複数の小生物からの自動マルチモーダル刺激と同時神経記録

要約

我々は、多くの カエノラブディティス・エレガンス 線虫からの同時神経活動の柔軟な化学的およびマルチモーダル刺激および記録のための方法を提示する。この方法は、マイクロフルイディクス、オープンソースのハードウェアとソフトウェア、および教師ありの自動データ分析を使用して、適応、時間的抑制、刺激クロストークなどの神経現象の測定を可能にします。

要約

蛍光遺伝暗号カルシウム指標は、個々の神経細胞レベルから脳回路全体までの神経動態の理解に大きく貢献しています。しかし、神経反応は、以前の経験、内部状態、または確率的要因によって異なる可能性があるため、一度に多くの個人の神経機能を評価できる方法が必要になります。ほとんどの記録技術は一度に1匹の動物を調べますが、広視野顕微鏡を使用して、ニューロンの記録を数十の カエノラブディティスエレガンス または他のサブミリメートルスケールの生物に一度にスケールアップすることについて説明します。オープンソースのハードウェアとソフトウェアにより、化学的、光学的、機械的、熱的、電磁的刺激など、さまざまな刺激タイプの強度とタイミングを制御する完全に自動化された実験をプログラミングする柔軟性が大幅に向上します。特に、マイクロ流体フローデバイスは、秒未満の時間分解能で化学感覚刺激の正確で再現性のある定量的制御を提供します。次に、NeuroTrackerの半自動データ分析パイプラインは、個人および集団全体の神経反応を抽出して、神経の興奮性とダイナミクスの機能的変化を明らかにします。本論文では、神経細胞の適応、時間的抑制、刺激クロストークの測定例を紹介します。これらの技術は、刺激の精度と再現性を高め、集団の多様性の探索を可能にし、細胞やオルガノイドから生物や植物全体に至るまで、小さな生物系における他の動的蛍光シグナルに一般化できます。

概要

カルシウムイメージング技術は、蛍光顕微鏡および標的細胞で発現される遺伝的にコードされたカルシウム指示薬を使用して、in vivo神経ダイナミクスの非侵襲的記録を可能にしました^1,2,3。これらのセンサーは通常、GFP-カルモジュリン-M13ペプチド(GCaMP)ファミリーなどの緑色蛍光タンパク質(GFP)を使用して、ニューロンの活性化と細胞内カルシウムレベルの上昇時に蛍光強度を増加させます。カルシウムイメージングは、線虫C.エレガンスにおいて、ニューロンおよび神経回路が生きた行動動物4,5,6,7,8,9,10においてどのように機能するかを調べるために特に強力であり、その透明な性質は光学的アクセスのための外科的プロセスが不要であり、細胞特異的遺伝子プロモーターは目的の細胞への発現を標的とする。これらの技術は、多くの場合、マイクロ流体デバイスを利用し、正確に制御された環境を提供して、生物学的、化学的、および物理的現象を小さな物理的スケールで研究します^11,12。神経活動を測定するためのマイクロ流体デバイスは豊富にあり、新しいデザインが継続的に開発されており、研究室で容易に製造できます。ただし、多くの設計では一度に1匹の動物をトラップするため、実験スループットが^{制限されます7、9、13}。神経反応は、以前の経験、ストレスや空腹などの内部状態、または遺伝子発現レベルなどの確率的要因の違いにより、動物によって大きく異なることがよくあります。これらの違いは、多くの動物を同時に刺激して観察し、個体から情報を抽出することができる方法の必要性を確立し^ます4。

