo salino também pode ser usada.
   CUIDADO: Tanto o paraformaldeído quanto o glutaraldeído são altamente tóxicos e irritantes. Ao manuseá-los, luvas, protetor ocular e máscaras devem ser usados para proteger da exposição. Todas as soluções fixadoras são tóxicas, e as etapas de fixação devem ser realizadas em uma capela de fumaça.
5. Realizar a lesão colocando papel de filtro embebido em FeCl 3 na artéria (8% FeCl 3 é usado) por₃ min (esse tempo também pode variar). Após 3 min, remova o papel filtro e adicione soro fisiológico no local da lesão para remover qualquer excesso de FeCl_{residual 3}. Essa etapa é necessária para evitar a extensão variável da lesão e facilitar a contagem do fluxo pela sonda (Figura 5D).
6. Monitore a leitura do fluxo. Quando o fluxo cair abaixo de 50% do valor inicial, remova a sonda. Seque rapidamente a área e adicione o fixador na área para fixar externamente a área da lesão.
7. Segurar prontamente a artéria próxima à área da lesão com pinça e cortar a jusante do fio inferior e a montante do fio superior. Se necessário, peça a outra pessoa que ajude a cortar uma das extremidades. Coloque o tecido na placa de cultura de tecido plástico na mesma orientação em que foi coletado e adicione algumas gotas do fixador.
   NOTA: Cortar a artéria causa sangramento extenso imediato, por isso certifique-se de segurar a artéria antes de cortá-la pela primeira vez. Nesse cenário, o mouse é exanguinado. O camundongo é eutanasiado por exsanguinação e luxação cervical.
8. Usando um bisturi, limpe o tecido extra ao redor da artéria. Esteja atento para registrar a orientação do fluxo sanguíneo. Para marcá-lo, corte uma extremidade horizontalmente e a outra afilando/oblíqua (Figura 5E).
9. Manter a amostra em fixador (PFA 3% e glutaraldeído 0,1%) por 1 h no TR. Em seguida, armazenar a amostra em PFA a 1% a 4 °C até enviá-la em gelo úmido para o laboratório de processamento de amostras para análise de EM.
   NOTA: As amostras não devem ser congeladas. Os desafios para esse método de coleta de amostras são:
   1. A leitura inicial pode não ser ótima ou flutuar após a lesão. Isso pode afetar a extensão da lesão escolhida para a análise de EM. Para resolver esse problema, certifique-se de registrar a leitura da linha de base por alguns minutos, depois de tentar várias posições de colocação da sonda para decidir qual posição é a ideal.
   2. O tempo para deter a lesão adicionando fixador externo e corte real do corte arterial para análise pode adicionar variabilidade à extensão da trombose. Seja rápido durante a coleta de amostras após a fixação externa.
10. Receber as amostras para processamento para análise de EM em PFA 1% sobre gelo úmido. Enxaguar as amostras por 3 min, em gelo, com tampão cacodilato 0,1 M para iniciar o processamento posterior.
11. Fixar as amostras por 1 h em gelo em tampão cacodilato 0,1 M + glutaraldeído 2,5% + CaCl₂ mM.
12. Descarte o fixador e lave as amostras com tampão cacodilato de sódio 0,1 M frio contendo CaCl₂ 2 mM (5 x 3 min) (Figura 6A).
13. Fixar as amostras com solução de ósmio (ferrocianeto de potássio a 3% [K 4C 6 N₆Fe] + tampão cacodilato 0,3 M + CaCl 2 4 mM misturado com um volume igual de tetróxido de ósmio aquoso a 4% [OsO₄; em ddH₂ O]) durante 1 h nogelo.
14. Enquanto as amostras estão fixando, fazer solução fresca de hidrato de tricloroacetaldeído (TCH) a 1% em ddH₂O. Incubar a solução a 60 °C por 1 h enquanto mistura suavemente.
15. Após a fixação, lavar as amostras com ddH₂O em TR por 5 x 3 min.
16. Incubar as amostras em solução filtrada de TCH a 1% (fabricada em ddH₂O) durante 20 min em RT.
17. Lavar as amostras com ddH₂O em TR (5 x 3 min).
18. Fixar as amostras em tetróxido de ósmio a 2% em ddH₂O durante 30 min em RT.
19. Lavar as amostras com ddH₂O em RT por 5 x 3 min cada.
20. Colocar as amostras em acetato de uranilo a 1% (aquoso) e incubar durante a noite a 4 °C.
21. Lave as amostras com ddH₂O em RT por 5 x 3 min cada, e processe-as com coloração de aspartato de chumbo de Walton em bloco .
22. Em bloco Coloração de aspartato de chumbo de Walton³:
    1. Fazer 30 mM solução de ácido L-aspártico em ddH₂O.
       NOTA: O ácido aspártico dissolve-se mais rapidamente se o pH for elevado para 3,8. Esta solução de estoque é estável por 1-2 meses se refrigerada.
    2. Completar solução de nitrato de chumbo 20 mM em 10 mL de estoque de ácido aspártico e ajustar o pH para 5,5 com 1 N KOH.
    3. Colocar as amostras em solução de aspartato de chumbo a 60 °C durante 30 minutos, após cinco lavagens com ddH₂O à RT, cada uma durante 3 minutos.
23. Desidratar os espécimes com uma série graduada de etanol. Utilizar a desidratação química pelo protocolo de Valdivia¹⁸.
    1. Lavar as amostras em cada uma das seguintes soluções para desidratar progressivamente a amostra (figura 6B):
       Álcool etílico a 25% por 3 min
       Álcool etílico 50% por 3 min
       álcool etílico 75% por 3 min
       Álcool etílico 95% por 3 min
       Álcool etílico 100% por 10 min, e repita o passo duas vezes (total de três lavagens).
24. Lavar as amostras em óxido de propileno (PO) a 100% durante 10 minutos e repetir o passo duas vezes (total de três lavagens).
25. Incubar em 50%/50% PO/resina com ativador DMP 30 durante a noite em RT e incorporar em 100% Araldite 502/embed 812/DDSA com ativador DMP30 por 48 h.

