التحفيز الآلي متعدد الوسائط والتسجيل العصبي المتزامن من كائنات صغيرة متعددة

Summary

نقدم طريقة للتحفيز الكيميائي والمتعدد الوسائط المرن وتسجيل النشاط العصبي المتزامن من العديد من ديدان Caenorhabditis elegans . تستخدم هذه الطريقة الموائع الدقيقة والأجهزة والبرامج مفتوحة المصدر وتحليل البيانات الآلي الخاضع للإشراف لتمكين قياس الظواهر العصبية مثل التكيف والتثبيط الزمني والحديث المتبادل للتحفيز.

Abstract

ساهمت مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا الفلورية بشكل كبير في فهمنا للديناميكيات العصبية من مستوى الخلايا العصبية الفردية إلى دوائر الدماغ بأكملها. ومع ذلك ، قد تختلف الاستجابات العصبية بسبب الخبرة السابقة أو الحالات الداخلية أو العوامل العشوائية ، مما يولد الحاجة إلى طرق يمكنها تقييم الوظيفة العصبية عبر العديد من الأفراد في وقت واحد. في حين أن معظم تقنيات التسجيل تفحص حيوانا واحدا في كل مرة ، فإننا نصف استخدام الفحص المجهري واسع المجال لتوسيع نطاق التسجيلات العصبية إلى العشرات من Caenorhabditis elegans أو غيرها من الكائنات الحية دون المليمترية في وقت واحد. تتيح الأجهزة والبرامج مفتوحة المصدر مرونة كبيرة في برمجة التجارب المؤتمتة بالكامل التي تتحكم في شدة وتوقيت أنواع التحفيز المختلفة ، بما في ذلك المحفزات الكيميائية والبصرية والميكانيكية والحرارية والكهرومغناطيسية. على وجه الخصوص ، توفر أجهزة تدفق الموائع الدقيقة تحكما دقيقا ومتكررا وكميا في المنبهات الحسية الكيميائية بدقة زمنية دون الثانية. ثم يستخرج خط أنابيب تحليل البيانات شبه الآلي NeuroTracker الاستجابات العصبية الفردية وعلى مستوى السكان للكشف عن التغييرات الوظيفية في الإثارة والديناميكيات العصبية. تقدم هذه الورقة أمثلة على قياس التكيف العصبي ، والتثبيط الزمني ، والحديث المتبادل للتحفيز. تزيد هذه التقنيات من دقة التحفيز وتكراره ، وتسمح باستكشاف التباين السكاني ، ويمكن تعميمها على إشارات الفلورسنت الديناميكية الأخرى في الأنظمة الحيوية الصغيرة من الخلايا والكائنات العضوية إلى الكائنات الحية والنباتات بأكملها.

Introduction

سمحت تقنيات تصوير الكالسيوم بالتسجيل غير الباضع للديناميكيات العصبية في الجسم الحي في الوقت الفعلي باستخدام الفحص المجهري الفلوري ومؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا المعبر عنها في الخلايا المستهدفة^1،2،3. تستخدم هذه المستشعرات عادة بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، مثل عائلة الببتيد GFP-calmodulin-M13 (GCaMP) ، لزيادة شدة التألق عند تنشيط الخلايا العصبية وارتفاع مستويات الكالسيوم داخل الخلايا. كان تصوير الكالسيوم قويا بشكل خاص في الديدان الخيطية C. elegans لفحص كيفية عمل الخلايا العصبية والدوائر العصبية في الحيوانات الحية والتصرف⁴،⁵،⁶،⁷،⁸،⁹،¹⁰ ، لأن طبيعتها الشفافة تعني عدم الحاجة إلى عملية جراحية للوصول البصري ^، وتستهدف محفزات الجينات الخاصة بالخلية التعبير إلى الخلايا محل الاهتمام. غالبا ما تستخدم هذه التقنيات أجهزة الموائع الدقيقة ، والتي توفر بيئات يتم التحكم فيها بدقة لدراسة الظواهر البيولوجية والكيميائية والفيزيائية على نطاق فيزيائي صغير^11,12. تكثر أجهزة الموائع الدقيقة لقياس النشاط العصبي ، مع تصميمات جديدة قيد التطوير باستمرار ، ويتم تصنيعها بسهولة في مختبر الأبحاث. ومع ذلك ، فإن العديد من التصميمات تحبس حيوانا واحدا في كل مرة ، مما يحد من الإنتاجية التجريبية⁷،^9،13. غالبا ما تختلف الاستجابات العصبية اختلافا كبيرا بين الحيوانات بسبب الاختلافات في الخبرة السابقة ، أو الحالات الداخلية مثل الإجهاد أو الجوع ، أو العوامل العشوائية مثل مستويات التعبير الجيني. هذه الاختلافات تحدد الحاجة إلى طرق يمكن أن تحفز وتراقب في وقت واحد العديد من الحيوانات واستخراج المعلومات من الأفراد⁴.

