Otomatik Multimodal Stimülasyon ve Birden Çok Küçük Organizmadan Eşzamanlı Nöronal Kayıt

Özet

Birçok Caenorhabditis elegans solucanından esnek kimyasal ve multimodal stimülasyon ve eşzamanlı nöral aktivitenin kaydedilmesi için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, adaptasyon, zamansal inhibisyon ve uyaran çapraz konuşması gibi nöronal fenomenlerin ölçülmesini sağlamak için mikroakışkanlar, açık kaynaklı donanım ve yazılım ve denetimli otomatik veri analizi kullanır.

Özet

Floresan genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri, bireysel nöronların seviyesinden tüm beyin devrelerine kadar nöral dinamikleri anlamamıza büyük katkıda bulunmuştur. Bununla birlikte, nöral tepkiler önceki deneyimlere, içsel durumlara veya stokastik faktörlere bağlı olarak değişebilir, bu nedenle birçok bireyde aynı anda nöral fonksiyonu değerlendirebilecek yöntemlere ihtiyaç duyulur. Çoğu kayıt tekniği bir seferde tek bir hayvanı incelerken, nöronal kayıtları aynı anda düzinelerce Caenorhabditis elegans veya diğer milimetre altı ölçekli organizmalara ölçeklendirmek için geniş alan mikroskobunun kullanımını açıklıyoruz. Açık kaynaklı donanım ve yazılım, kimyasal, optik, mekanik, termal ve elektromanyetik uyaranlar dahil olmak üzere çeşitli uyaran türlerinin yoğunluğunu ve zamanlamasını kontrol eden tam otomatik deneylerin programlanmasında büyük esneklik sağlar. Özellikle, mikroakışkan akış cihazları, kemosensoriyel uyaranların saniyenin altında çözünürlükle hassas, tekrarlanabilir ve kantitatif kontrolünü sağlar. NeuroTracker yarı otomatik veri analizi boru hattı daha sonra sinirsel uyarılabilirlik ve dinamiklerdeki fonksiyonel değişiklikleri ortaya çıkarmak için bireysel ve popülasyon çapında sinirsel tepkileri çıkarır. Bu yazıda nöronal adaptasyon, temporal inhibisyon ve uyaran crosstalk'unun ölçülmesine ilişkin örnekler sunulmaktadır. Bu teknikler stimülasyonun hassasiyetini ve tekrarlanabilirliğini arttırır, popülasyon değişkenliğinin araştırılmasına izin verir ve hücrelerden ve organoidlerden tüm organizmalara ve bitkilere kadar küçük biyosistemlerdeki diğer dinamik floresan sinyallere genellenebilir.

Giriş

Kalsiyum görüntüleme teknikleri, floresan mikroskobu ve hedef hücrelerde^eksprese edilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri ^1,2,3 kullanılarak in vivo nöral dinamiklerin gerçek zamanlı olarak noninvaziv olarak kaydedilmesini sağlamıştır. Bu sensörler tipik olarak, nöronal aktivasyon ve yüksek hücre içi kalsiyum seviyeleri üzerine floresan yoğunluğunu arttırmak için GFP-kalmodulin-M13 peptid (GCaMP) ailesi gibi yeşil bir floresan protein (GFP) kullanır. Kalsiyum görüntüleme, nöronların ve nöral devrelerin canlılarda nasıl çalıştığını incelemek için özellikle nematod C. elegans'ta güçlü olmuştur,^{hayvanlar 4,5,6,7,8,9,10'da} davranır^, çünkü şeffaf doğaları optik erişim için cerrahi bir işlem gerekmediği anlamına gelir ve hücreye özgü gen promotörleri ilgili hücrelere ekspresyonu hedefler. Bu teknikler genellikle biyolojik, kimyasal ve fiziksel olayları küçük bir fiziksel ölçekte incelemek için hassas bir şekilde kontrol edilen ortamlar sağlayan mikroakışkan cihazlardan yararlanır^11,12. Mikroakışkan cihazlar, nöral aktiviteyi ölçmek için bolca bulunur, yeni tasarımlar sürekli geliştirilmektedir ve araştırma laboratuvarında kolayca üretilmektedir. Bununla birlikte, birçok tasarım aynı anda tek bir hayvanı yakalar ve deneysel verimi ^7,9,13 ile sınırlar. Nöral tepkiler genellikle önceki deneyimlerdeki farklılıklar, stres veya açlık gibi içsel durumlar veya gen ekspresyon seviyeleri gibi stokastik faktörler nedeniyle hayvanlar arasında önemli ölçüde değişir. Bu farklılıklar, aynı anda birçok hayvanı uyarabilen ve gözlemleyebilen ve bireylerden bilgi çıkarabilen yöntemlere ihtiyaç duymaktadır⁴.