Resultados

Os dados são geralmente apresentados como tempo para a oclusão, ou tempo necessário para formar um trombo totalmente oclusivo. Esses dados podem ser plotados como uma curva de sobrevida de Kaplan-Meier (Figura 4A)¹⁹, um gráfico de pontos com barras mostrando o fluxo sanguíneo terminal no momento da cessação do fluxo sanguíneo ou do término de um experimento (Figura 4B), ou como um gráfico de linhas (Figura 4C).

Discussão

A aplicação tópica de FeCl₃ na vasculatura para induzir trombose é uma técnica amplamente utilizada e tem sido fundamental no estabelecimento de papéis para vários receptores plaquetários, vias de sinalização de ligantes e seus inibidores^20,21,22,23. O mecanismo pelo qual a FeCl₃ causa trombose é multifacetado; Anteriormente, o desnudamento endotelial era consid...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline	Fisher Scientific	BP358-212	NaCl used to make a solution of 0.9% saline
1 mL Syringe	Becton, Dickinson and Company	309659
190 Proof Ethanol	KOPTEC	V1101	Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery
2,2,2 Tribromoethanol	Sigma Aldrich	48402
25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0)	DEKNATEL	136082-1204
26G x 3/8 Needle	Becton, Dickinson and Company	305110
2-methyl-2-butanol	Sigma Aldrich	240486
7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL	Globe Scientific Inc.	135010
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)	Medline	MDS090735
Araldite GY 502	Electron microscopy Services	10900
Cell Culture Dish 35mm X 10mm	Corning Incorporated	430165
Compact Scale	Ward's Science	470314-390
Dissecting Scissors, 12.5 cm long	World Precision Instrument	15922-G
DMP-30 activator	Electron microscopy Services	13600
Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA	Electron microscopy Services	13700
Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag	Crown Products	PP-RB-200
Doppler FlowProbe	Transonic Systems Inc.	MA0.5PSB
EMBED 812 resin	Electron microscopy Services	14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof	Electron microscopy Services	15055
Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips	Integra Miltex	18-784
Filter Paper	VWR	28310-106
Fine Scissors - Sharp-Blunt	Fine Science Tools	14028-10
Finger Loop Ear Punches	Fine Science Tools	24212-01
Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply	Dukal Corporation	2128
Glutaraldehyde (10% solution)	Electron microscopy Services	16120
Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10	Integra® Miltex®	4110
Iron (III) Chloride	SIGMA-ALDRICH	157740-100G
Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3	Integra Lifesciences	157510
L-aspartic acid	Sigma Fisher	A93100
L-aspartic acid	Fisher Scientific	BP374-100
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L-62
LEICA S8AP0 Microscope	LEICA	No longer available	No longer available from the company
LEICA S8AP0 Microscope Stand	LEICA	10447255	No longer available from the company
Light-Duty Tissue Wipers	VWR	82003-822
Micro Dissecting Forceps; 1x2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical Instrument Company	RS-5157
Osmium Tetroxide 4% aqueous solution	Electron microscopy Services	19150
Paraformaldehyde (16% solution)	Electron microscopy Services	15710
Potassium ferricyanide	SIGMA-ALDRICH	P-8131
Propylene Oxide, ACS reagent	Electron microscopy Services	20401
Rainin Classic Pipette PR-10	Rainin	17008649
Research Flowmeter	Transonic Systems Inc.	T402B01481	Model: T402
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear	Scotch	305289
Small Animal Heated Pad	K&H Manufacturing Inc.	Model: HM10
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4	Electron microscopy Services	11623
Sterile Cotton Tipped Applicators	Puritan Medical Products	25-806 1WC
Steromaster Illuminator	Fisher Scientific	12-562-21	No longer available from the company
Surgical Dumont #7 Forceps	Fine Science Tools	11271-30
Thiocarbohydrazide (TCH)	SIGMA-ALDRICH	88535
Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL)	VWR	76323-394
Uranyl Acetate	Electron microscopy Services	22400
Veet Gel Cream Hair Remover	Reckitt Benckiser	3116875
White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm	Fisher Scientific	S38975
WinDAQ/100 Software for Windows	DATAQ Instruments, Inc.	Version 3.38	Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/
ZEISS AxioCam Icc 1	ZEISS	57615