Stimulation multimodale automatisée et enregistrement neuronal simultané à partir de plusieurs petits organismes

Résumé

Nous présentons une méthode pour la stimulation chimique flexible et multimodale et l’enregistrement de l’activité neuronale simultanée de nombreux vers Caenorhabditis elegans . Cette méthode utilise la microfluidique, du matériel et des logiciels open source et une analyse automatisée supervisée des données pour permettre la mesure de phénomènes neuronaux tels que l’adaptation, l’inhibition temporelle et la diaphonie de stimulus.

Résumé

Les indicateurs de calcium fluorescents codés génétiquement ont grandement contribué à notre compréhension de la dynamique neuronale depuis le niveau des neurones individuels jusqu’à des circuits cérébraux entiers. Cependant, les réponses neuronales peuvent varier en raison de l’expérience antérieure, des états internes ou des facteurs stochastiques, générant ainsi le besoin de méthodes permettant d’évaluer la fonction neuronale chez de nombreux individus à la fois. Alors que la plupart des techniques d’enregistrement examinent un seul animal à la fois, nous décrivons l’utilisation de la microscopie à grand champ pour étendre les enregistrements neuronaux à des dizaines de Caenorhabditis elegans ou d’autres organismes à l’échelle inférieure à la fois. Le matériel et les logiciels open source offrent une grande flexibilité dans la programmation d’expériences entièrement automatisées qui contrôlent l’intensité et le moment de divers types de stimulus, y compris les stimuli chimiques, optiques, mécaniques, thermiques et électromagnétiques. En particulier, les dispositifs d’écoulement microfluidique fournissent un contrôle précis, reproductible et quantitatif des stimuli chimiosensoriels avec une résolution temporelle inférieure à la seconde. Le pipeline d’analyse de données semi-automatisé NeuroTracker extrait ensuite les réponses neuronales individuelles et à l’échelle de la population pour découvrir les changements fonctionnels dans l’excitabilité et la dynamique neuronales. Cet article présente des exemples de mesure de l’adaptation neuronale, de l’inhibition temporelle et de la diaphonie stimulus. Ces techniques augmentent la précision et la répétabilité de la stimulation, permettent l’exploration de la variabilité de la population et sont généralisables à d’autres signaux fluorescents dynamiques dans de petits biosystèmes, des cellules et organoïdes aux organismes entiers et aux plantes.

Introduction

Les techniques d’imagerie calcique ont permis l’enregistrement non invasif de la dynamique neuronale in vivo en temps réel à l’aide de la microscopie à fluorescence et d’indicateurs de calcium génétiquement codés exprimés dans les cellules cibles ^1,2,3. Ces capteurs utilisent généralement une protéine fluorescente verte (GFP), telle que la famille de peptides GFP-calmodulin-M13 (GCaMP), pour augmenter l’intensité de fluorescence lors de l’activation neuronale et des niveaux élevés de calcium intracellulaire. L’imagerie calcique a été particulièrement puissante chez le nématode C. elegans pour examiner comment les neurones et les circuits neuronaux fonctionnent chez les animaux vivants^{au comportement} 4,5,6,7,8,9,10, car leur nature transparente signifie qu’aucun processus chirurgical n’est nécessaire pour l’accès optique^, et les promoteurs de gènes spécifiques aux cellules ciblent l’expression des cellules d’intérêt. Ces techniques utilisent souvent des dispositifs microfluidiques, qui fournissent des environnements contrôlés avec précision pour étudier les phénomènes biologiques, chimiques et physiques à petite échelle^{physique 11,12}. Les dispositifs microfluidiques abondent pour mesurer l’activité neuronale, avec de nouvelles conceptions continuellement en développement, et ils sont facilement fabriqués dans le laboratoire de recherche. Cependant, de nombreux modèles piègent un seul animal à la fois, limitant le débit expérimental ^7,9,13. Les réponses neuronales varient souvent considérablement d’un animal à l’autre en raison de différences dans l’expérience antérieure, d’états internes tels que le stress ou la faim, ou de facteurs stochastiques tels que les niveaux d’expression génique. Ces différences établissent un besoin de méthodes capables simultanément de stimuler et d’observer de nombreux animaux et d’extraire des informations des individus⁴.

