Estimulación multimodal automatizada y registro neuronal simultáneo de múltiples organismos pequeños

Resumen

Presentamos un método para la estimulación química flexible y multimodal y el registro de la actividad neuronal simultánea de muchos gusanos Caenorhabditis elegans . Este método utiliza microfluídica, hardware y software de código abierto y análisis de datos automatizados supervisados para permitir la medición de fenómenos neuronales como la adaptación, la inhibición temporal y la diafonía de estímulos.

Resumen

Los indicadores fluorescentes de calcio codificados genéticamente han contribuido en gran medida a nuestra comprensión de la dinámica neuronal desde el nivel de las neuronas individuales hasta los circuitos cerebrales completos. Sin embargo, las respuestas neuronales pueden variar debido a la experiencia previa, los estados internos o los factores estocásticos, lo que genera la necesidad de métodos que puedan evaluar la función neuronal en muchos individuos a la vez. Mientras que la mayoría de las técnicas de registro examinan un solo animal a la vez, describimos el uso de microscopía de campo amplio para ampliar las grabaciones neuronales a docenas de Caenorhabditis elegans u otros organismos a escala submilimétrica a la vez. El hardware y el software de código abierto permiten una gran flexibilidad en la programación de experimentos totalmente automatizados que controlan la intensidad y el tiempo de varios tipos de estímulos, incluidos los estímulos químicos, ópticos, mecánicos, térmicos y electromagnéticos. En particular, los dispositivos de flujo microfluídico proporcionan un control preciso, repetible y cuantitativo de los estímulos quimiosensoriales con una resolución de tiempo inferior a un segundo. La tubería de análisis de datos semiautomatizada NeuroTracker extrae respuestas neuronales individuales y de toda la población para descubrir cambios funcionales en la excitabilidad y dinámica neuronal. Este artículo presenta ejemplos de medición de la adaptación neuronal, la inhibición temporal y la diafonía de estímulos. Estas técnicas aumentan la precisión y la repetibilidad de la estimulación, permiten la exploración de la variabilidad de la población y son generalizables a otras señales fluorescentes dinámicas en pequeños biosistemas, desde células y organoides hasta organismos completos y plantas.

Introducción

Las técnicas de imagen de calcio han permitido el registro no invasivo de la dinámica neuronal in vivo en tiempo real utilizando microscopía de fluorescencia e indicadores de calcio codificados genéticamente expresados en células diana ^1,2,3. Estos sensores suelen utilizar una proteína fluorescente verde (GFP), como la familia de péptidos GFP-calmodulina-M13 (GCaMP), para aumentar la intensidad de fluorescencia tras la activación neuronal y los niveles elevados de calcio intracelular. Las imágenes de calcio han sido especialmente poderosas en el nematodo C. elegans para examinar cómo funcionan las neuronas y los circuitos neuronales en animales vivos, comportándose 4,5,6,7,8,9,10, ya que su naturaleza transparente significa que no se requiere ningún proceso quirúrgico para el acceso óptico^, y los promotores de genes específicos de células dirigen la expresión a las células de interés. Estas técnicas a menudo hacen uso de dispositivos microfluídicos, que proporcionan ambientes controlados con precisión para estudiar fenómenos biológicos, químicos y físicos a pequeña escala física^11,12. Los dispositivos microfluídicos abundan para medir la actividad neuronal, con nuevos diseños continuamente en desarrollo, y se fabrican fácilmente en el laboratorio de investigación. Sin embargo, muchos diseños atrapan a un solo animal a la vez, limitando el rendimiento experimental ^7,9,13. Las respuestas neuronales a menudo varían sustancialmente entre los animales debido a diferencias en la experiencia previa, estados internos como el estrés o el hambre, o factores estocásticos como los niveles de expresión génica. Estas diferencias establecen la necesidad de métodos que puedan estimular y observar simultáneamente muchos animales y extraer información de los individuos⁴.