Ek olarak, bazı nöromodülatör fenomenler sadece zamansal inhibisyon¹⁴ gibi spesifik stimülasyon koşulları altında belirginleşir; bu, stimülasyon hızlı bir şekilde art arda gerçekleştiğinde yanıtların kısa sürede bastırılmasını ifade eder. Elektrofizyolojik sistemler, bu amaçla geniş bir uyaran alanı boyunca nöral aktiviteyi yönlendirebilir, örneğin elektrik darbe akımını, voltajı, frekansı, dalga formunu, görev döngüsünü ve periyodik uyaran trenlerinin zamanlamasını modüle edebilir. Doğal olarak tespit edilen uyaranlar veya optogenetik sistemler tarafından dolaylı stimülasyon, benzer bir kontrol mekanizması genişliğinden yararlanacaktır. Şu anda, birçok doğal uyaran, esneklik eklemek için yavaş olan ticari sistemler kullanılarak, koku sunumu ve giderilmesi gibi basit bir "açma-kapama" şeklinde sunulmaktadır. Bununla birlikte, ucuz mikrodenetleyiciler artık araştırmacıların ihtiyaçlarına göre özelleştirilebilecek şekilde çeşitli uyaran türlerinin dağıtımını otomatikleştirebilir. Mikroakışkanlarla birleştirildiğinde, bu sistemler deneysel verimi ve esnekliği artırma hedefine ulaşmıştır ve çeşitli hassas uyaranlara sinirsel tepkilerin birçok hayvanda aynı anda ölçülmesine izin vermiştir ^4,6. Multimodal stimülasyon, nöronal devreyi daha fazla sorgulamak için kullanılabilir, örneğin ilaç maruziyeti gibi ortogonal bir pertürbasyondan önce, sırasında ve sonrasında sürekli olarak uyarılırken nöral uyarılabilirlikteki değişiklikleri izleyerek⁴. Ucuz, açık mikroskopi sistemlerinin faydaları, bilimsel araştırmayı ilerletmek için açıktır, ancak pratikte, parça tedariki, inşaat ve performans doğrulamasına duyulan ihtiyaç, bu tekniklerin benimsenmesini engelleyebilir.

Bu protokol, bu teknik zorlukların bazılarını hafifletmeyi amaçlamaktadır. Önceki protokoller mikroakışkan cihaz kullanımı ve temel stimülasyon 9,15,17'ye odaklanmış olsa da, burada C. elegans veya daha önce tarif edilen mikroakışkan cihazları kullanan diğer küçük organizmalarda nöral görüntüleme için esnek, otomatik^, multimodal bir uyaran dağıtım sisteminin inşasını ve kullanımını açıklıyoruz⁴. Açık kaynaklı sistem, deneyleri tanımlamak için basit metin dosyaları aracılığıyla programlanır ve NeuroTracker veri analiz programı, sinirsel aktivite verilerini mikroskop videolarından yarı otomatik olarak çıkarır. Bu sistemi, farklı gıda kokularına yanıt olarak veya optogenetik ışığa duyarlı iyon kanallarını eksprese ederken ışığa tepki olarak depolarize olan kemosensoriyel nöron AWA'yı kullanarak zamansal inhibisyon, disinhibisyon ve uyaran çapraz konuşmasını değerlendirme örnekleriyle gösteriyoruz^5,6.