De plus, certains phénomènes neuromodulateurs ne se manifestent que dans des conditions de stimulation spécifiques, comme l’inhibition temporelle¹⁴, qui fait référence à la brève suppression des réponses lorsque la stimulation se produit en succession rapide. Les systèmes électrophysiologiques peuvent conduire l’activité neuronale à travers un large espace de stimulus à cette fin, modulant, par exemple, le courant d’impulsion électrique, la tension, la fréquence, la forme d’onde, le cycle de service et la synchronisation des trains de stimulus périodiques. La stimulation indirecte par des stimuli ou des systèmes optogénétiques détectés naturellement bénéficierait d’une gamme similaire de mécanismes de contrôle. Actuellement, de nombreux stimuli naturels sont présentés de manière simple « on-off », tels que la présentation et l’élimination des odeurs, en utilisant des systèmes commerciaux qui ont été lents à ajouter de la flexibilité. Cependant, les microcontrôleurs peu coûteux peuvent désormais automatiser la livraison de plusieurs types de stimuli d’une manière personnalisable en fonction des besoins des chercheurs. Combinés à la microfluidique, ces systèmes ont atteint l’objectif d’augmenter le débit expérimental et la flexibilité, permettant de mesurer simultanément les réponses neuronales à une variété de stimuli précis chez de nombreux animaux ^4,6. La stimulation multimodale peut être utilisée pour interroger davantage les circuits neuronaux, par exemple en surveillant les changements dans l’excitabilité neuronale lors d’une stimulation constante avant, pendant et après une perturbation orthogonale telle que l’exposition à un médicament⁴. Les avantages des systèmes de microscopie ouverts peu coûteux sont évidents pour faire progresser la recherche scientifique, mais dans la pratique, la nécessité d’approvisionnement en pièces, de construction et de validation des performances peut entraver l’adoption de ces techniques.

Ce protocole vise à atténuer certains de ces défis techniques. Alors que les protocoles précédents se sont concentrés sur l’utilisation de dispositifs microfluidiques et la stimulation de base 9,15,17, nous décrivons ici la construction et l’utilisation d’un système de distribution de stimulus flexible^, automatisé et multimodal pour l’imagerie neuronale chez C. elegans ou d’autres petits organismes utilisant des dispositifs microfluidiques^{décrits précédemment 4}. Le système open-source est programmé via de simples fichiers texte pour définir les expériences, et le programme d’analyse de données NeuroTracker extrait semi-automatiquement les données d’activité neuronale des vidéos du microscope. Nous démontrons ce système avec des exemples d’évaluation de l’inhibition temporelle, de la désinhibition et de la diaphonie de stimulus à l’aide du neurone chimiosensoriel AWA, qui se dépolarise en réponse à différentes odeurs alimentaires ou en réponse à la lumière lors de l’expression de canaux ioniques optogénétiques sensibles à la lumière ^5,6.

Protocole

1. Équipement d’imagerie neuronale

REMARQUE : voir Lawler et Albrecht¹⁵ pour obtenir des instructions détaillées sur la construction du système d’imagerie et de stimulation, qui contrôle le moment de l’illumination du microscope, l’acquisition d’images et la délivrance de stimuli (Figure 1). Un contrôleur de stimulus Arduino Nano peu coûteux actionne les vannes fluidiques via des signaux numériques vers un contrôleur de vanne et contrôle l’éclairage optogénétique via des signaux de tension analogiques vers un contrôleur LED. D’autres stimuli, tels que les moteurs de vibration et les chauffages thermiques, peuvent être contrôlés à l’aide de signaux numériques ou analogiques. Le contrôleur de stimulus synchronise la stimulation et l’enregistrement d’images via les signaux de la caméra, comme spécifié par le logiciel de contrôle de microscope open source Micro-Manager (μManager)¹⁶. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs, équipements et organismes utilisés dans ce protocole.