さらに、特定の神経調節現象は、刺激が急速に連続して発生したときの応答の短時間の抑制を指す時間的抑制¹⁴などの特定の刺激条件下でのみ明らかになる。電気生理学的システムは、この目的のために、例えば、電気パルス電流、電圧、周波数、波形、デューティサイクル、および周期的な刺激列のタイミングを変調して、広い刺激空間にわたって神経活動を駆動することができる。自然に検出された刺激または光遺伝学的システムによる間接刺激は、同様の幅の制御メカニズムの恩恵を受けるでしょう。現在、多くの自然な刺激は、柔軟性を追加するのが遅い商用システムを使用して、匂いの提示や除去などの単純な「オンオフ」の方法で提示されます。しかし、安価なマイクロコントローラは、研究者のニーズに合わせてカスタマイズ可能な方法で、いくつかのタイプの刺激の送達を自動化できるようになりました。マイクロフルイディクスと組み合わせることで、これらのシステムは実験スループットと柔軟性の向上という目標を達成し、さまざまな正確な刺激に対する神経応答を多くの動物で同時に測定できるようになりました^4,6。マルチモーダル刺激は、薬物曝露などの直交摂動の前、最中、および後に一貫して刺激するときの神経興奮性の変化を監視することなどによって、ニューロン回路をさらに調べるために使用することができる⁴。安価でオープンな顕微鏡システムの利点は、科学研究を進める上で明らかですが、実際には、部品の調達、構築、および性能検証の必要性がこれらの技術の採用を妨げる可能性があります。

このプロトコルは、これらの技術的課題のいくつかを軽減することを目的としています。以前のプロトコルはマイクロ流体デバイスの使用と基本的な刺激^{に焦点を当てていました9}、^15、17、ここでは^、前述のマイクロ^{流体デバイスを利用する}C.エレガンスまたは他の小さな生物における神経イメージングのための柔軟で自動化されたマルチモーダル刺激送達システムの構築と使用について説明します4。オープンソースシステムは、実験を定義するために単純なテキストファイルを介してプログラムされ、NeuroTrackerデータ分析プログラムは、顕微鏡ビデオから神経活動データを半自動的に抽出します。光遺伝学的光感受性^{イオンチャネル5,6}を発現する際に、異なる食品の匂いに応答して、または光に応答して脱分極する化学感覚ニューロンAWAを使用して、時間的抑制、脱抑制、および刺激クロストークを評価する例を使用して、このシステムを実証します。

プロトコル

1. 神経画像機器

注:顕微鏡の照明タイミング、画像取得、および刺激の送達を制御するイメージングおよび刺激システムの構築に関する詳細な手順については、LawlerおよびAlbrecht¹⁵を参照してください(図1)。安価なArduino Nano刺激コントローラーは、バルブコントローラーへのデジタル信号を介して流体バルブを作動させ、LEDコントローラーへのアナログ電圧信号を介して光遺伝学的照明を制御します。振動モーターやサーマルヒーターなどの他の刺激は、デジタル信号またはアナログ信号を使用して制御できます。刺激コントローラは、オープンソースのMicro-Manager顕微鏡制御ソフトウェア(μManager)¹⁶で指定されているように、カメラ信号を介して刺激と画像記録を同期させます。このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、機器、および生物に関連する詳細については、材料の表を参照してください。

1. GFP光学系を備えた落射蛍光顕微鏡、デジタル露光出力信号を備えたsCMOSカメラ、および刺激制御器¹⁵を含むニューラルイメージング機器をセットアップする。
2. 刺激コントローラをデジタルまたはアナログ信号 を介して 目的のシステムに接続します。以下に示す例では、次のシステムが使用されます。
   1. 化学刺激にはバルブコントローラーを使用してください。バルブコントローラを流体ソレノイドまたはピンチバルブに接続します(図1⁾¹⁵。
   2. 615 nmの赤色LEDと光遺伝学的刺激用のコントローラーを使用し、顕微鏡ステージの上に取り付けます。
3. 顕微鏡制御ソフトウェアを使用してコンピュータをセットアップし、機器設定を含む構成プリセットを作成し、刺激制御¹⁵の適切な動作を確認します。

2. マイクロ流体デバイスの作製

注:マスターモールドの入手または製造、およびマイクロ流体デバイスの製造、使用、および洗浄の詳細については、Lagoy et ^al.17 を参照してください。これらの手順を以下にまとめます。