بالإضافة إلى ذلك ، تصبح بعض الظواهر العصبية واضحة فقط في ظل ظروف تحفيز محددة ، مثل التثبيط الزمني¹⁴ ، والذي يشير إلى قمع قصير للاستجابات عندما يحدث التحفيز في تتابع سريع. يمكن للأنظمة الفيزيولوجية الكهربية أن تدفع النشاط العصبي عبر مساحة تحفيز واسعة لهذا الغرض ، حيث تعدل ، على سبيل المثال ، تيار النبض الكهربائي ، والجهد ، والتردد ، وشكل الموجة ، ودورة العمل ، وتوقيت قطارات التحفيز الدورية. سيستفيد التحفيز غير المباشر بواسطة المحفزات المكتشفة بشكل طبيعي أو الأنظمة البصرية الوراثية من اتساع مماثل لآليات التحكم. في الوقت الحالي ، يتم تقديم العديد من المحفزات الطبيعية بطريقة "تشغيل-إيقاف" بسيطة ، مثل عرض الرائحة وإزالتها ، باستخدام أنظمة تجارية كانت بطيئة في إضافة المرونة. ومع ذلك ، يمكن للمتحكمات الدقيقة غير المكلفة الآن أتمتة توصيل عدة أنواع من المحفزات بطريقة قابلة للتخصيص وفقا لاحتياجات الباحثين. بالاقتران مع الموائع الدقيقة ، حققت هذه الأنظمة هدف زيادة الإنتاجية التجريبية والمرونة ، مما يسمح بقياس الاستجابات العصبية لمجموعة متنوعة من المحفزات الدقيقة في وقت واحد في العديد من الحيوانات ^4,6. يمكن استخدام التحفيز متعدد الوسائط لمزيد من استجواب الدوائر العصبية ، مثل مراقبة التغيرات في استثارة الأعصاب عند التحفيز المستمر قبل وأثناء وبعد الاضطراب المتعامد مثل التعرض للأدوية⁴. إن فوائد أنظمة الفحص المجهري المفتوحة وغير المكلفة واضحة للنهوض بالبحث العلمي ، ولكن من الناحية العملية ، يمكن أن تعيق الحاجة إلى مصادر الأجزاء والبناء والتحقق من الأداء اعتماد هذه التقنيات.

يهدف هذا البروتوكول إلى التخفيف من بعض هذه التحديات التقنية. في حين ركزت البروتوكولات السابقة على استخدام جهاز الموائع الدقيقة والتحفيز الأساسي⁹،¹⁵،^{17 ،} فإننا نصف هنا بناء واستخدام نظام توصيل تحفيز مرن وآلي ومتعدد الوسائط للتصوير العصبي في C. elegans أو الكائنات الصغيرة الأخرى باستخدام أجهزة الموائع الدقيقة الموصوفة سابقا⁴. تتم برمجة النظام مفتوح المصدر عبر ملفات نصية بسيطة لتحديد التجارب ، ويقوم برنامج تحليل البيانات NeuroTracker باستخراج بيانات النشاط العصبي بشكل شبه تلقائي من مقاطع الفيديو المجهرية. نوضح هذا النظام بأمثلة لتقييم التثبيط الزمني ، وإزالة التثبيط ، والحديث المتبادل للتحفيز باستخدام الخلايا العصبية الحسية الكيميائية AWA ، والتي تزيل الاستقطاب استجابة لروائح الطعام المختلفة أو استجابة للضوء عند التعبير عن القنوات الأيونية الحساسة للضوء البصري ^5,6.

