Автоматизированная мультимодальная стимуляция и одновременная запись нейронов от нескольких мелких организмов

Резюме

Представлен метод гибкой химической и мультимодальной стимуляции и регистрации одновременной нейронной активности многих червей Caenorhabditis elegans . Этот метод использует микрофлюидику, аппаратное и программное обеспечение с открытым исходным кодом, а также контролируемый автоматизированный анализ данных для измерения нейронных явлений, таких как адаптация, временное торможение и перекрестные помехи стимула.

Аннотация

Флуоресцентные генетически кодируемые кальциевые индикаторы внесли большой вклад в наше понимание нейронной динамики от уровня отдельных нейронов до целых мозговых цепей. Однако нейронные реакции могут варьироваться в зависимости от предыдущего опыта, внутренних состояний или стохастических факторов, что порождает потребность в методах, которые могут оценивать нейронную функцию у многих людей одновременно. В то время как большинство методов регистрации исследуют одно животное за раз, мы описываем использование широкопольной микроскопии для масштабирования нейронных записей до десятков Caenorhabditis elegans или других организмов субмиллиметрового масштаба одновременно. Аппаратное и программное обеспечение с открытым исходным кодом обеспечивает большую гибкость при программировании полностью автоматизированных экспериментов, которые контролируют интенсивность и время различных типов стимулов, включая химические, оптические, механические, тепловые и электромагнитные стимулы. В частности, микрофлюидные проточные устройства обеспечивают точный, воспроизводимый и количественный контроль хемосенсорных стимулов с временным разрешением менее секунды. Затем полуавтоматический конвейер анализа данных NeuroTracker извлекает индивидуальные и общепопуляционные нейронные ответы, чтобы выявить функциональные изменения в нервной возбудимости и динамике. В этой статье представлены примеры измерения нейрональной адаптации, временного торможения и перекрестных помех стимулов. Эти методы повышают точность и повторяемость стимуляции, позволяют исследовать изменчивость популяции и могут быть обобщены на другие динамические флуоресцентные сигналы в небольших биосистемах от клеток и органоидов до целых организмов и растений.

Введение

Методы визуализации кальция позволили неинвазивно регистрировать нейронную динамику in vivo в режиме реального времени с использованием флуоресцентной микроскопии и генетически кодируемых кальциевых индикаторов, экспрессируемых в клетках-мишенях ^1,2,3. Эти датчики обычно используют зеленый флуоресцентный белок (GFP), такой как семейство пептидов GFP-кальмодулин-M13 (GCaMP), для увеличения интенсивности флуоресценции при активации нейронов и повышении внутриклеточного уровня кальция. Визуализация кальция была особенно мощной у нематоды C. elegans для изучения того, как функционируют нейроны и нейронные цепи у живых, ведущих себя животных 4,5,6,7,8,9,10, поскольку их прозрачная природа означает, что для оптического доступа не требуется хирургического процесса, а промоторы генов, специфичные для клеток^, нацелены на экспрессию в интересующие клетки. В этих методах часто используются микрофлюидные устройства, которые обеспечивают точно контролируемую среду для изучения биологических, химических и физических явлений в небольшом физическом масштабе^11,12. Микрофлюидные устройства изобилуют для измерения нейронной активности, с новыми конструкциями, постоянно разрабатываемыми, и они легко изготавливаются в исследовательской лаборатории. Однако многие конструкции ловят по одному животному за раз, ограничивая экспериментальную пропускную способность ^7,9,13. Нейронные реакции часто существенно различаются у разных животных из-за различий в предыдущем опыте, внутренних состояниях, таких как стресс или голод, или стохастических факторах, таких как уровни экспрессии генов. Эти различия устанавливают потребность в методах, которые могут одновременно стимулировать и наблюдать за многими животными и извлекать информацию из особей⁴.