1. Installez l’équipement d’imagerie neuronale, y compris un microscope à épifluorescence avec optique GFP, une caméra sCMOS avec un signal de sortie d’exposition numérique et un contrôleur de stimulus¹⁵.
2. Connectez le contrôleur de stimulus aux systèmes souhaités via des signaux numériques ou analogiques. Pour les exemples présentés ci-dessous, les systèmes suivants sont utilisés :
   1. Utilisez un contrôleur de valve pour la stimulation chimique. Connectez le contrôleur de vanne à des électrovannes fluidiques ou à pincement (Figure 1)¹⁵.
   2. Utilisez une LED rouge de 615 nm et un contrôleur pour la stimulation optogénétique, montés au-dessus de la platine du microscope.
3. Configurez l’ordinateur avec le logiciel de contrôle du microscope, créez un préréglage de configuration avec les paramètres de l’équipement et assurez-vous du bon fonctionnement du contrôle du stimulus¹⁵.

2. Fabrication de dispositifs microfluidiques

REMARQUE : Voir Lagoy et ^coll.17 pour obtenir des renseignements détaillés sur l’obtention ou la fabrication des moules maîtres et sur la production, l’utilisation et le nettoyage des dispositifs microfluidiques. Ces étapes sont résumées ci-dessous.

1. Obtenir ou fabriquer un moule maître à l’aide du fichier de conception microfluidique fourni (albrechtlab.github.io/microfluidics)¹⁷. Pour les jeunes adultes C. elegans, assurez-vous que la hauteur du canal est de 55 à 70 μm.
2. Combiner la base PDMS et l’agent de durcissement à un rapport de poids de 10:1 et bien mélanger avec des pipettes de transfert.
3. Dégazer pendant 30-60 min dans un dessiccateur sous vide jusqu’à ce que les bulles disparaissent.
4. Placez le moule maître dans une grande boîte de Petri (150 mm de diamètre) et versez le PDMS dégazé jusqu’à une profondeur de 4-5 mm (~100 g). Inspectez et enlevez toute poussière ou bulle à l’aide d’une pipette de transfert.
5. Cuire au four à 65 °C sur une étagère plane pendant 3 h à toute la nuit.
6. Une fois durci, utilisez un scalpel pour couper le PDMS du moule et une lame de rasoir droite pour séparer les appareils.
7. Poinçonner les trous d’entrée et de sortie à l’aide d’un poinçon dermique de 1 mm et les nettoyer avec du dH 2 O, del’éthanol, et de nouveau avec du dH₂O. Séchez l’appareil dans un flux d’air (voir la figure 2A).
8. Nettoyez les deux côtés de l’appareil PDMS avec du ruban adhésif, en enlevant toute poussière ou débris.
9. Préparez les lames de verre pour compléter le dispositif microfluidique comme décrit¹⁷. Percer les trous d’entrée de la lame supérieure à l’aide d’un trépan diamanté et rendre la lame inférieure hydrophobe en l’exposant aux vapeurs de TFOCS ou en appliquant un traitement hydrofuge du verre (figure 2B).
10. Assemblez le sandwich verre-PDMS dans une pince (Figure 2C).

3. Préparation des animaux

1. Obtenir ou créer des animaux avec des indicateurs de calcium génétiquement codés exprimés dans les neurones d’intérêt.
   REMARQUE : Par exemple, la ligne NZ1091 (kyIs587 [gpa-6p::GCaMP2.2b; unc-122p::d sRed]; kyIs5662 [odr-7p::Chrimson:SL2:mCherry; elt-2p::mCherry]) exprime GCaMP et le canal cationique sensible à la lumière rouge Chrimson dans la paire de neurones sensoriels AWA⁶. Les deux transgènes sont intégrés dans le génome pour une expression stable chez chaque animal.
2. Un jour avant l’expérimentation, placer au moins 20 larves de stade larvaire L4 C. elegans par expérience sur une plaque de gélose en milieu de croissance des nématodes (NGM) ensemencée avec une pelouse OP50 E. coli. Lorsqu’il est maintenu à 20 °C, cela synchronisera les animaux de type sauvage au stade de jeune adulte le lendemain.
   REMARQUE: Pour les transgènes de réseau, choisissez les animaux à l’aide d’un stéréoscope à fluorescence pour assurer l’expression des transgènes chez les animaux choisis.