Protocol

1. معدات التصوير العصبي

ملاحظة: انظر Lawler and Albrecht¹⁵ للحصول على تعليمات مفصلة حول بناء نظام التصوير والتحفيز ، الذي يتحكم في توقيت إضاءة المجهر ، والحصول على الصور ، وتسليم التحفيز (الشكل 1). تقوم وحدة التحكم في التحفيز Arduino Nano غير المكلفة بتشغيل الصمامات السائلة من خلال الإشارات الرقمية إلى وحدة التحكم في الصمام والتحكم في الإضاءة البصرية الجينية من خلال إشارات الجهد التناظرية إلى وحدة تحكم LED. يمكن التحكم في المحفزات الأخرى ، مثل محركات الاهتزاز والسخانات الحرارية ، باستخدام إشارات رقمية أو تناظرية. تقوم وحدة التحكم في التحفيز بمزامنة التحفيز وتسجيل الصور عبر إشارات الكاميرا ، كما هو محدد بواسطة برنامج التحكم في مجهر Micro-Manager مفتوح المصدر (μManager) ¹⁶. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والمعدات والكائنات الحية المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. قم بإعداد معدات التصوير العصبي ، بما في ذلك مجهر التألق مع بصريات GFP ، وكاميرا sCMOS مع إشارة خرج التعرض الرقمية ، ووحدة تحكم التحفيز¹⁵.
2. قم بتوصيل وحدة التحكم في التحفيز بالأنظمة المطلوبة عبر الإشارات الرقمية أو التناظرية. بالنسبة للأمثلة المعروضة أدناه ، يتم استخدام الأنظمة التالية:
   1. استخدم وحدة تحكم الصمام للتحفيز الكيميائي. قم بتوصيل وحدة التحكم في الصمام بالملف اللولبي السائل أو صمامات القرص (الشكل 1)¹⁵.
   2. استخدم مصباح LED أحمر 615 نانومتر ووحدة تحكم للتحفيز البصري الوراثي ، مثبتة فوق مرحلة المجهر.
3. قم بإعداد الكمبيوتر باستخدام برنامج التحكم في المجهر ، وقم بإنشاء إعداد مسبق للتكوين مع إعدادات المعدات ، وتأكد من التشغيل السليم للتحكم في التحفيز¹⁵.

2. تصنيع جهاز الموائع الدقيقة

ملاحظة: انظر Lagoy et ^al.17 للحصول على معلومات مفصلة حول الحصول على القوالب الرئيسية أو تصنيعها وإنتاج واستخدام وتنظيف أجهزة الموائع الدقيقة. ويرد أدناه موجز لهذه الخطوات.

1. الحصول على أو تصنيع قالب رئيسي باستخدام ملف تصميم الموائع الدقيقة المقدم (albrechtlab.github.io/microfluidics)¹⁷. بالنسبة للشباب البالغين C. elegans ، تأكد من أن ارتفاع القناة هو 55-70 ميكرومتر.
2. اجمع بين قاعدة PDMS وعامل المعالجة بنسبة 10: 1 بالوزن واخلطها جيدا مع ماصات النقل.
3. ديغا لمدة 30-60 دقيقة في مجفف فراغ حتى تختفي الفقاعات.
4. ضع القالب الرئيسي في طبق بتري كبير (قطره 150 مم) ، واسكب PDMS المنزوع الغازات حتى عمق 4-5 مم (~ 100 جم). افحص وأزل أي غبار أو فقاعات باستخدام ماصة النقل.
5. تخبز على حرارة 65 درجة مئوية على رف فرن مستو لمدة 3 ساعات حتى طوال الليل.
6. بمجرد الشفاء ، استخدم مشرطا لقطع PDMS من القالب وشفرة حلاقة مستقيمة لفصل الأجهزة.
7. قم بثقب فتحات المدخل والمخرج باستخدام لكمة جلدية 1 مم ، وقم بتنظيفها باستخدام dH 2 O ،والإيثانول ، ومرة أخرى باستخدام dH₂O. جفف الجهاز في تيار هوائي (انظر الشكل 2A).
8. نظف جانبي جهاز PDMS بشريط لاصق ، وقم بإزالة أي غبار أو حطام.
9. قم بإعداد الشرائح الزجاجية لإكمال جهاز الموائع الدقيقة كما هو موضح¹⁷. قم بحفر فتحات مدخل في الشريحة العلوية باستخدام لقمة ماسية ، واجعل الشريحة السفلية كارهة للماء عن طريق التعرض لأبخرة TFOCS أو عن طريق تطبيق معالجة الزجاج المقاوم للماء (الشكل 2 ب).
10. قم بتجميع شطيرة جهاز PDMS الزجاجية في مشبك (الشكل 2C).