1. 提供されたマイクロ流体設計ファイル(albrechtlab.github.io/microfluidics)¹⁷を使用してマスターモールドを取得または製作します。若年成人 の場合 C.エレガンス、チャネルの高さが55〜70μmであることを確認してください。
2. PDMSベースと硬化剤を重量比10:1で混合し、トランスファーピペットで十分に混合します。
3. 気泡が消えるまで真空デシケーターで30〜60分間脱気します。
4. マスターモールドを大きな(直径150 mm)ペトリ皿に入れ、脱気したPDMSを深さ4〜5 mm(~100 g)まで注ぎます。トランスファーピペットでほこりや気泡を検査して取り除きます。
5. 水平なオーブン棚で65°Cで3時間から一晩焼きます。
6. 硬化したら、メスを使用してPDMSを型から切り取り、まっすぐなかみそりの刃を使用してデバイスを分離します。
7. 1 mmの皮膚パンチを使用して入口と出口の穴を開け、dH 2 O、エタノール、および再びdH₂Oで洗浄します。 気流でデバイスを乾燥させます(図2Aを参照)。
8. PDMSデバイスの両面を粘着テープで清掃し、ほこりや破片を取り除きます。
9. スライドガラスを準備して、¹⁷に記載のマイクロ流体デバイスを完成させる。ダイヤモンドビットを使用して上部スライドに入口穴を開け、TFOCS蒸気にさらすか、撥水性ガラス処理を適用して下部スライドを疎水性にします(図2B)。
10. ガラス-PDMSデバイスサンドイッチをクランプに組み立てます(図2C)。

3.動物の準備

1. 目的のニューロンに発現する遺伝的にコードされたカルシウムインジケーターを持つ動物を取得または作成します。
   注: たとえば、行 NZ1091 (kyIs587 [gpa-6p::GCaMP2.2b; unc-122p::d sRed]; kyIs5662 [odr-7p::Chrimson:SL2:mCherry; elt-2p::mCherry])GCaMPと赤色光感受性陽イオンチャネルクリムゾンをAWA感覚ニューロン対⁶で発現する。両方の導入遺伝子は、すべての動物で安定した発現のためにゲノムに組み込まれています。
2. 実験の1日前に、実験ごとに少なくとも20匹のL4幼虫期 C.エレガンス を、OP50大腸 菌 芝生を播種した線虫増殖培地(NGM)寒天プレートに置きます。20°Cに維持すると、翌日の若年成体段階で野生型動物を同期させます。
   注:アレイ導入遺伝子の場合は、蛍光ステレオスコープを使用して動物を選び、選択した動物で導入遺伝子を確実に発現させます。

4. 溶液調製

1. 10x ストック溶液から 1x S 基礎バッファー (100 mM NaCl および 0.05 M KPO₄, pH 6.0) を調製します。
2. 1 Mストックを1x Sバサルで希釈することにより、1 mMテトラミソールバッファーを調製します。この麻痺バッファーを使用して、すべての刺激を準備します。実験では通常、約150mLを使用します。
3. 0.1-1 μg/mLのフルオレセインを「コントロール」バッファーリザーバーに追加して、流れを視覚化します。
4. 所望の最終濃度に段階希釈することにより、刺激溶液を作成します。たとえば、最初に10⁻³ストックを作成することにより、ジアセチル誘引剤の¹⁰⁻⁷希釈を作成します。
   注:刺激のタイミングを確認するために、少量のフルオレセイン(0.1〜1 μg / mL)を刺激または緩衝液に追加できますが、神経蛍光のアーティファクトを避けるために濃度を最小限に抑える必要があります。

5. マイクロ流体デバイスの作製

注:貯水池の生成、デバイスのセットアップ、および動物の負荷を示すビデオ^{プロトコルについては、} Reillyら9を参照してください。多くの役立つヒントを含む書面によるプロトコルについては、Lagoy et ^al.17 も参照してください。