Кроме того, некоторые нейромодулирующие явления становятся очевидными только при определенных условиях стимуляции, таких как временное торможение¹⁴, которое относится к кратковременному подавлению реакций, когда стимуляция происходит в быстрой последовательности. Для этой цели электрофизиологические системы могут управлять нейронной активностью в широком пространстве стимулов, модулируя, например, электрический импульсный ток, напряжение, частоту, форму волны, рабочий цикл и время периодических поездов стимулов. Косвенная стимуляция естественно обнаруженными стимулами или оптогенетическими системами выиграет от аналогичной широты механизмов контроля. В настоящее время многие естественные стимулы представлены простым способом «включения-выключения», такими как представление и удаление запаха, с использованием коммерческих систем, которые медленно добавляли гибкость. Тем не менее, недорогие микроконтроллеры теперь могут автоматизировать доставку нескольких типов стимулов таким образом, чтобы их можно было настроить в соответствии с потребностями исследователей. В сочетании с микрофлюидикой эти системы достигли цели увеличения экспериментальной пропускной способности и гибкости, что позволило одновременно измерять нейронные реакции на различные точные стимулы у многих животных ^4,6. Мультимодальная стимуляция может быть использована для дальнейшего опроса нейронных схем, например, путем мониторинга изменений нервной возбудимости при последовательной стимуляции до, во время и после ортогонального возмущения, такого как воздействие лекарственного средства⁴. Преимущества недорогих открытых микроскопических систем очевидны для продвижения научных исследований, но на практике потребность в поиске деталей, изготовлении и проверке производительности может препятствовать внедрению этих методов.

Этот протокол направлен на смягчение некоторых из этих технических проблем. В то время как предыдущие протоколы были сосредоточены на использовании микрофлюидных устройств и базовой стимуляции 9,15,17, мы описываем здесь построение и использование гибкой, автоматизированной^, мультимодальной системы доставки стимулов для нейронной визуализации у C. elegans или других малых организмов с использованием ранее описанных микрофлюидных устройств 4. Система с открытым исходным кодом запрограммирована с помощью простых текстовых файлов для определения экспериментов, а программа анализа данных NeuroTracker полуавтоматически извлекает данные о нейронной активности из видео микроскопа. Мы демонстрируем эту систему на примерах оценки временного торможения, растормаживания и перекрестных помех стимулов с использованием хемосенсорного нейрона AWA, который деполяризуется в ответ на различные запахи пищи или в ответ на свет при экспрессии оптогенетических светочувствительных ионных каналов ^5,6.

протокол

1. Оборудование для нейронной визуализации

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Лоулер и Альбрехт¹⁵ для получения подробных инструкций по созданию системы визуализации и стимуляции, которая контролирует время освещения микроскопа, получение изображения и доставку стимула (рис. 1). Недорогой контроллер стимулов Arduino Nano приводит в действие жидкостные клапаны с помощью цифровых сигналов на контроллер клапана и управляет оптогенетическим освещением с помощью аналоговых сигналов напряжения на контроллер светодиодов. Другими раздражителями, такими как вибрационные двигатели и тепловые нагреватели, можно управлять с помощью цифровых или аналоговых сигналов. Контроллер стимула синхронизирует стимуляцию и запись изображения с помощью сигналов камеры, как указано в программном обеспечении для управления микроскопом Micro-Manager с открытым исходным кодом (μManager)¹⁶. Подробную информацию обо всех материалах, реагентах, оборудовании и организмах, используемых в этом протоколе, см. в таблице материалов .

1. Настройка оборудования для нейронной визуализации, включая эпифлуоресцентный микроскоп с оптикой GFP, sCMOS-камеру с выходным сигналом цифровой экспозиции и контроллер^{стимула 15}.
2. Подключите контроллер стимула к нужным системам с помощью цифровых или аналоговых сигналов. Для примеров, представленных ниже, используются следующие системы:
   1. Используйте контроллер клапана для химической стимуляции. Подсоедините контроллер клапана к жидкостному соленоиду или пережимным клапанам (Рисунок 1)¹⁵.
   2. Используйте красный светодиод с длиной волны 615 нм и контроллер для оптогенетической стимуляции, установленный над столиком микроскопа.
3. Настройте компьютер с программным обеспечением для управления микроскопом, создайте предустановку конфигурации с настройками оборудования и обеспечьте правильную работу управления стимулом¹⁵.

2. Изготовление микрофлюидных устройств

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Lagoy et ^al.17 для получения подробной информации о получении или изготовлении мастер-форм, а также о производстве, использовании и очистке микрофлюидных устройств. Эти шаги кратко изложены ниже.

