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我々は、多くの カエノラブディティス・エレガンス 線虫からの同時神経活動の柔軟な化学的およびマルチモーダル刺激および記録のための方法を提示する。この方法は、マイクロフルイディクス、オープンソースのハードウェアとソフトウェア、および教師ありの自動データ分析を使用して、適応、時間的抑制、刺激クロストークなどの神経現象の測定を可能にします。
蛍光遺伝暗号カルシウム指標は、個々の神経細胞レベルから脳回路全体までの神経動態の理解に大きく貢献しています。しかし、神経反応は、以前の経験、内部状態、または確率的要因によって異なる可能性があるため、一度に多くの個人の神経機能を評価できる方法が必要になります。ほとんどの記録技術は一度に1匹の動物を調べますが、広視野顕微鏡を使用して、ニューロンの記録を数十の カエノラブディティスエレガンス または他のサブミリメートルスケールの生物に一度にスケールアップすることについて説明します。オープンソースのハードウェアとソフトウェアにより、化学的、光学的、機械的、熱的、電磁的刺激など、さまざまな刺激タイプの強度とタイミングを制御する完全に自動化された実験をプログラミングする柔軟性が大幅に向上します。特に、マイクロ流体フローデバイスは、秒未満の時間分解能で化学感覚刺激の正確で再現性のある定量的制御を提供します。次に、NeuroTrackerの半自動データ分析パイプラインは、個人および集団全体の神経反応を抽出して、神経の興奮性とダイナミクスの機能的変化を明らかにします。本論文では、神経細胞の適応、時間的抑制、刺激クロストークの測定例を紹介します。これらの技術は、刺激の精度と再現性を高め、集団の多様性の探索を可能にし、細胞やオルガノイドから生物や植物全体に至るまで、小さな生物系における他の動的蛍光シグナルに一般化できます。
カルシウムイメージング技術は、蛍光顕微鏡および標的細胞で発現される遺伝的にコードされたカルシウム指示薬を使用して、in vivo神経ダイナミクスの非侵襲的記録を可能にしました1,2,3。これらのセンサーは通常、GFP-カルモジュリン-M13ペプチド(GCaMP)ファミリーなどの緑色蛍光タンパク質(GFP)を使用して、ニューロンの活性化と細胞内カルシウムレベルの上昇時に蛍光強度を増加させます。カルシウムイメージングは、線虫C.エレガンスにおいて、ニューロンおよび神経回路が生きた行動動物4,5,6,7,8,9,10においてどのように機能するかを調べるために特に強力であり、その透明な性質は光学的アクセスのための外科的プロセスが不要であり、細胞特異的遺伝子プロモーターは目的の細胞への発現を標的とする。
1. 神経画像機器
注:顕微鏡の照明タイミング、画像取得、および刺激の送達を制御するイメージングおよび刺激システムの構築に関する詳細な手順については、LawlerおよびAlbrecht15を参照してください(図1)。安価なArduino Nano刺激コントローラーは、バルブコントローラーへのデジタル信号を介して流体バルブを作動させ、LEDコントローラーへのアナログ電圧信号を介して光遺伝学的照明を制御します。振動モーターやサーマルヒーターなどの他の刺激は、デジタル信号またはアナログ信号を使用して制御できます。刺激コントローラは、オープンソースのMicro-Manager顕微鏡制御ソフトウェア(μManager)16で指定されているように、カメラ信号を介して刺激と画像記録を同期させます。このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、機器、および生物に関連する詳細については、材料の表を参照してください。
時間的抑制、適応、脱抑制など、さまざまな神経現象を評価する刺激パターンの例をいくつか紹介します。 時間的抑制 は、最初の提示の直後に起こる第2の刺激呈示に対する神経応答の瞬間的な抑制である14。この現象をテストするために、ペアパルス実験では、0秒から20秒の範囲の間隔で分離された2つの1秒の匂いパルスからなる8つのパターンが提示されまし.......
このプロトコルでは、さまざまな刺激パターンの時間的に正確な配信を使用して神経活動現象を評価するためのオープンアクセス顕微鏡システムについて説明します。マイクロ流体プラットフォームは、数十匹の動物を顕微鏡の視野に保ちながら、再現性のある刺激を提供します。さまざまな刺激タイミングパターンを簡単にプログラミングできる市販の顕微鏡ソフトウェアパッケージはほ?.......
著者は開示する利益相反を持っていません。
これらのプロトコルをテストし、原稿をレビューしてくれたFox Avery と、プログラミングの支援をしてくれた Eric Hall に感謝します。ここに提示された方法のための資金は、全米科学財団1724026(D.R.A.)によって部分的に提供された。
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Bacterial strains | |||
E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Cat# OP50 | |
Experimental models: Organisms/strains | |||
C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work | NZ1091, for example | |
Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies | |||
2,3-Butanedione | Sigma-Aldrich | Cat# B85307 | diacetyl, example chemical stimulus |
Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C3881 | |
Fluorescein, Sodium salt | Sigma-Aldrich | Cat# F6377 | |
Glass water repellant | Rain-X | Cat #800002250 | glass hydrophobic treatment (single-use) |
Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# M2393 | |
Nematode Growth Medium (NGM) agar | Genesee | Cat #: 20-273NGM | |
Petri dishes (60 mm) | Tritech | Cat #T3305 | |
Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184 | Dow Chemical | Cat# 1673921 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | Cat# P5655 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | Cat# P8281 | |
Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S7653 | |
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS) | Gelest | CAS# 78560-45-9 | glass hydrophobic treatment (durable) |
Software and algorithms | |||
Arduino IDE | Arduino | https://www.arduino.cc/en/software | |
ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
Micro-manager | Micro-manager | https://micro-manager.org/ | |
Microscope control software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl | |
Neurotracker data analysis software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/Neurotracker | |
Automated Microscope and Stimulation System | |||
Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar) | Zeiss | Cat #491237-0012-000 | |
Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator | Excelitas | Cat #XYLIS | |
Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera | Hamamatsu | Cat #C11440-22CU | |
Arduino nano | Arduino | Cat #A000005 | |
3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12) | Parker | Cat #LQX12-3W24FF48-000 | Valve 1: Control |
2-way normally-closed (NC) Pinch Valve | Bio-Chem Valve Inc | Cat #075P2-S432 | Valve 2: Outflow |
3-way Pinch Valve | NResearch | Cat #161P091 | Valve 3: Stimulus selection |
Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm) | Mightex | Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2 | |
ValveLink 8.2 digital/manual valve controller | AutoMate Scientific | Cat #01-18 | |
Wires and connectors | various | See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021) | |
Microfluidic Device Preparation | |||
Dremel variable speed rotary cutter 4000 | Dremel | Cat #F0134000AB | Set speed to 5k RPM for cutting glass |
Dremel drill press rotary tool workstation | Dremel | Cat #220-01 | |
Diamond drill bit | Dremel | Cat #7134 | |
Glass slide, 1 mm thick | VWR | Cat #75799-268 | |
Glass scribe (Diamond scriber) | Ted Pella | Cat #54468 | |
Luer 3-way stopcock | Cole-Parmer | Cat #EW-30600-07 | |
Luer 23 G blunt needle | VWR | Cat #89134-100 | |
Microfluidic device | Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article | N/A | |
Microfluidic device clamp | Warner Instruments (or machine shop) | P-2 | |
Microfluidic tubing, 0.02″ ID | Cole-Parmer | Cat #EW-06419-01 | |
Tube 19 G, 0.5″ | New England Small Tube | Cat #NE-1027-12 |
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