3. إعداد الحيوان

1. الحصول على أو إنشاء الحيوانات مع مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا المعبر عنها في الخلايا العصبية ذات الأهمية.
   ملاحظة: على سبيل المثال، السطر NZ1091 (kyIs587 [gpa-6p::GCaMP2.2b; UNC-122p::d sRed]; kyIs5662 [odr-7p::Chrimson:SL2:mCherry; elt-2p :: mCherry]) يعبر GCaMP وقناة الكاتيون الحساسة للضوء الأحمر Chrimson في زوج الخلايا العصبية الحسية AWA⁶. يتم دمج كل من الجينات المحورة في الجينوم للتعبير المستقر في كل.
2. قبل يوم واحد من التجربة ، ضع ما لا يقل عن 20 مرحلة يرقية L4 C. elegans لكل تجربة على صفيحة أجار متوسطة نمو الديدان الخيطية (NGM) المصنفة بعشب OP50 E. coli. عند الحفاظ على درجة حرارة 20 درجة مئوية ، سيؤدي ذلك إلى مزامنة الحيوانات البرية في مرحلة الشباب في اليوم التالي.
   ملاحظة: بالنسبة لجينات التحوير الصفيفية، اختر الحيوانات باستخدام مجسمة مضان لضمان التعبير الجيني المحورة في الحيوانات المختارة.

4. إعداد الحل

1. قم بإعداد 1x S المخزن المؤقت القاعدي (100 mM NaCl و 0.05 M KPO₄ ، pH 6.0) من محلول مخزون 10x.
2. قم بإعداد مخزن مؤقت رباعي 1 مللي متر عن طريق تخفيف مخزون 1 متر في 1x S Basal. استخدم هذا المخزن المؤقت المشلول لإعداد جميع المحفزات. تستخدم التجربة عادة حوالي 150 mL.
3. أضف 0.1-1 ميكروغرام / مل فلوريسئين إلى الخزانات العازلة "التحكم" لتصور التدفق.
4. إنشاء حلول التحفيز عن طريق التخفيف التسلسلي إلى التركيز النهائي المطلوب. على سبيل المثال ، قم بإنشاء تخفيف 10−⁷ من جاذب ثنائي الأسيتيل عن طريق إنشاء مخزون 10⁻³ أولا.
   ملاحظة: يمكن إضافة كمية صغيرة من الفلوريسئين (0.1-1 ميكروغرام / مل) إلى المحفز أو المحلول العازل للتحقق من توقيت التحفيز ، ولكن يجب أن يكون التركيز ضئيلا لتجنب القطع الأثرية في التألق العصبي.

5. إعداد جهاز الموائع الدقيقة

ملاحظة: انظر Reilly et ^al.9 للحصول على بروتوكول فيديو يوضح توليد الخزان وإعداد الجهاز وتحميل الحيوانات. انظر أيضا Lagoy et ^al.17 للحصول على بروتوكول مكتوب يتضمن العديد من النصائح المفيدة.