1. Получите или изготовьте мастер-форму, используя файл микрофлюидного дизайна, предоставленный (albrechtlab.github.io/microfluidics)¹⁷. Для молодых взрослых C. elegans убедитесь, что высота канала составляет 55-70 мкм.
2. Смешайте основание PDMS и отвердитель в соотношении 10:1 по весу и тщательно перемешайте с пипетками для переноса.
3. Дегазируйте в течение 30-60 мин в вакуумном эксикаторе до исчезновения пузырьков.
4. Поместите мастер-форму в большую (диаметром 150 мм) чашку Петри и залейте дегазированный PDMS на глубину 4-5 мм (~100 г). Осмотрите и удалите пыль или пузырьки с помощью пипетки для переноса.
5. Выпекать при температуре 65 °C на ровной полке духовки от 3 часов до ночи.
6. После отверждения используйте скальпель, чтобы вырезать PDMS из формы, и прямое лезвие бритвы, чтобы отделить устройства.
7. Пробейте входное и выходное отверстия с помощью дермального перфоратора диаметром 1 мм и очистите их dH 2 O, этанолом и снова dH₂O. Высушите устройство в воздушном потоке (см. рисунок 2A).
8. Очистите обе стороны устройства PDMS клейкой лентой, удалив пыль или мусор.
9. Подготовьте предметные стекла для завершения микрофлюидного устройства, как описано¹⁷. Просверлите входные отверстия в верхнем предметном стекле с помощью алмазного долота и сделайте нижнее стекло гидрофобным, подвергая его воздействию паров TFOCS или применяя водоотталкивающую обработку стекла (рис. 2B).
10. Соберите сэндвич устройства glass-PDMS в зажим (рис. 2C).

3. Подготовка животных

1. Получение или создание животных с генетически кодируемыми кальциевыми показателями, экспрессируемыми в интересующих нейронах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Например, строка NZ1091 (kyIs587 [gpa-6p::GCaMP2.2b; unc-122p::d sRed]; kyIs5662 [odr-7p::Chrimson:SL2:mCherry; elt-2p::mCherry]) экспрессирует GCaMP и красный светочувствительный катионный канал Chrimson в паре^{сенсорных нейронов AWA 6}. Оба трансгена интегрированы в геном для стабильной экспрессии у каждого животного.
2. За день до эксперимента поместите не менее 20 личинок C. elegans L4 стадии за эксперимент на агаровую пластину среды для роста нематод (NGM), засеянную газоном OP50 E. coli. При поддержании при температуре 20 ° C это синхронизирует животных дикого типа на стадии молодого взрослого человека на следующий день.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для массивных трансгенов отбирайте животных с помощью флуоресцентного стереоскопа, чтобы обеспечить экспрессию трансгенов у выбранных животных.

4. Приготовление раствора

1. Приготовьте 1x S базальный буфер (100 мМ NaCl и 0,05 М КПО₄, рН 6,0) из 10-кратного исходного раствора.
2. Приготовьте 1 мМ буфер тетрамизола, разбавив 1 М бульона в 1x S базали. Используйте этот паралитический буфер для подготовки всех раздражителей. В эксперименте обычно используется около 150 мл.
3. Добавьте 0,1-1 мкг/мл флуоресцеина в «контрольные» буферные резервуары для визуализации потока.
4. Создавайте стимульные растворы путем последовательного разбавления до желаемой конечной концентрации. Например, создайте разбавление диацетилаттрактанта 10−⁷ , сначала создав запас 10⁻³ .
   ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшое количество флуоресцеина (0,1–1 мкг/мл) может быть добавлено к стимульному или буферному раствору для проверки времени стимула, но концентрация должна быть минимальной, чтобы избежать артефактов в нейронной флуоресценции.

5. Подготовка микрофлюидного устройства

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Reilly et ^al.9 для видеопротокола, показывающего генерацию резервуара, настройку устройства и загрузку животных. См. также Lagoy et ^al.17 письменный протокол, включающий множество полезных советов.