Además, ciertos fenómenos neuromoduladores se hacen evidentes sólo bajo condiciones específicas de estimulación, como la inhibición temporal¹⁴, que se refiere a la breve supresión de las respuestas cuando la estimulación ocurre en rápida sucesión. Los sistemas electrofisiológicos pueden impulsar la actividad neuronal a través de un amplio espacio de estímulo para este propósito, modulando, por ejemplo, la corriente de pulso eléctrico, el voltaje, la frecuencia, la forma de onda, el ciclo de trabajo y la sincronización de los trenes de estímulos periódicos. La estimulación indirecta por estímulos detectados naturalmente o sistemas optogenéticos se beneficiaría de una amplitud similar de mecanismos de control. Actualmente, muchos estímulos naturales se presentan de una manera simple "on-off", como la presentación y eliminación de olores, utilizando sistemas comerciales que han tardado en agregar flexibilidad. Sin embargo, los microcontroladores de bajo costo ahora pueden automatizar la entrega de varios tipos de estímulos de una manera que se puede personalizar según las necesidades de los investigadores. Combinados con la microfluídica, estos sistemas han logrado el objetivo de aumentar el rendimiento experimental y la flexibilidad, permitiendo que las respuestas neuronales a una variedad de estímulos precisos se midan simultáneamente en muchos animales ^4,6. La estimulación multimodal se puede utilizar para interrogar aún más los circuitos neuronales, por ejemplo, mediante el monitoreo de los cambios en la excitabilidad neuronal cuando se estimula consistentemente antes, durante y después de una perturbación ortogonal como la exposición a drogas⁴. Los beneficios de los sistemas de microscopía abiertos y económicos son claros para avanzar en la investigación científica, pero en la práctica, la necesidad de abastecimiento de piezas, construcción y validación del rendimiento puede impedir la adopción de estas técnicas.

Este protocolo tiene como objetivo aliviar algunos de estos desafíos técnicos. Mientras que los protocolos anteriores se han centrado en el uso de dispositivos microfluídicos y la estimulación básica 9,15,17, describimos aquí la construcción y el uso de un sistema de administración de estímulos flexible^, automatizado y multimodal para imágenes neuronales en C. elegans u otros organismos pequeños utilizando dispositivos microfluídicos previamente descritos⁴. El sistema de código abierto está programado a través de archivos de texto simples para definir los experimentos, y el programa de análisis de datos NeuroTracker extrae semiautomáticamente los datos de actividad neuronal de los videos del microscopio. Demostramos este sistema con ejemplos de evaluación de la inhibición temporal, la desinhibición y la diafonía de estímulos utilizando la neurona quimiosensorial AWA, que se despolariza en respuesta a diferentes olores de alimentos o en respuesta a la luz al expresar canales iónicos optogenéticos sensibles a la luz ^5,6.

Protocolo

1. Equipo de imagen neuronal

NOTA: Consulte Lawler y Albrecht¹⁵ para obtener instrucciones detalladas sobre la construcción del sistema de imágenes y estimulación, que controla el tiempo de iluminación del microscopio, la adquisición de imágenes y la entrega de estímulos (Figura 1). Un controlador de estímulo Arduino Nano de bajo costo acciona las válvulas fluídicas a través de señales digitales a un controlador de válvula y controla la iluminación optogenética a través de señales de voltaje analógicas a un controlador LED. Otros estímulos, como los motores de vibración y los calentadores térmicos, se pueden controlar mediante señales digitales o analógicas. El controlador de estímulo sincroniza la estimulación y la grabación de imágenes a través de señales de cámara, según lo especificado por el software de control de microscopio Micro-Manager (μManager) de código ^abierto16. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos, equipos y organismos utilizados en este protocolo.