1. تحضير ثلاثة أو أكثر من خزانات السوائل. لكل منها ، قم بتوصيل خزان حقنة سعة 30 مل أو 60 مل ، وحقنة تحضير سعة 3 مل ، وكعب إبرة بصمام Luer ثلاثي الاتجاهات (الشكل 2D). قم بتوصيل الإبرة بأنبوب التجويف الصغير المزود بأنبوب معدني في النهاية. قم بتسمية الخزانات ، وقم بتثبيتها على رف متصل بحامل حلقي ، واملأها بالمخزن المؤقت أو سوائل التحفيز المقابلة (الشكل 2E).
2. قم بإزالة غاز جهاز الموائع الدقيقة المجمع في مجفف فراغ لمدة ~ 1 ساعة.
3. املأ وإزالة فقاعات الهواء من أنبوب الخزان باستخدام حقنة التحضير. املأ أنبوب التدفق الخارجي بالمخزن المؤقت.
4. قم بإزالة جهاز الموائع الدقيقة من الفراغ ، وأدخل أنبوب المخرج بسرعة وحقن السائل عبر الجهاز حتى تظهر قطرة من مدخل واحد.
5. عند هذا المدخل ، استخدم وصلة "قطرة إلى إسقاط"¹⁷ لإدخال أنبوب مدخل السوائل المقابل (الشكل 2F). تأكد من وجود قطرات سائلة على كل من أنبوب المدخل وفتحة منفذ الجهاز لتجنب إدخال فقاعة.
6. قم بحقن المزيد من السوائل من المخرج ، وقم بتوصيل أنبوب المدخل التالي ، وكرر ذلك حتى تمتلئ جميع المداخل. أدخل دبوس حظر صلبا في أي مداخل غير مستخدمة ومنفذ تحميل الدودة.
7. ابدأ التدفق عن طريق فتح صمامات Luer للمدخل والمخرج. افحص الجهاز بحثا عن تسربات عند المداخل والقاعدة الزجاجية. افحص الجهاز بحثا عن أي فقاعات داخل قنوات التدفق أو المداخل باستخدام برنامج التقاط الصور المجهري في الوضع المباشر.
   ملاحظة: في حالة وجود فقاعات ، انتظر حتى يتم امتصاصها في مادة PDMS.

6. تحميل الحيوانات

ملاحظة: انظر Lagoy et ^al.17.

1. انقل الحيوانات البالغة الصغيرة إلى صفيحة أجار NGM غير مصنفة باستخدام "معول" ذو رأس سلكي.
2. اغمر اللوحة بحوالي 5 مل من المخزن المؤقت القاعدي 1x S بحيث تسبح الحيوانات.
3. ارسم الديدان في حقنة تحميل (حقنة 1 مل أو 3 مل مع أنبوب متصل تم ملؤه مسبقا ب 1x S Basal).
   1. باستخدام مجسم، حرك طرف الأنبوب أسفل سطح السائل بيد واحدة لكل مرغوب فيه، واسحبه إلى الأنبوب باستخدام المحقنة الموجودة في اليد الأخرى.
   2. ارسم الديدان فقط في الأنبوب ، وليس في المحقنة.
      ملاحظة: يستوعب الأنبوب عادة حوالي 100 ميكرولتر فقط. يمكن طرد الحيوانات إلى منطقة محلية ثم سحبها مرة أخرى إلى الأنبوب بحجم صغير.
4. أغلق خط المخرج ، وقم بإزالة دبوس تحميل الفيروس المتنقل ، وقم بتوصيل حقنة تحميل الفيروس المتنقل بالجهاز باستخدام اتصال قطرة إلى إسقاط.
5. تدفق الحيوانات بلطف إلى الساحة ، وإنشاء تدفق عازلة ، والسماح لما يصل إلى 1 ساعة للشلل بواسطة tetramisole.
   ملاحظة: خلال فترة التثبيت ، تأكد من دخول السائل العازل فقط إلى الساحة. يمكن إيقاف تشغيل خزانات التحفيز والتحكم خلال هذه الفترة ولكن فتحها والتحقق من التدفق الصحيح قبل إجراء تجارب التحفيز.