1. 3つ以上の液体リザーバーを準備します。それぞれについて、30 mLまたは60 mLのシリンジリザーバー、3 mLのプライミングシリンジ、およびニードルスタブを三方ルアーバルブに取り付けます(図2D)。最後に金属チューブが取り付けられたマイクロボアチューブに針を接続します。リザーバーにラベルを付け、リングスタンドに取り付けられたラックに取り付け、対応するバッファーまたは刺激液で満たします(図2E)。
2. 組み立てたマイクロ流体デバイスを真空デシケーターで~1時間脱気します。
3. プライミングシリンジを使用して、リザーバーチューブから気泡を満たして取り除きます。流出チューブにバッファーを充填します。
4. マイクロ流体デバイスを真空から取り出し、出口チューブをすばやく挿入し、液滴が1つの入口から出てくるまでデバイスを通して流体を注入します。
5. この入口で、「ドロップツードロップ」接続¹⁷ を使用して、対応する流体入口チューブを挿入します(図2F)。気泡が発生しないように、インレットチューブとデバイスポート穴の両方に液滴が存在することを確認してください。
6. 出口からさらに液体を注入し、次の入口チューブを接続し、すべての入口が満たされるまで繰り返します。未使用のインレットとウォームローディングポートに固体ブロッキングピンを挿入します。
7. 入口と出口のルアーバルブを開いて流れを開始します。インレットとガラスベースに漏れがないかデバイスを検査します。ライブモードで顕微鏡画像キャプチャソフトウェアを使用して、流路または入口内の気泡がないかデバイスを検査します。
   注意: 気泡が存在する場合は、気泡がPDMS材料に吸収されるのを待ちます。

6.動物の積載

注:Lagoyら¹⁷を参照してください。

1. ワイヤー先端の「ピック」を使用して、播種されていないNGM寒天プレートに若年成体動物を移します。
2. 動物が泳ぐように、プレートに約5 mLの1x S基礎バッファーを浸します。.
3. ワームをローディングシリンジ(1x Sバサルが事前に充填されたチューブが取り付けられた1 mLまたは3 mLシリンジ)に引き込みます。
   1. ステレオスコープを使用して、片手でチューブの端を液面の下に移動して、目的の動物にそれぞれ移動し、もう一方の手に保持されたシリンジを使用してチューブに引き込みます。
   2. ワームをチューブにのみ引き込み、シリンジには引き込みません。
      注:チューブは通常約100μLしか保持しません。動物は局所的に排出され、その後、少量でチューブに再び引き込まれます。
4. アウトレットラインを閉じ、ウォームローディングピンを取り外し、ドロップツードロップ接続を使用してウォームローディングシリンジをデバイスに接続します。
5. 動物をアリーナに静かに流し込み、バッファーフローを確立し、テトラミソールによる固定化に最大1時間待ちます。
   注意: 固定期間中は、緩衝液のみがアリーナに入るようにしてください。この期間中は刺激リザーバーとコントロールリザーバーをオフにすることができますが、刺激試験を実行する前に、それらを開いて正しい流れを確認してください。

7.自動刺激とニューロン記録

1. 自動画像取得の刺激設定を含むテキストエディタ(メモ帳など)を使用して、「ユーザー定義の画像取得設定.txtという刺激定義テキストファイルを作成します( 図3の例を参照)。設定は、次の 2 つのセクションに分かれています。
   1. 顕微鏡取得設定: 実験タイプ(単一刺激またはマルチパターン)、露光と励起のタイミング、試行期間と間隔を定義し、ディレクトリを保存します。
   2. 刺激設定: 刺激制御パラメータを定義します。「刺激コマンド」は、特定のビデオフレームで発生するアクションを構文<文字コード><フレーム番号>で指定し、文字コードはA =バルブ1、B =バルブ2、C =バルブ3、L = LEDライトです。さらに、大文字 = オン、小文字 = オフです。LED強度は、文字コード「i」と0(オフ)から255(最大輝度)の値で設定されます。
      注意: 0〜255のLED強度値は、出力アナログ電圧を0V〜5Vに設定します。ここで使用される電流コントローラーには線形強度スケーリングがあり、他のコントローラーはライトパワーメーターで校正する必要があります。
      1. 刺激コマンドを1回だけ繰り返す単一刺激実験の場合は、 図3Aの形式を使用します。
      2. 複数の刺激コマンドを使用したマルチパターン実験の場合は、 図3Bの形式を使用します。刺激パターンの順序を表す数字の「パターンシーケンス」を含めます。パターンごとに、刺激コマンドを別々の行に入力します。
         注:擬似ランダムシーケンスまたはmシーケンスは、刺激履歴依存性を調査するのに役立ちます。
2. 顕微鏡制御ソフトウェアを実行します。すべての流体入口が開いていること、アリーナ内で流れが希望どおりであること( 図2Hを参照)、および対象のニューロンがライブウィンドウ内で焦点を合わせていることを確認します。
3. ライブウィンドウを閉じ、ソフトウェア内でスクリプト「MultiPattern_RunScript.bsh」を実行します。
   注:適切な流れと刺激を確認するために、動物なしでテスト実験を実行すると便利です。刺激液ごとに異なるフルオレセイン濃度に置き換えると、新しい刺激パターンを視覚化して文書化するのに役立ちます。
4. 実験後、マイクロ流体デバイスを分解し、すべての表面、チューブ、およびリザーバーを水ですすいでください。
   注意: すべてのコンポーネントは、清潔に保たれていれば何十回も再利用できます。リザーバー、チューブ、およびマイクロ流体デバイスが空気流中で湿潤または完全に乾燥状態に保たれていることを確認して、詰まりや除去が困難な塩の結晶化を防ぎます。デバイスはエタノールで滅菌することができますが、再利用する前に完全に乾燥させる必要があります(65°Cで>1時間)¹⁷。