1. Configure el equipo de imágenes neuronales, incluido un microscopio de epifluorescencia con óptica GFP, una cámara sCMOS con una señal de salida de exposición digital y un controlador de estímulo¹⁵.
2. Conecte el controlador de estímulo a los sistemas deseados a través de señales digitales o analógicas. Para los ejemplos que se presentan a continuación, se utilizan los siguientes sistemas:
   1. Use un controlador de válvula para la estimulación química. Conecte el controlador de la válvula al solenoide fluídico o a las válvulas de pellizco (Figura 1)¹⁵.
   2. Utilice un LED rojo de 615 nm y un controlador para la estimulación optogenética, montado sobre la etapa del microscopio.
3. Configure la computadora con el software de control del microscopio, cree un ajuste preestablecido de configuración con los ajustes del equipo y asegúrese de que el control de estímulo^{funcione correctamente 15}.

2. Fabricación de dispositivos microfluídicos

NOTA: Ver Lagoy et ^al.17 para información detallada sobre la obtención o fabricación de los moldes maestros y la producción, uso y limpieza de los dispositivos microfluídicos. Estos pasos se resumen a continuación.

1. Obtenga o fabrique un molde maestro utilizando el archivo de diseño microfluídico proporcionado (albrechtlab.github.io/microfluidics)¹⁷. Para adultos jóvenes C. elegans, asegúrese de que la altura del canal sea de 55-70 μm.
2. Combine la base PDMS y el agente de curado en una proporción de 10:1 en peso y mezcle bien con pipetas de transferencia.
3. Desgasificar durante 30-60 min en un desecador al vacío hasta que las burbujas desaparezcan.
4. Coloque el molde maestro en una placa de Petri grande (150 mm de diámetro) y vierta el PDMS desgasificado hasta una profundidad de 4-5 mm (~ 100 g). Inspeccione y elimine cualquier polvo o burbuja con una pipeta de transferencia.
5. Hornear a 65 °C en un estante de horno nivelado durante 3 h durante toda la noche.
6. Una vez curado, use un bisturí para cortar el PDMS del molde y una cuchilla de afeitar recta para separar los dispositivos.
7. Perfore los orificios de entrada y salida con un punzón dérmico de 1 mm y límpielos con dH 2 O, etanol y nuevamente condH₂O. Seque el dispositivo en una corriente de aire (consulte la figura 2A).
8. Limpie ambos lados del dispositivo PDMS con cinta adhesiva, eliminando cualquier polvo o suciedad.
9. Prepare los portaobjetos de vidrio para completar el dispositivo microfluídico como se describe¹⁷. Perfore los orificios de entrada en el portaobjetos superior con una broca de diamante y haga que el portaobjetos inferior sea hidrófobo mediante la exposición a vapores TFOCS o aplicando un tratamiento de vidrio repelente al agua (Figura 2B).
10. Ensamble el sándwich de dispositivo PDMS de vidrio en una abrazadera (Figura 2C).

3. Preparación animal

1. Obtener o crear animales con indicadores de calcio codificados genéticamente expresados en las neuronas de interés.
   NOTA: Por ejemplo, la línea NZ1091 (kyIs587 [gpa-6p::GCaMP2.2b; unc-122p::d sRed]; kyIs5662 [odr-7p::Chrimson:SL2:mCherry; elt-2p::mCherry]) expresa GCaMP y el canal catiónico sensible a la luz roja Chrimson en el par⁶ de neuronas sensoriales AWA. Ambos transgenes están integrados en el genoma para una expresión estable en cada animal.
2. Un día antes de la experimentación, coloque al menos 20 larvas L4 en estadio larvario C. elegans por experimento en una placa de agar del medio de crecimiento de nematodos (NGM) sembrada con un césped OP50 E. coli. Cuando se mantiene a 20 °C, esto sincronizará a los animales de tipo salvaje en la etapa adulta joven al día siguiente.
   NOTA: Para los transgenes de matriz, seleccione animales utilizando un estereoscopio de fluorescencia para garantizar la expresión transgénica en los animales elegidos.