7. التحفيز الآلي والتسجيل العصبي

1. قم بإنشاء ملف نصي لتعريف التحفيز يسمى "إعدادات الاستحواذ المعرفة من قبل المستخدم.txt" باستخدام محرر نصوص (على سبيل المثال ، المفكرة) يحتوي على إعدادات التحفيز للحصول على الصور تلقائيا (انظر الأمثلة في الشكل 3). تنقسم الإعدادات إلى قسمين:
   1. إعدادات اكتساب المجهر: حدد نوع التجربة (تحفيز واحد أو متعدد الأنماط) ، وتوقيت التعرض والإثارة ، ومدة التجربة وفواصل زمنية ، وحفظ الدليل.
   2. إعدادات التحفيز: تحديد معلمات التحكم في التحفيز. يحدد "أمر التحفيز" الإجراءات التي تحدث في إطارات فيديو معينة مع بناء الجملة <رمز الحرف >< رقم الإطار> ، حيث تكون رموز الحروف A = valve1 ، B = valve2 ، C = valve3 ، L = ضوء LED ؛ بالإضافة إلى ذلك ، الأحرف الكبيرة = تشغيل والأحرف الصغيرة = إيقاف. يتم ضبط شدة LED برمز الحرف "i" وقيمة من 0 (إيقاف) إلى 255 (أقصى سطوع).
      ملاحظة: تحدد قيمة شدة LED من 0 إلى 255 الجهد التناظري الناتج من 0 فولت إلى 5 فولت. تحتوي وحدة التحكم الحالية المستخدمة هنا على مقياس كثافة خطي ، ويجب معايرة الآخرين باستخدام مقياس طاقة خفيف.
      1. في تجربة التحفيز الأحادي باستخدام أمر تحفيز متكرر واحد فقط، استخدم التنسيق الوارد في الشكل 3 أ.
      2. لتجربة متعددة الأنماط مع أوامر تحفيز متعددة ، استخدم التنسيق في الشكل 3 ب. قم بتضمين "تسلسل نمطي" من الأرقام التي تمثل ترتيب أنماط التحفيز. لكل نمط ، أدخل أمر تحفيز في سطر منفصل.
         ملاحظة: يمكن أن يكون التسلسل شبه العشوائي أو التسلسل m مفيدا للتحقيق في الاعتماد على تاريخ التحفيز.
2. قم بتشغيل برنامج التحكم المجهري. تحقق من أن جميع مداخل السوائل مفتوحة ، وأن التدفق كما هو مطلوب داخل الساحة (انظر الشكل 2H) ، وأن الخلايا العصبية ذات الأهمية في بؤرة التركيز داخل النافذة الحية.
3. أغلق النافذة الحية وقم بتشغيل البرنامج النصي "MultiPattern_RunScript.bsh" داخل البرنامج.
   ملاحظة: من المفيد إجراء تجربة اختبار بدون للتحقق من التدفق والتحفيز المناسبين. يمكن أن يساعد استبدال تركيز فلوريسئين مختلف لكل سائل مثير في تصور وتوثيق أنماط التحفيز الجديدة.
4. بعد التجريب ، قم بتفكيك جهاز الموائع الدقيقة ، وشطف جميع الأسطح والأنابيب والخزانات بالماء.
   ملاحظة: يمكن إعادة استخدام جميع المكونات عشرات المرات إذا تم الحفاظ عليها نظيفة. تأكد من الحفاظ على الخزانات والأنابيب وأجهزة الموائع الدقيقة رطبة أو جافة تماما في تيار هوائي لتجنب تبلور الملح ، والذي يمكن أن يسد ويصعب إزالته. يمكن الاحتفاظ بالأجهزة في الإيثانول للتعقيم ولكن يجب تجفيفها بالكامل قبل إعادة استخدامها (>1 ساعة عند 65 درجة مئوية) ¹⁷.

8. تحليل البيانات باستخدام NeuroTracker

ملاحظة: NeuroTracker⁴،¹⁸،¹⁹ هو مكون إضافي لبرنامج ImageJ / FIJI²⁰ لتتبع شدة التألق للعديد من الخلايا العصبية والحيوانات ^، حتى أثناء تحركها أثناء التجارب. يحفظ هذا المكون الإضافي البيانات كملفات نصية مع موضع كل خلية عصبية وشدة مضان مصححة في الخلفية (F). يتم تطبيع بيانات التألق إلى مضان خط الأساس (F 0) ، على سبيل المثال ، متوسط عدة ثوان قبل التحفيز ، مثل Δ F / F 0 = (F -F 0) / F ₀ ، والتي يمكن حسابها في المتوسط عبر السكان.