8. ニューロトラッカーを用いたデータ解析

注:NeuroTracker ^4,18,19は、試験中に複数のニューロンや動物の蛍光強度を追跡するためのImageJ/FIJI 20ソフトウェアプラグインです。このプラグインは、各ニューロンの位置とバックグラウンド補正された蛍光強度(F)を含むデータをテキストファイルとして保存します。蛍光データは、ベースライン蛍光(_F0)、例えば刺激前の数秒の平均をΔF/_F0=(F−F0)/_F0として正規化し、集団間で平均化することができる。

1. 指示に従ってニューロトラッカースクリプトをインストールします(github.com/albrechtLab/Neurotracker)。
2. プラグインをクリックしてニューロトラッカーを実行する |トラッキング |ニューロトラッカー。
3. を含むフォルダを選択します。追跡するTIFビデオファイルを選択し、目的の設定を選択します。
   注: ビデオ ファイルのサブセットのみを追跡する場合は、プロンプトで分析するファイルの数値範囲を選択します。デフォルトのトラッキング設定は、250 pix/mmの解像度の非運動動物に適しています。他の解像度に合わせてパラメータを調整します。設定の詳細については、ユーザーガイド¹⁹ を参照してください。
4. ニューロンが選択のために見えるように強度のしきい値を設定します(図4)。
5. 画像を使用して 明るさ/コントラスト(B / C) および しきい値 コントロールウィンドウを開きます |メニューを調整します 。
6. [B/C] ウィンドウで、ニューロンが明確に区別できるまで [最小] スライダーと [最大] スライダーを調整します (図 4A)。
7. [しきい値]ウィンドウで、[暗い背景]と[範囲をリセットしない]をオンにします。
8. フレームスライダーをスライドさせてニューロンの動きと強度の変化を観察し、他の動物との重複など、追跡から除外する動物に注意を払います。
9. 追跡するニューロンを特定します。
10. 各動物について、ニューロンの上の赤い閾値領域が刺激前、刺激中、および刺激後のすべてのフレームで見えるように閾値レベルを調整します。
11. ニューロンをクリックして、その位置としきい値レベルを記録します。
12. 追跡する動物およびニューロンごとに閾値調整および選択を繰り返す。適切なしきい値レベルの例については図 4C を、しきい値超過としきい値不足の例については 図4D,E を参照してください。以前に選択されたニューロンは小さなボックスで示されます。
13. すべてのニューロンを選択したら、 スペースバー を押して追跡を開始します。
    注: その他の NeuroTracker の例については、以前のリファレンス ^4,19 を参照してください。
14. 各動物の追跡プロセスを監視し、必要な修正を行います。
15. ニューロトラッカーが一時停止すると、ニューロンが失われます。ニューロンを再度クリックし、必要に応じてしきい値レベルを調整します。
16. 統合ボックスが近くの別の動物または非ニューロン構造にジャンプする場合は、 スペースバー を押して一時停止し、 スライダー を最初の誤ったフレームに戻し、正しいニューロンの位置を再度クリックします。