1. Подготовьте три или более резервуаров для жидкости. Для каждого из них прикрепите резервуар для шприца объемом 30 мл или 60 мл, шприц для заправки объемом 3 мл и заглушку иглы к трехходовому клапану Луера (рис. 2D). Подсоедините иглу к трубке с микроотверстием, снабженной металлической трубкой на конце. Пометьте резервуары, установите их на стойку, прикрепленную к кольцевой подставке, и заполните их соответствующими буферными или стимулирующими жидкостями (рис. 2E).
2. Дегазируйте собранное микрофлюидное устройство в вакуумном эксикаторе в течение ~1 ч.
3. Наполните и удалите пузырьки воздуха из трубки резервуара с помощью заправочного шприца. Заполните выпускную трубку буфером.
4. Извлеките микрофлюидное устройство из пылесоса, быстро вставьте выпускную трубку и впрыскивайте жидкость через устройство до тех пор, пока из одного из входных отверстий не выйдет капля.
5. На этом входном отверстии используйте соединение¹⁷ «капля-капля», чтобы вставить соответствующую жидкостную впускную трубку (фиг.2F). Убедитесь, что капли жидкости присутствуют как на впускной трубке, так и на отверстии в порту устройства, чтобы избежать образования пузырьков.
6. Впрысните больше жидкости из выходного отверстия, подсоедините следующую впускную трубку и повторяйте, пока все впускные отверстия не будут заполнены. Вставьте прочный блокирующий штифт во все неиспользуемые входные отверстия и загрузочное отверстие червяка.
7. Инициируйте поток, открыв впускной и выпускной клапаны Luer. Осмотрите устройство на наличие утечек на входах и стеклянном основании. Осмотрите устройство на наличие пузырьков в проточных каналах или входных отверстиях с помощью программного обеспечения для захвата изображений микроскопа в режиме реального времени.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если пузырьки присутствуют, подождите, пока они впитаются в материал PDMS.

6. Загрузка животных

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Lagoy et ^al.17.

1. Перенесите молодых взрослых животных на незасеянную пластину с агаром NGM с помощью «кирки» с проволочным наконечником.
2. Залейте пластину примерно 5 мл 1x S базального буфера так, чтобы животные плавали.
3. Наберите червей в загрузочный шприц (шприц объемом 1 мл или 3 мл с прикрепленной трубкой, предварительно заполненной 1x S Basal).
   1. Используя стереоскоп, переместите конец трубки ниже поверхности жидкости одной рукой к каждому желаемому животному и втяните его в трубку с помощью шприца, удерживаемого в другой руке.
   2. Втягивайте червей только в трубку, а не в шприц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трубка обычно вмещает всего около 100 мкл. Животные могут быть изгнаны на локальную территорию, а затем снова втянуты в трубку с небольшим объемом.
4. Закройте выходную линию, снимите штифт червячной загрузки и подсоедините шприц для загрузки червяка к устройству с помощью соединения «капля-капля».
5. Осторожно выведите животных на арену, установите буферный поток и дайте до 1 ч для иммобилизации тетрамизолом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В период иммобилизации следите за тем, чтобы на арену поступала только буферная жидкость. Стимульные и контрольные резервуары могут быть отключены в течение этого периода, но откройте их и проверьте правильность потока перед запуском испытаний стимуляции.

7. Автоматическая стимуляция и запись нейронов

1. Создайте текстовый файл определения стимула под названием «User Defined Acquisition Settings.txt» с текстовым редактором (например, Блокнотом), содержащим настройки стимуляции для автоматического получения изображения (см. примеры на рисунке 3). Настройки разделены на два раздела:
   1. Настройки сбора данных микроскопа: Определите тип эксперимента (одностимулный или многошаблонный), время воздействия и возбуждения, продолжительность и интервалы исследования, а также сохраните каталог.
   2. Настройки стимуляции: Определите параметры управления стимулом. «Команда стимуляции» определяет действия, происходящие на определенных видеокадрах с синтаксисом <буквенный код><номер кадра>, где буквенные коды: A = клапан1, B = клапан2, C = клапан3, L = светодиодный индикатор; Кроме того, верхний регистр = вкл., а нижний регистр = выкл. Интенсивность светодиода устанавливается буквенным кодом «i» и значением от 0 (выключено) до 255 (максимальная яркость).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значение интенсивности светодиода от 0 до 255 устанавливает выходное аналоговое напряжение от 0 В до 5 В. Используемый здесь контроллер тока имеет линейное масштабирование интенсивности, а другие должны быть откалиброваны с помощью измерителя мощности света.
      1. Для эксперимента с одним стимулом только с одной повторяющейся командой стимуляции используйте формат, показанный на рисунке 3A.
      2. Для эксперимента с несколькими шаблонами с несколькими командами стимуляции используйте формат, показанный на рисунке 3B. Включите «Последовательность шаблонов» цифр, представляющих порядок шаблонов стимулов. Для каждого паттерна введите команду стимуляции в отдельной строке.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Псевдослучайная последовательность или m-последовательность могут быть полезны для исследования зависимости от истории стимулов.
2. Запустите программное обеспечение для управления микроскопом. Убедитесь, что все входные отверстия жидкости открыты, поток находится в пределах арены так, как требуется (см. рис. 2H), а интересующие нейроны находятся в фокусе в живом окне.
3. Закройте живое окно и запустите сценарий «MultiPattern_RunScript.bsh» в программном обеспечении.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно провести тестовый эксперимент без животных, чтобы проверить надлежащий поток и стимуляцию. Замена различной концентрации флуоресцеина для каждой стимульной жидкости может помочь визуализировать и задокументировать новые стимульные паттерны.
4. После экспериментов разберите микрофлюидное устройство и промойте водой все поверхности, трубки и резервуары.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все компоненты можно использовать десятки раз, если содержать их в чистоте. Убедитесь, что резервуары, трубки и микрофлюидные устройства остаются влажными или полностью высушенными в воздушном потоке, чтобы избежать кристаллизации соли, которая может засориться и ее трудно удалить. Устройства можно хранить в этаноле для стерилизации, но перед повторным использованием они должны быть полностью высушены (>1 ч при 65 °C)¹⁷.