1. قم بتثبيت البرامج النصية NeuroTracker وفقا للتعليمات (github.com/albrechtLab/Neurotracker).
2. قم بتشغيل NeuroTracker بالنقر فوق المكونات الإضافية | التتبع | نيوروتراكر.
3. حدد المجلد الذي يحتوي على ملف. ملفات فيديو TIF المراد تتبعها ، وحدد الإعدادات المطلوبة.
   ملاحظة: إذا كان سيتم تعقب مجموعة فرعية فقط من ملفات الفيديو، حدد النطاق العددي للملفات المراد تحليلها عند المطالبة. إعدادات التتبع الافتراضية مناسبة للحيوانات غير المتحركة بدقة 250 بكسل / مم. اضبط المعلمات بشكل متناسب مع درجات الدقة الأخرى. راجع دليل المستخدم¹⁹ للحصول على مزيد من المعلومات حول الإعدادات.
4. اضبط عتبة الشدة بحيث تكون الخلايا العصبية مرئية للاختيار (الشكل 4).
5. افتح نوافذ التحكم في السطوع / التباين (B / C) وعتبة التحكم باستخدام الصورة | ضبط القائمة.
6. في نافذة B / C ، اضبط منزلقات الحد الأدنى والحد الأقصى حتى يمكن تمييز الخلايا العصبية بوضوح (الشكل 4 أ).
7. في نافذة العتبة ، تحقق من الخلفية الداكنة وعدم إعادة تعيين النطاق.
8. حرك منزلق الإطار لمراقبة حركة الخلايا العصبية وتغيرات شدتها، مع ملاحظة أي يجب استبعادها من التتبع، مثل التداخل مع الحيوانات الأخرى.
9. تحديد الخلايا العصبية للتتبع.
10. لكل ، اضبط مستوى العتبة بحيث تكون منطقة العتبة الحمراء فوق الخلية العصبية مرئية في كل إطار قبل التحفيز وأثناءه وبعده.
11. انقر على الخلية العصبية لتسجيل موقعها ومستوى العتبة.
12. كرر تعديل العتبة واختيارها لكل وخلية عصبية لتتبعها. انظر الشكل 4C للحصول على مثال جيد لمستوى العتبة والشكل 4D و E للحصول على أمثلة فوق العتبة وتحت العتبة. يشار إلى الخلايا العصبية المحددة مسبقا بواسطة صندوق صغير.
13. عند تحديد جميع الخلايا العصبية ، اضغط على مفتاح المسافة لبدء التتبع.
    ملاحظة: للحصول على أمثلة إضافية على NeuroTracker ، راجع المراجع السابقة ^4,19.
14. مراقبة عملية التتبع لكل ، وإجراء أي تصحيحات ضرورية.
15. إذا توقف NeuroTracker مؤقتا ، فقد فقد الخلايا العصبية. أعد النقر على الخلية العصبية ، واضبط مستوى العتبة حسب الحاجة.
16. إذا قفز مربع التكامل إلى آخر قريب أو بنية غير عصبية ، فاضغط على مفتاح المسافة للتوقف مؤقتا ، وحرك شريط التمرير مرة أخرى إلى الإطار الخاطئ الأول ، وأعد النقر فوق موقع الخلية العصبية الصحيح.

9. استكشاف البيانات والتصور

ملاحظة: يتم استخدام البرنامج النصي لتحليل MATLAB لمعالجة البيانات والتصور ولإنشاء ملفات PDF موجزة لكل تحليل.

1. قم بتشغيل ملف "NeuroTrackerSummary_pdf.m" في MATLAB ، وحدد المجلد الذي يحتوي على ملفات نصية لبيانات NeuroTracker.
2. انتظر حتى يتم إنتاج ملف PDF موجز ، مما يسمح بالتحقق من عملية التتبع (الشكل 5). يتم تحديد الحيوانات برقم (الشكل 5 أ) ، ويمكن عرض الاستجابات العصبية من كل والتجربة لتقييم تباين السكان (الشكل 5 ب).
3. استخدم الوظيفة "databrowse.m" لاستكشاف البيانات العصبية ، على سبيل المثال ، التجميع حسب رقم التجربة (الشكل 5C) ، حسب رقم الحيوان (الشكل 5D) ، حسب نمط التحفيز ، أو حسب فئة أخرى.