4. Préparation de la solution

1. Préparer 1x tampon basal S (100 mM NaCl et 0,05 M KPO₄, pH 6,0) à partir d’une solution mère 10x.
2. Préparer le tampon tétramisole 1 mM en diluant 1 M de stock dans 1x S Basal. Utilisez ce tampon paralytique pour préparer tous les stimuli. Une expérience utilise généralement environ 150 mL.
3. Ajouter 0,1-1 μg/mL de fluorescéine aux réservoirs tampons « témoins » pour visualiser le débit.
4. Créer des solutions de stimulus par dilution en série jusqu’à la concentration finale souhaitée. Par exemple, créez une dilution de 10−⁷ de l’attractif diacétyle en créant d’abord un stock 10⁻³ .
   REMARQUE : Une petite quantité de fluorescéine (0,1 à 1 μg/mL) peut être ajoutée au stimulus ou à la solution tampon pour vérifier le moment du stimulus, mais la concentration doit être minimale pour éviter les artefacts de fluorescence neuronale.

5. Préparation du dispositif microfluidique

REMARQUE : Voir Reilly et ^al.9 pour un protocole vidéo montrant la génération du réservoir, la configuration de l’appareil et le chargement des animaux. Voir aussi Lagoy et ^coll.17 pour un protocole écrit comprenant de nombreux conseils utiles.

1. Préparez trois réservoirs de fluide ou plus. Pour chacun, fixer un réservoir de seringue de 30 ml ou 60 ml, une seringue d’amorçage de 3 ml et une tige d’aiguille à une valve Luer à trois voies (figure 2D). Connectez l’aiguille à un tube de microforage muni d’un tube métallique à l’extrémité. Étiquetez les réservoirs, montez-les sur une crémaillère fixée à un support annulaire et remplissez-les avec le tampon ou les fluides de stimulus correspondants (Figure 2E).
2. Dégazer le dispositif microfluidique assemblé dans un dessiccateur sous vide pendant ~1 h.
3. Remplissez et retirez les bulles d’air du tube du réservoir à l’aide de la seringue d’amorçage. Remplissez le tube de sortie avec un tampon.
4. Retirez le dispositif microfluidique du vide, insérez rapidement le tube de sortie et injectez le fluide à travers le dispositif jusqu’à ce qu’une gouttelette émerge d’une entrée.
5. A cette entrée, utiliser un raccord « goutte à goutte »¹⁷ pour insérer le tube d’entrée fluidique correspondant (figure 2F). Assurez-vous que des gouttes de liquide sont présentes à la fois sur le tube d’entrée et sur le trou de port de l’appareil pour éviter l’introduction d’une bulle.
6. Injectez plus de liquide à partir de la sortie, connectez le tube d’entrée suivant et répétez jusqu’à ce que toutes les entrées soient remplies. Insérez une broche de blocage solide à toutes les entrées inutilisées et au port de chargement de la vis sans fin.
7. Initier l’écoulement en ouvrant les vannes Luer d’entrée et de sortie. Inspectez l’appareil pour détecter les fuites aux entrées et à la base en verre. Inspectez l’appareil à la recherche de bulles dans les canaux d’écoulement ou les entrées à l’aide du logiciel de capture d’images au microscope en mode live.
   REMARQUE: Si des bulles sont présentes, attendez qu’elles soient absorbées dans le matériau PDMS.

6. Chargement des animaux

NOTE : Voir Lagoy et ^coll.17.