4. Preparación de la solución

1. Preparar 1x tampón basal S (100 mM NaCl y 0,05 M KPO₄, pH 6,0) a partir de una solución madre 10x.
2. Preparar 1 mM de tampón tetramisol diluyendo 1 M de caldo en 1x S Basal. Utiliza este tampón paralítico para preparar todos los estímulos. Un experimento típicamente usa alrededor de 150 ml.
3. Agregue 0.1-1 μg / ml de fluoresceína a los depósitos de tampón de "control" para visualizar el flujo.
4. Crear soluciones de estímulo por dilución en serie a la concentración final deseada. Por ejemplo, cree una dilución 10−⁷ del atrayente de diacetilo creando primero una cepa 10⁻³ .
   NOTA: Se puede agregar una pequeña cantidad de fluoresceína (0.1–1 μg/mL) al estímulo o solución tampón para verificar el momento del estímulo, pero la concentración debe ser mínima para evitar artefactos en la fluorescencia neural.

5. Preparación del dispositivo microfluídico

NOTA: Consulte Reilly et ^al.9 para un protocolo de video que muestra la generación del reservorio, la configuración del dispositivo y la carga de los animales. Ver también Lagoy et ^al.17 para un protocolo escrito que incluye muchos consejos útiles.

1. Prepare tres o más depósitos de líquido. Para cada uno, conecte un depósito de jeringa de 30 ml o 60 ml, una jeringa de cebado de 3 ml y un talón de aguja a una válvula Luer de tres vías (Figura 2D). Conecte la aguja a un tubo de microorificio equipado con un tubo de metal en el extremo. Etiquete los depósitos, móntelos en un bastidor conectado a un soporte de anillo y llénelos con el tampón correspondiente o fluidos de estímulo (Figura 2E).
2. Desgasificar el dispositivo microfluídico ensamblado en un desecador de vacío durante ~ 1 h.
3. Llene y retire las burbujas de aire del tubo del depósito con la jeringa de cebado. Llene el tubo de salida con tampón.
4. Retire el dispositivo microfluídico de la aspiradora e inserte rápidamente el tubo de salida e inyecte el líquido a través del dispositivo hasta que surja una gota de una entrada.
5. En esta entrada, utilice una conexión "gota a gota"¹⁷ para insertar el tubo de entrada fluídico correspondiente (Figura 2F). Asegúrese de que haya gotas de líquido tanto en el tubo de entrada como en el orificio del puerto del dispositivo para evitar la introducción de una burbuja.
6. Inyecte más líquido de la salida, conecte el siguiente tubo de entrada y repita hasta que todas las entradas estén llenas. Inserte un pasador de bloqueo sólido en cualquier entrada no utilizada y en el puerto de carga del gusano.
7. Inicie el flujo abriendo las válvulas Luer de entrada y salida. Inspeccione el dispositivo en busca de fugas en las entradas y la base de vidrio. Inspeccione el dispositivo en busca de burbujas dentro de los canales de flujo o entradas utilizando el software de captura de imágenes de microscopio en modo en vivo.
   NOTA: Si hay burbujas, espere a que se absorban en el material PDMS.

6. Carga de animales

NOTA: Ver Lagoy et ^al.17.

1. Transfiera animales adultos jóvenes a una placa de agar NGM sin semillas usando un "pico" con punta de alambre.
2. Inunde la placa con aproximadamente 5 ml de tampón basal 1x S de modo que los animales estén nadando.
3. Extraiga los gusanos en una jeringa de carga (jeringa de 1 ml o 3 ml con tubo conectado que haya sido prellenado con 1x S Basal).
   1. Usando un estereoscopio, mueva el extremo del tubo debajo de la superficie del líquido con una mano hacia cada animal deseado, y tráigalo hacia el tubo usando la jeringa sostenida en la otra mano.
   2. Extraiga los gusanos solo en el tubo, no en la jeringa.
      NOTA: El tubo generalmente contiene solo alrededor de 100 μL. Los animales pueden ser expulsados a un área local y luego arrastrados nuevamente al tubo con un pequeño volumen.
4. Cierre la línea de salida, retire el pasador de carga del gusano y conecte la jeringa de carga del gusano al dispositivo mediante una conexión gota a gota.
5. Fluya suavemente a los animales hacia la arena, establezca un flujo amortiguador y permita hasta 1 h para la inmovilización por tetramisole.
   NOTA: Durante el período de inmovilización, asegúrese de que solo el líquido amortiguador ingrese a la arena. Los depósitos de estímulo y control se pueden apagar durante este período, pero ábralos y verifique el flujo correcto antes de ejecutar los ensayos de estimulación.