8. Анализ данных с помощью NeuroTracker

ПРИМЕЧАНИЕ: NeuroTracker 4,18,19 — это программный плагин ImageJ/FIJI²⁰ для отслеживания интенсивности флуоресценции нескольких нейронов и животных^, даже когда они движутся во время испытаний. Этот плагин сохраняет данные в виде текстовых файлов с положением каждого нейрона и интенсивностью флуоресценции (F) с коррекцией фона. Данные флуоресценции нормализуются к исходной флуоресценции (F 0), например, среднему значению за несколько секунд до стимуляции, как Δ F/F 0 = (F -F 0)/F ₀, которое может быть усреднено по популяциям.

1. Установите скрипты NeuroTracker в соответствии с инструкциями (github.com/albrechtLab/Neurotracker).
2. Запустите NeuroTracker, нажав на Плагины | Отслеживание | НейроТрекер.
3. Выберите папку, содержащую файл . TIF видеофайлы для отслеживания, и выберите нужные настройки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если необходимо отслеживать только подмножество видеофайлов, выберите числовой диапазон файлов для анализа в командной строке. Настройки отслеживания по умолчанию подходят для неподвижных животных с разрешением 250 пикс/мм. Отрегулируйте параметры пропорционально для других разрешений. Дополнительную информацию о настройках см. в Руководстве^{пользователя 19} .
4. Установите порог интенсивности таким образом, чтобы нейроны были видны для отбора (рис. 4).
5. Откройте окна управления « Яркость/контрастность (B/C) » и « Порог » с помощью кнопки «Изображение» | Отрегулируйте меню.
6. В окне B/C отрегулируйте ползунки « Минимум » и «Максимум » до тех пор, пока нейроны не станут четко различимы (рис. 4A).
7. В окне «Порог » установите флажки « Темный фон » и «Не сбрасывать диапазон».
8. Сдвиньте ползунок кадра, чтобы наблюдать за движением и изменениями интенсивности нейронов, отмечая любых животных, которых следует исключить из отслеживания, например, из-за перекрытия с другими животными.
9. Определите нейроны для отслеживания.
10. Для каждого животного отрегулируйте пороговый уровень таким образом, чтобы красная пороговая область над нейроном была видна в каждом кадре до, во время и после стимуляции.
11. Нажмите на нейрон, чтобы записать его положение и пороговый уровень.
12. Повторите настройку порога и выбор для каждого животного и нейрона для отслеживания. Хороший пример порогового уровня см. на рисунке 4C, а на рисунке 4D,E - примеры превышения и понижения порогового значения. Ранее выбранные нейроны обозначаются небольшим прямоугольником.
13. Когда все нейроны будут выбраны, нажмите пробел , чтобы начать отслеживание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные примеры NeuroTracker см. в предыдущих ссылках ^4,19.
14. Следите за процессом отслеживания каждого животного и вносите необходимые коррективы.
15. Если NeuroTracker приостанавливается, он потерял нейрон. Повторно нажмите на нейрон, регулируя пороговый уровень по мере необходимости.
16. Если поле интеграции переходит к другому соседнему животному или ненейрональной структуре, нажмите пробел , чтобы сделать паузу, переместите ползунок обратно в первый ошибочный кадр и повторно щелкните правильное местоположение нейрона.