1. Transférer les jeunes animaux adultes sur une plaque de gélose NGM non ensemencée à l’aide d’un « pic » à bout métallique.
2. Inonder la plaque avec environ 5 ml de tampon basal 1x S de sorte que les animaux nagent.
3. Aspirez les vers dans une seringue de chargement (seringue de 1 mL ou 3 mL avec tube attaché qui a été prérempli de 1x S Basal).
   1. À l’aide d’un stéréoscope, déplacez l’extrémité du tube sous la surface du liquide avec une main vers chaque animal désiré et aspirez-la dans la tubulure à l’aide de la seringue tenue dans l’autre main.
   2. Aspirez les vers uniquement dans le tube, pas dans la seringue.
      REMARQUE: Le tube ne contient généralement qu’environ 100 μL. Les animaux peuvent être expulsés dans une zone locale, puis aspirés à nouveau dans le tube avec un petit volume.
4. Fermez la ligne de prise, retirez la broche de chargement du ver et connectez la seringue de chargement de vers au périphérique à l’aide d’une connexion goutte-à-goutte.
5. Faites couler doucement les animaux dans l’arène, établissez un écoulement tampon et laissez jusqu’à 1 h pour l’immobilisation par tétramisole.
   REMARQUE : Pendant la période d’immobilisation, assurez-vous que seul le liquide tampon pénètre dans l’arène. Les réservoirs de stimulus et de contrôle peuvent être désactivés pendant cette période, mais ouvrez-les et vérifiez le débit correct avant d’exécuter les essais de stimulation.

7. Stimulation automatisée et enregistrement neuronal

1. Créez un fichier texte de définition de stimulus appelé « Paramètres d’acquisition définis par l’utilisateur .txt » avec un éditeur de texte (par exemple, le Bloc-notes) contenant les paramètres de stimulation pour l’acquisition automatisée d’images (voir les exemples de la figure 3). Les paramètres sont divisés en deux sections :
   1. Paramètres d’acquisition du microscope : Définissez le type d’expérience (Single-Stimulus ou Multi-Pattern), le moment de l’exposition et de l’excitation, la durée et les intervalles de l’essai, et le répertoire de sauvegarde.
   2. Paramètres de stimulation : Définissez les paramètres de contrôle du stimulus. Une « commande de stimulation » spécifie les actions se produisant sur certaines images vidéo avec la syntaxe , où les codes de lettre sont A = valve1, B = valve2, C = valve3, L = lumière LED; De plus, majuscules = activé et minuscules = désactivé. L’intensité de la LED est réglée avec le code alphabétique « i » et une valeur de 0 (off) à 255 (luminosité maximale).
      REMARQUE: La valeur d’intensité LED de 0 à 255 définit la tension analogique de sortie de 0 V à 5 V. Le contrôleur de courant utilisé ici a une mise à l’échelle d’intensité linéaire, et les autres doivent être étalonnés avec un capteur de puissance optique.
      1. Pour une expérience à stimulus unique avec une seule commande de stimulation répétée, utilisez le format de la figure 3A.
      2. Pour une expérience multi-motifs avec plusieurs commandes de stimulation, utilisez le format de la figure 3B. Incluez une « séquence de motifs » de chiffres qui représente l’ordre des modèles de stimulation. Pour chaque motif, entrez une commande de stimulation sur une ligne distincte.
         REMARQUE: Une séquence pseudo-aléatoire ou une séquence m peut être utile pour étudier la dépendance à l’historique des stimulus.
2. Exécutez le logiciel de contrôle du microscope. Vérifiez que toutes les entrées fluidiques sont ouvertes, que le flux est comme souhaité dans l’arène (voir Figure 2H) et que les neurones d’intérêt sont au point dans la fenêtre en direct.
3. Fermez la fenêtre en direct et exécutez le script « MultiPattern_RunScript.bsh » dans le logiciel.
   REMARQUE: Il est utile d’effectuer une expérience d’essai sans animaux pour vérifier le bon débit et la stimulation. La substitution d’une concentration de fluorescéine différente pour chaque fluide de stimulus peut aider à visualiser et à documenter de nouveaux modèles de stimulus.
4. Après expérimentation, démontez le dispositif microfluidique et rincez toutes les surfaces, les tubes et les réservoirs avec de l’eau.
   REMARQUE: Tous les composants peuvent être réutilisés des dizaines de fois s’ils sont maintenus propres. S’assurer que les réservoirs, les tubes et les dispositifs microfluidiques sont maintenus humides ou complètement séchés dans un courant d’air pour éviter la cristallisation du sel, qui peut obstruer et est difficile à enlever. Les dispositifs peuvent être conservés dans de l’éthanol pour stérilisation, mais doivent être complètement séchés avant d’être réutilisés (>1 h à 65 °C)¹⁷.