9.データの探索と視覚化

注: MATLAB 分析スクリプトは、データ処理と視覚化、および各分析の要約 PDF の生成に使用されます。

1. MATLAB で "NeuroTrackerSummary_pdf.m" ファイルを実行し、NeuroTracker データ テキスト ファイルを含むフォルダーを選択します。
2. 概要PDFが作成され、追跡プロセスの検証が可能になるまで待ちます(図5)。動物は番号で識別され(図5A)、各動物および試験からの神経応答を表示して、集団変動性を評価することができます(図5B)。
3. 関数「databrowse.m」を使用して、たとえば、試行番号(図5C)、動物番号(図5D)、刺激パターン、または別のカテゴリによるグループ化など、ニューラルデータを探索します。

結果

時間的抑制、適応、脱抑制など、さまざまな神経現象を評価する刺激パターンの例をいくつか紹介します。 時間的抑制 は、最初の提示の直後に起こる第2の刺激呈示に対する神経応答の瞬間的な抑制である¹⁴。この現象をテストするために、ペアパルス実験では、0秒から20秒の範囲の間隔で分離された2つの1秒の匂いパルスからなる8つのパターンが提示されまし...

ディスカッション

このプロトコルでは、さまざまな刺激パターンの時間的に正確な配信を使用して神経活動現象を評価するためのオープンアクセス顕微鏡システムについて説明します。マイクロ流体プラットフォームは、数十匹の動物を顕微鏡の視野に保ちながら、再現性のある刺激を提供します。さまざまな刺激タイミングパターンを簡単にプログラミングできる市販の顕微鏡ソフトウェアパッケージはほ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacterial strains
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	Cat# OP50
Experimental models: Organisms/strains
C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons	Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work	NZ1091, for example
Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies
2,3-Butanedione	Sigma-Aldrich	Cat# B85307	diacetyl, example chemical stimulus
Calcium chloride, CaCl2	Sigma-Aldrich	Cat# C3881
Fluorescein, Sodium salt	Sigma-Aldrich	Cat# F6377
Glass water repellant	Rain-X	Cat #800002250	glass hydrophobic treatment (single-use)
Magnesium chloride, MgCl2	Sigma-Aldrich	Cat# M2393
Nematode Growth Medium (NGM) agar	Genesee	Cat #: 20-273NGM
Petri dishes (60 mm)	Tritech	Cat #T3305
Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184	Dow Chemical	Cat# 1673921
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	Cat# P5655
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	Cat# P8281
Sodium chloride, NaCl	Sigma-Aldrich	Cat# S7653
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS)	Gelest	CAS# 78560-45-9	glass hydrophobic treatment (durable)
Software and algorithms
Arduino IDE	Arduino	https://www.arduino.cc/en/software
ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Micro-manager	Micro-manager	https://micro-manager.org/
Microscope control software	Albrecht Lab	https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl
Neurotracker data analysis software	Albrecht Lab	https://github.com/albrechtLab/Neurotracker
Automated Microscope and Stimulation System
Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar)	Zeiss	Cat #491237-0012-000
Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator	Excelitas	Cat #XYLIS
Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera	Hamamatsu	Cat #C11440-22CU
Arduino nano	Arduino	Cat #A000005
3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12)	Parker	Cat #LQX12-3W24FF48-000	Valve 1: Control
2-way normally-closed (NC) Pinch Valve	Bio-Chem Valve Inc	Cat #075P2-S432	Valve 2: Outflow
3-way Pinch Valve	NResearch	Cat #161P091	Valve 3: Stimulus selection
Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm)	Mightex	Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2
ValveLink 8.2 digital/manual valve controller	AutoMate Scientific	Cat #01-18
Wires and connectors	various	See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021)
Microfluidic Device Preparation
Dremel variable speed rotary cutter 4000	Dremel	Cat #F0134000AB	Set speed to 5k RPM for cutting glass
Dremel drill press rotary tool workstation	Dremel	Cat #220-01
Diamond drill bit	Dremel	Cat #7134
Glass slide, 1 mm thick	VWR	Cat #75799-268
Glass scribe (Diamond scriber)	Ted Pella	Cat #54468
Luer 3-way stopcock	Cole-Parmer	Cat #EW-30600-07
Luer 23 G blunt needle	VWR	Cat #89134-100
Microfluidic device	Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article	N/A
Microfluidic device clamp	Warner Instruments (or machine shop)	P-2
Microfluidic tubing, 0.02″ ID	Cole-Parmer	Cat #EW-06419-01
Tube 19 G, 0.5″	New England Small Tube	Cat #NE-1027-12