7. Estimulación automatizada y registro neuronal

1. Cree un archivo de texto de definición de estímulo llamado "Configuración de adquisición definida por el usuario.txt" con un editor de texto (por ejemplo, Bloc de notas) que contenga los ajustes de estimulación para la adquisición automatizada de imágenes (consulte los ejemplos de la Figura 3). La configuración se divide en dos secciones:
   1. Configuración de adquisición del microscopio: Defina el tipo de experimento (estímulo único o patrón múltiple), el tiempo de exposición y excitación, la duración y los intervalos de la prueba, y guarde el directorio.
   2. Ajustes de estimulación: Definir los parámetros de control de estímulos. Un "comando de estimulación" especifica las acciones que ocurren en ciertos fotogramas de video con la sintaxis , donde los códigos de letras son A = válvula1, B = válvula2, C = válvula3, L = luz LED; Además, mayúsculas = on y minúsculas = off. La intensidad del LED se establece con el código de letra "i" y un valor de 0 (apagado) a 255 (brillo máximo).
      NOTA: El valor de intensidad del LED de 0 a 255 establece el voltaje analógico de salida de 0 V a 5 V. El controlador de corriente utilizado aquí tiene una escala de intensidad lineal, y otros deben calibrarse con un medidor de potencia ligera.
      1. Para un experimento de estímulo único con un solo comando de estimulación repetida, use el formato de la Figura 3A.
      2. Para un experimento multipatrón con múltiples comandos de estimulación, use el formato de la Figura 3B. Incluye una "secuencia de patrones" de dígitos que represente el orden de los patrones de estímulo. Para cada patrón, introduzca un comando de estimulación en una línea separada.
         NOTA: Una secuencia pseudoaleatoria o secuencia m puede ser útil para investigar la dependencia del historial de estímulos.
2. Ejecute el software de control del microscopio. Verifique que todas las entradas fluídicas estén abiertas, que el flujo sea el deseado dentro de la arena (ver Figura 2H) y que las neuronas de interés estén enfocadas dentro de la ventana activa.
3. Cierre la ventana en vivo y ejecute el script "MultiPattern_RunScript.bsh" dentro del software.
   NOTA: Es útil realizar un experimento de prueba sin animales para verificar el flujo y la estimulación adecuados. Sustituir una concentración de fluoresceína diferente para cada fluido de estímulo puede ayudar a visualizar y documentar nuevos patrones de estímulo.
4. Después de la experimentación, desmonte el dispositivo microfluídico y enjuague todas las superficies, tubos y depósitos con agua.
   NOTA: Todos los componentes se pueden reutilizar docenas de veces si se mantienen limpios. Asegúrese de que los depósitos, tubos y dispositivos microfluídicos se mantengan húmedos o completamente secos en una corriente de aire para evitar la cristalización de la sal, que puede obstruirse y es difícil de eliminar. Los dispositivos pueden conservarse en etanol para esterilizar, pero deben secarse completamente antes de su reutilización (>1 h a 65 °C)¹⁷.