9. Исследование и визуализация данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Сценарий анализа MATLAB используется для обработки и визуализации данных, а также для создания сводных PDF-файлов для каждого анализа.

1. Запустите файл «NeuroTrackerSummary_pdf.m» в MATLAB и выберите папку, содержащую текстовые файлы данных NeuroTracker.
2. Дождитесь создания сводного PDF-файла, позволяющего проверить процесс отслеживания (рисунок 5). Животные идентифицируются по номеру (рис. 5A), и нейронные реакции каждого животного и испытания могут быть просмотрены для оценки изменчивости популяции (рис. 5B).
3. Используйте функцию «databrowse.m» для изучения нейронных данных, например, группируя по номеру испытания (рис. 5C), по количеству животных (рис. 5D), по паттерну стимуляции или по другой категории.

Результаты

Мы представляем несколько примеров стимульных паттернов, которые оценивают различные нейронные явления, включая временное торможение, адаптацию и расторможенность. Временное торможение - это кратковременное подавление нейронного ответа на второе предъявление стимула, прои...

Обсуждение

В этом протоколе мы описываем систему микроскопии открытого доступа для оценки явлений нейронной активности с использованием точной доставки различных стимульных паттернов. Микрофлюидная платформа обеспечивает повторяющиеся стимулы, удерживая десятки животных в поле зрения микрос...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacterial strains
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	Cat# OP50
Experimental models: Organisms/strains
C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons	Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work	NZ1091, for example
Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies
2,3-Butanedione	Sigma-Aldrich	Cat# B85307	diacetyl, example chemical stimulus
Calcium chloride, CaCl2	Sigma-Aldrich	Cat# C3881
Fluorescein, Sodium salt	Sigma-Aldrich	Cat# F6377
Glass water repellant	Rain-X	Cat #800002250	glass hydrophobic treatment (single-use)
Magnesium chloride, MgCl2	Sigma-Aldrich	Cat# M2393
Nematode Growth Medium (NGM) agar	Genesee	Cat #: 20-273NGM
Petri dishes (60 mm)	Tritech	Cat #T3305
Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184	Dow Chemical	Cat# 1673921
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	Cat# P5655
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	Cat# P8281
Sodium chloride, NaCl	Sigma-Aldrich	Cat# S7653
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS)	Gelest	CAS# 78560-45-9	glass hydrophobic treatment (durable)
Software and algorithms
Arduino IDE	Arduino	https://www.arduino.cc/en/software
ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Micro-manager	Micro-manager	https://micro-manager.org/
Microscope control software	Albrecht Lab	https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl
Neurotracker data analysis software	Albrecht Lab	https://github.com/albrechtLab/Neurotracker
Automated Microscope and Stimulation System
Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar)	Zeiss	Cat #491237-0012-000
Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator	Excelitas	Cat #XYLIS
Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera	Hamamatsu	Cat #C11440-22CU
Arduino nano	Arduino	Cat #A000005
3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12)	Parker	Cat #LQX12-3W24FF48-000	Valve 1: Control
2-way normally-closed (NC) Pinch Valve	Bio-Chem Valve Inc	Cat #075P2-S432	Valve 2: Outflow
3-way Pinch Valve	NResearch	Cat #161P091	Valve 3: Stimulus selection
Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm)	Mightex	Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2
ValveLink 8.2 digital/manual valve controller	AutoMate Scientific	Cat #01-18
Wires and connectors	various	See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021)
Microfluidic Device Preparation
Dremel variable speed rotary cutter 4000	Dremel	Cat #F0134000AB	Set speed to 5k RPM for cutting glass
Dremel drill press rotary tool workstation	Dremel	Cat #220-01
Diamond drill bit	Dremel	Cat #7134
Glass slide, 1 mm thick	VWR	Cat #75799-268
Glass scribe (Diamond scriber)	Ted Pella	Cat #54468
Luer 3-way stopcock	Cole-Parmer	Cat #EW-30600-07
Luer 23 G blunt needle	VWR	Cat #89134-100
Microfluidic device	Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article	N/A
Microfluidic device clamp	Warner Instruments (or machine shop)	P-2
Microfluidic tubing, 0.02″ ID	Cole-Parmer	Cat #EW-06419-01
Tube 19 G, 0.5″	New England Small Tube	Cat #NE-1027-12