النتائج

نقدم العديد من الأمثلة على أنماط التحفيز التي تقيم الظواهر العصبية المختلفة ، بما في ذلك التثبيط الزمني والتكيف وإزالة التثبيط. التثبيط الزمني هو قمع مؤقت للاستجابة العصبية لعرض التحفيز الثاني الذي يحدث بعد وقت قصير من العرض الأولي¹⁴. لاختبار هذه الظاهرة ، في تجربة ا...

Discussion

في هذا البروتوكول ، نصف نظام الفحص المجهري المفتوح الوصول لتقييم ظواهر النشاط العصبي باستخدام التسليم الدقيق زمنيا لأنماط التحفيز المختلفة. توفر منصة الموائع الدقيقة محفزات قابلة للتكرار مع إبقاء عشرات الحيوانات في مجال رؤية المجهر. يسمح عدد قليل من حزم برامج الفحص المجهري التجاري بالب?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacterial strains
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	Cat# OP50
Experimental models: Organisms/strains
C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons	Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work	NZ1091, for example
Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies
2,3-Butanedione	Sigma-Aldrich	Cat# B85307	diacetyl, example chemical stimulus
Calcium chloride, CaCl2	Sigma-Aldrich	Cat# C3881
Fluorescein, Sodium salt	Sigma-Aldrich	Cat# F6377
Glass water repellant	Rain-X	Cat #800002250	glass hydrophobic treatment (single-use)
Magnesium chloride, MgCl2	Sigma-Aldrich	Cat# M2393
Nematode Growth Medium (NGM) agar	Genesee	Cat #: 20-273NGM
Petri dishes (60 mm)	Tritech	Cat #T3305
Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184	Dow Chemical	Cat# 1673921
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	Cat# P5655
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	Cat# P8281
Sodium chloride, NaCl	Sigma-Aldrich	Cat# S7653
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS)	Gelest	CAS# 78560-45-9	glass hydrophobic treatment (durable)
Software and algorithms
Arduino IDE	Arduino	https://www.arduino.cc/en/software
ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Micro-manager	Micro-manager	https://micro-manager.org/
Microscope control software	Albrecht Lab	https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl
Neurotracker data analysis software	Albrecht Lab	https://github.com/albrechtLab/Neurotracker
Automated Microscope and Stimulation System
Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar)	Zeiss	Cat #491237-0012-000
Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator	Excelitas	Cat #XYLIS
Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera	Hamamatsu	Cat #C11440-22CU
Arduino nano	Arduino	Cat #A000005
3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12)	Parker	Cat #LQX12-3W24FF48-000	Valve 1: Control
2-way normally-closed (NC) Pinch Valve	Bio-Chem Valve Inc	Cat #075P2-S432	Valve 2: Outflow
3-way Pinch Valve	NResearch	Cat #161P091	Valve 3: Stimulus selection
Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm)	Mightex	Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2
ValveLink 8.2 digital/manual valve controller	AutoMate Scientific	Cat #01-18
Wires and connectors	various	See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021)
Microfluidic Device Preparation
Dremel variable speed rotary cutter 4000	Dremel	Cat #F0134000AB	Set speed to 5k RPM for cutting glass
Dremel drill press rotary tool workstation	Dremel	Cat #220-01
Diamond drill bit	Dremel	Cat #7134
Glass slide, 1 mm thick	VWR	Cat #75799-268
Glass scribe (Diamond scriber)	Ted Pella	Cat #54468
Luer 3-way stopcock	Cole-Parmer	Cat #EW-30600-07
Luer 23 G blunt needle	VWR	Cat #89134-100
Microfluidic device	Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article	N/A
Microfluidic device clamp	Warner Instruments (or machine shop)	P-2
Microfluidic tubing, 0.02″ ID	Cole-Parmer	Cat #EW-06419-01
Tube 19 G, 0.5″	New England Small Tube	Cat #NE-1027-12