8. Análisis de datos con NeuroTracker

NOTA: NeuroTracker 4,18,19 es un complemento de software ImageJ / FIJI²⁰ para rastrear la intensidad de fluorescencia de múltiples neuronas y animales^, incluso mientras se mueven durante los ensayos. Este complemento guarda los datos como archivos de texto con la posición de cada neurona y la intensidad de fluorescencia (F) corregida en segundo plano. Los datos de fluorescencia se normalizan a la fluorescencia basal (F 0), por ejemplo, el promedio de varios segundos antes de la estimulación, como Δ F / F 0 = (F -F 0) / F ₀, que se puede promediar entre las poblaciones.

1. Instale los scripts de NeuroTracker según las instrucciones (github.com/albrechtLab/Neurotracker).
2. Ejecute NeuroTracker haciendo clic en Plugins | Seguimiento | NeuroTracker.
3. Seleccione la carpeta que contiene el archivo . Archivos de video TIF para ser rastreados y seleccione la configuración deseada.
   NOTA: Si sólo se va a realizar un seguimiento de un subconjunto de los archivos de vídeo, seleccione el rango numérico de los archivos que desea analizar cuando se le solicite. La configuración de seguimiento predeterminada es adecuada para animales inmóviles con una resolución de 250 píxeles/mm. Ajuste los parámetros proporcionalmente para otras resoluciones. Consulte la Guía del usuario¹⁹ para obtener más información sobre la configuración.
4. Establezca el umbral de intensidad de tal manera que las neuronas sean visibles para la selección (Figura 4).
5. Abra las ventanas de control Brillo/Contraste (B/C) y Umbral mediante la imagen | Ajustar menú.
6. En la ventana B/C , ajuste los controles deslizantes Mínimo y Máximo hasta que las neuronas sean claramente distinguibles (Figura 4A).
7. En la ventana Umbral , marque Fondo oscuro y No restablecer rango.
8. Deslice el control deslizante del marco para observar el movimiento de la neurona y los cambios de intensidad, observando cualquier animal que se excluya del seguimiento, como debido a la superposición con otros animales.
9. Identificar las neuronas para el seguimiento.
10. Para cada animal, ajuste el nivel umbral de tal manera que el área umbral roja sobre la neurona sea visible en cada cuadro antes, durante y después de la estimulación.
11. Haga clic en la neurona para registrar su posición y nivel de umbral.
12. Repita el ajuste y la selección del umbral para cada animal y neurona a rastrear. Consulte la Figura 4C para un buen ejemplo de nivel de umbral y la Figura 4D,E para ejemplos de umbral superior y bajo. Las neuronas previamente seleccionadas se indican mediante una pequeña caja.
13. Cuando se seleccionen todas las neuronas, presione la barra espaciadora para comenzar el seguimiento.
    NOTA: Para ejemplos adicionales de NeuroTracker, consulte las referencias anteriores ^4,19.
14. Supervise el proceso de seguimiento de cada animal y realice las correcciones necesarias.
15. Si NeuroTracker se detiene, ha perdido la neurona. Vuelva a hacer clic en la neurona, ajustando el nivel de umbral según sea necesario.
16. Si el cuadro de integración salta a otro animal cercano o estructura no neuronal, presione la barra espaciadora para hacer una pausa, mueva el control deslizante de nuevo al primer fotograma erróneo y vuelva a hacer clic en la ubicación correcta de la neurona.

9. Exploración y visualización de datos

NOTA: El script de análisis de MATLAB se utiliza para el procesamiento y la visualización de datos y para generar PDF de resumen para cada análisis.

1. Ejecute el archivo "NeuroTrackerSummary_pdf.m" en MATLAB y seleccione la carpeta que contiene los archivos de texto de datos de NeuroTracker.
2. Espere a que se produzca un PDF resumido, que permita la verificación del proceso de seguimiento (Figura 5). Los animales se identifican por un número (Figura 5A), y las respuestas neuronales de cada animal y ensayo se pueden ver para evaluar la variabilidad de la población (Figura 5B).
3. Utilice la función "databrowse.m" para explorar los datos neuronales, por ejemplo, agrupando por número de ensayo (Figura 5C), por número de animal (Figura 5D), por patrón de estimulación o por otra categoría.