8. Analyse des données à l’aide de NeuroTracker

REMARQUE: NeuroTracker 4,18,19 est un plugin logiciel ImageJ / FIJI²⁰ pour suivre l’intensité de fluorescence de plusieurs neurones et animaux^, même lorsqu’ils se déplacent pendant les essais. Ce plugin enregistre les données sous forme de fichiers texte avec la position de chaque neurone et l’intensité de fluorescence corrigée de l’arrière-plan (F). Les données de fluorescence sont normalisées à la fluorescence de base (F 0), par exemple, la moyenne de plusieurs secondes avant la stimulation, comme Δ F/F 0 = (F -F 0)/F ₀, qui peut être moyennée entre les populations.

1. Installez les scripts NeuroTracker comme indiqué (github.com/albrechtLab/Neurotracker).
2. Exécutez NeuroTracker en cliquant sur Plugins | Suivi | NeuroTracker.
3. Sélectionnez le dossier contenant le fichier . Fichiers vidéo TIF à suivre et sélectionnez les paramètres souhaités.
   Remarque : Si seulement un sous-ensemble des fichiers vidéo doivent être suivis, sélectionnez la plage numérique des fichiers à analyser à l’invite. Les paramètres de suivi par défaut sont appropriés pour les animaux non mobiles à une résolution de 250 pixels/mm. Ajustez les paramètres proportionnellement pour les autres résolutions. Consultez le Guide de l’utilisateur¹⁹ pour plus d’informations sur les paramètres.
4. Réglez le seuil d’intensité de telle sorte que les neurones soient visibles pour la sélection (Figure 4).
5. Ouvrez les fenêtres de contrôle Luminosité/Contraste (B/C) et Seuil à l’aide des fenêtres Image | Ajuster le menu.
6. Dans la fenêtre B/C , ajustez les curseurs Minimum et Maximum jusqu’à ce que les neurones soient clairement discernables (Figure 4A).
7. Dans la fenêtre Seuil , cochez Arrière-plan sombre et Ne pas réinitialiser la plage.
8. Faites glisser le curseur du cadre pour observer le mouvement des neurones et les changements d’intensité, en notant les animaux à exclure du suivi, par exemple en raison d’un chevauchement avec d’autres animaux.
9. Identifier les neurones à suivre.
10. Pour chaque animal, ajustez le niveau de seuil de sorte que la zone de seuil rouge au-dessus du neurone soit visible dans chaque image avant, pendant et après la stimulation.
11. Cliquez sur le neurone pour enregistrer sa position et son niveau de seuil.
12. Répétez l’ajustement du seuil et la sélection pour chaque animal et neurone à suivre. Voir la figure 4C pour un bon exemple de niveau de seuil et la figure 4D,E pour des exemples de seuil supérieur et inférieur au seuil. Les neurones préalablement sélectionnés sont indiqués par une petite boîte.
13. Lorsque tous les neurones sont sélectionnés, appuyez sur la barre d’espace pour commencer le suivi.
    REMARQUE: Pour des exemples supplémentaires de NeuroTracker, voir les références^{précédentes 4,19}.
14. Surveillez le processus de suivi de chaque animal et apportez les corrections nécessaires.
15. Si NeuroTracker fait une pause, il a perdu le neurone. Recliquez sur le neurone, en ajustant le niveau de seuil au besoin.
16. Si la boîte d’intégration saute à une autre structure animale ou non neuronale à proximité, appuyez sur la barre d’espace pour faire une pause, déplacez le curseur vers la première image erronée et recliquez sur l’emplacement correct du neurone.

9. Exploration et visualisation des données

REMARQUE : Le script d’analyse MATLAB est utilisé pour le traitement et la visualisation des données et pour générer des PDF récapitulatifs pour chaque analyse.

1. Exécutez le fichier « NeuroTrackerSummary_pdf.m » dans MATLAB et sélectionnez le dossier contenant les fichiers texte de données NeuroTracker.
2. Attendez qu’un PDF récapitulatif soit produit, permettant la vérification du processus de suivi (Figure 5). Les animaux sont identifiés par un nombre (figure 5A), et les réponses neuronales de chaque animal et essai peuvent être visualisées pour évaluer la variabilité de la population (figure 5B).
3. Utilisez la fonction « databrowse.m » pour explorer les données neuronales, par exemple, en les regroupant par numéro d’essai (Figure 5C), par nombre d’animaux (Figure 5D), par modèle de stimulation ou par une autre catégorie.