Resultados

Presentamos varios ejemplos de patrones de estímulo que evalúan diferentes fenómenos neuronales, incluida la inhibición temporal, la adaptación y la desinhibición. La inhibición temporal es la supresión momentánea de una respuesta neural a una segunda presentación de estímulo que ocurre poco después de la presentación inicial¹⁴. Para probar este fenómeno, en un experimento de pulso pareado, se presentaron ocho patrones que consisten en dos pulsos odorantes de 1 s sep...

Discusión

En este protocolo, describimos un sistema de microscopía de acceso abierto para la evaluación de fenómenos de actividad neuronal utilizando la entrega temporalmente precisa de diferentes patrones de estímulo. La plataforma microfluídica ofrece estímulos repetibles mientras mantiene a decenas de animales en el campo de visión del microscopio. Pocos paquetes de software de microscopía comerciales permiten la fácil programación de varios patrones de sincronización de estímulos, y los que lo hacen a menudo requie...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacterial strains
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	Cat# OP50
Experimental models: Organisms/strains
C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons	Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work	NZ1091, for example
Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies
2,3-Butanedione	Sigma-Aldrich	Cat# B85307	diacetyl, example chemical stimulus
Calcium chloride, CaCl2	Sigma-Aldrich	Cat# C3881
Fluorescein, Sodium salt	Sigma-Aldrich	Cat# F6377
Glass water repellant	Rain-X	Cat #800002250	glass hydrophobic treatment (single-use)
Magnesium chloride, MgCl2	Sigma-Aldrich	Cat# M2393
Nematode Growth Medium (NGM) agar	Genesee	Cat #: 20-273NGM
Petri dishes (60 mm)	Tritech	Cat #T3305
Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184	Dow Chemical	Cat# 1673921
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	Cat# P5655
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	Cat# P8281
Sodium chloride, NaCl	Sigma-Aldrich	Cat# S7653
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS)	Gelest	CAS# 78560-45-9	glass hydrophobic treatment (durable)
Software and algorithms
Arduino IDE	Arduino	https://www.arduino.cc/en/software
ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Micro-manager	Micro-manager	https://micro-manager.org/
Microscope control software	Albrecht Lab	https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl
Neurotracker data analysis software	Albrecht Lab	https://github.com/albrechtLab/Neurotracker
Automated Microscope and Stimulation System
Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar)	Zeiss	Cat #491237-0012-000
Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator	Excelitas	Cat #XYLIS
Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera	Hamamatsu	Cat #C11440-22CU
Arduino nano	Arduino	Cat #A000005
3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12)	Parker	Cat #LQX12-3W24FF48-000	Valve 1: Control
2-way normally-closed (NC) Pinch Valve	Bio-Chem Valve Inc	Cat #075P2-S432	Valve 2: Outflow
3-way Pinch Valve	NResearch	Cat #161P091	Valve 3: Stimulus selection
Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm)	Mightex	Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2
ValveLink 8.2 digital/manual valve controller	AutoMate Scientific	Cat #01-18
Wires and connectors	various	See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021)
Microfluidic Device Preparation
Dremel variable speed rotary cutter 4000	Dremel	Cat #F0134000AB	Set speed to 5k RPM for cutting glass
Dremel drill press rotary tool workstation	Dremel	Cat #220-01
Diamond drill bit	Dremel	Cat #7134
Glass slide, 1 mm thick	VWR	Cat #75799-268
Glass scribe (Diamond scriber)	Ted Pella	Cat #54468
Luer 3-way stopcock	Cole-Parmer	Cat #EW-30600-07
Luer 23 G blunt needle	VWR	Cat #89134-100
Microfluidic device	Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article	N/A
Microfluidic device clamp	Warner Instruments (or machine shop)	P-2
Microfluidic tubing, 0.02″ ID	Cole-Parmer	Cat #EW-06419-01
Tube 19 G, 0.5″	New England Small Tube	Cat #NE-1027-12