Résultats

Nous présentons plusieurs exemples de modèles de stimulus qui évaluent différents phénomènes neuronaux, y compris l’inhibition temporelle, l’adaptation et la désinhibition. L’inhibition temporelle est la suppression momentanée d’une réponse neuronale à une deuxième présentation de stimulus survenant peu de temps après la présentation initiale¹⁴. Pour tester ce phénomène, dans une expérience d’impulsion appariée, huit modèles consistant en deux impulsio...

Discussion

Dans ce protocole, nous décrivons un système de microscopie en libre accès pour l’évaluation des phénomènes d’activité neuronale en utilisant la livraison temporellement précise de différents modèles de stimulus. La plate-forme microfluidique fournit des stimuli reproductibles tout en maintenant des dizaines d’animaux dans le champ de vision du microscope. Peu de logiciels de microscopie commerciaux permettent de programmer facilement divers modèles de synchronisation de stimulus, et ceux qui le font né...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacterial strains
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	Cat# OP50
Experimental models: Organisms/strains
C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons	Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work	NZ1091, for example
Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies
2,3-Butanedione	Sigma-Aldrich	Cat# B85307	diacetyl, example chemical stimulus
Calcium chloride, CaCl2	Sigma-Aldrich	Cat# C3881
Fluorescein, Sodium salt	Sigma-Aldrich	Cat# F6377
Glass water repellant	Rain-X	Cat #800002250	glass hydrophobic treatment (single-use)
Magnesium chloride, MgCl2	Sigma-Aldrich	Cat# M2393
Nematode Growth Medium (NGM) agar	Genesee	Cat #: 20-273NGM
Petri dishes (60 mm)	Tritech	Cat #T3305
Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184	Dow Chemical	Cat# 1673921
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	Cat# P5655
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	Cat# P8281
Sodium chloride, NaCl	Sigma-Aldrich	Cat# S7653
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS)	Gelest	CAS# 78560-45-9	glass hydrophobic treatment (durable)
Software and algorithms
Arduino IDE	Arduino	https://www.arduino.cc/en/software
ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Micro-manager	Micro-manager	https://micro-manager.org/
Microscope control software	Albrecht Lab	https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl
Neurotracker data analysis software	Albrecht Lab	https://github.com/albrechtLab/Neurotracker
Automated Microscope and Stimulation System
Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar)	Zeiss	Cat #491237-0012-000
Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator	Excelitas	Cat #XYLIS
Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera	Hamamatsu	Cat #C11440-22CU
Arduino nano	Arduino	Cat #A000005
3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12)	Parker	Cat #LQX12-3W24FF48-000	Valve 1: Control
2-way normally-closed (NC) Pinch Valve	Bio-Chem Valve Inc	Cat #075P2-S432	Valve 2: Outflow
3-way Pinch Valve	NResearch	Cat #161P091	Valve 3: Stimulus selection
Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm)	Mightex	Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2
ValveLink 8.2 digital/manual valve controller	AutoMate Scientific	Cat #01-18
Wires and connectors	various	See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021)
Microfluidic Device Preparation
Dremel variable speed rotary cutter 4000	Dremel	Cat #F0134000AB	Set speed to 5k RPM for cutting glass
Dremel drill press rotary tool workstation	Dremel	Cat #220-01
Diamond drill bit	Dremel	Cat #7134
Glass slide, 1 mm thick	VWR	Cat #75799-268
Glass scribe (Diamond scriber)	Ted Pella	Cat #54468
Luer 3-way stopcock	Cole-Parmer	Cat #EW-30600-07
Luer 23 G blunt needle	VWR	Cat #89134-100
Microfluidic device	Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article	N/A
Microfluidic device clamp	Warner Instruments (or machine shop)	P-2
Microfluidic tubing, 0.02″ ID	Cole-Parmer	Cat #EW-06419-01
Tube 19 G, 0.5″	New England Small Tube	Cat #NE-1027-12