Protokol

1. Nöral görüntüleme ekipmanları

NOT: Mikroskop aydınlatma zamanlamasını, görüntü alımını ve uyaran dağıtımını kontrol eden görüntüleme ve stimülasyon sisteminin oluşturulmasıyla ilgili ayrıntılı talimatlar için Lawler ve Albrecht^15'e bakınız (Şekil 1). Ucuz bir Arduino Nano uyaran kontrolörü, akışkan valfleri dijital sinyaller yoluyla bir valf kontrolörüne harekete geçirir ve optogenetik aydınlatmayı bir LED kontrolörüne analog voltaj sinyalleri yoluyla kontrol eder. Titreşim motorları ve termal ısıtıcılar gibi diğer uyaranlar, dijital veya analog sinyaller kullanılarak kontrol edilebilir. Uyaran kontrolörü, açık kaynaklı Micro-Manager mikroskop kontrol yazılımı (μManager)¹⁶ tarafından belirtildiği gibi stimülasyonu ve görüntü kaydını kamera sinyalleri aracılığıyla senkronize eder. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler, ekipman ve organizmalarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. GFP optikli bir epifloresan mikroskop, dijital pozlama çıkış sinyaline sahip bir sCMOS kamera ve bir uyaran denetleyicisi¹⁵ dahil olmak üzere nöral görüntüleme ekipmanını kurun.
2. Uyaran kontrolörünü dijital veya analog sinyaller aracılığıyla istenen sistemlere bağlayın. Aşağıda sunulan örnekler için aşağıdaki sistemler kullanılmıştır:
   1. Kimyasal stimülasyon için bir valf kontrolörü kullanın. Valf kontrolörünü akışkan solenoid veya kıstırma valflerine bağlayın (Şekil 1)¹⁵.
   2. Mikroskop aşamasının üzerine monte edilmiş optogenetik stimülasyon için 615 nm kırmızı LED ve denetleyici kullanın.
3. Bilgisayarı mikroskop kontrol yazılımı ile kurun, ekipman ayarlarıyla bir Yapılandırma Ön Ayarı oluşturun ve uyaran kontrolünün düzgün çalışmasını sağlayın¹⁵.

2. Mikroakışkan cihaz imalatı

NOT: Ana kalıpların elde edilmesi veya imal edilmesi ve mikroakışkan cihazların üretimi, kullanımı ve temizlenmesi hakkında ayrıntılı bilgi için Lagoy ve ^ark.17'ye bakınız. Bu adımlar aşağıda özetlenmiştir.

1. Sağlanan mikroakışkan tasarım dosyasını kullanarak bir ana kalıp elde edin veya imal edin (albrechtlab.github.io/microfluidics)¹⁷. Genç yetişkin C. elegans için, kanal yüksekliğinin 55-70 μm olduğundan emin olun.
2. PDMS tabanını ve kürleme maddesini ağırlıkça 10:1 oranında birleştirin ve transfer pipetleriyle iyice karıştırın.
3. Kabarcıklar kaybolana kadar vakumlu kurutucuda 30-60 dakika boyunca gazdan arındırılır.
4. Ana kalıbı büyük (150 mm çapında) bir Petri kabına yerleştirin ve gazdan arındırılmış PDMS'yi 4-5 mm (~ 100 g) derinliğe kadar dökün. Toz veya kabarcıkları bir transfer pipeti ile kontrol edin ve temizleyin.
5. 65 °C'de düz bir fırın rafında 3 saatten gece boyunca pişirin.
6. Kürlendikten sonra, PDMS'yi kalıptan kesmek için bir neşter ve cihazları ayırmak için düz bir tıraş bıçağı kullanın.
7. Giriş ve çıkış deliklerini 1 mm'lik bir dermal zımba kullanarak delin ve bunları dH 2 O, etanol ve tekrar dH₂O ile temizleyin.
8. PDMS cihazının her iki tarafını da yapışkan bantla temizleyerek toz veya kalıntıları temizleyin.
9. Mikroakışkan cihazı^17'de açıklandığı gibi tamamlamak için cam slaytları hazırlayın. Bir elmas ucu kullanarak üst slaytta giriş delikleri açın ve TFOCS buharlarına maruz bırakarak veya su itici cam işlemi uygulayarak alt slaytı hidrofobik hale getirin (Şekil 2B).
10. Cam-PDMS cihazı sandviçini bir kelepçeye monte edin (Şekil 2C).

3. Hayvan hazırlama

1. İlgilenilen nöronlarda ifade edilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerine sahip hayvanlar elde edin veya oluşturun.
   NOT: Örneğin, satır NZ1091 (kyIs587 [gpa-6p::GCaMP2.2b; unc-122p::d sRed]; kyIs5662 [odr-7p::Chrimson:SL2:mCherry; elt-2p::mCherry]) GCaMP ve kırmızı ışığa duyarlı katyon kanalı Chrimson'u AWA duyusal nöron çifti^6'da ifade eder. Her iki transgen de her hayvanda kararlı ekspresyon için genoma entegre edilmiştir.
2. Deneyden bir gün önce, deney başına en az 20 L4 larva aşaması C. elegans'ı , bir OP50 E. coli çimi ile tohumlanmış bir nematod büyüme ortamı (NGM) agar plakasına yerleştirin. 20 ° C'de tutulduğunda, bu, ertesi gün genç yetişkin aşamasında vahşi tip hayvanları senkronize edecektir.
   NOT: Dizi transgenleri için, seçilen hayvanlarda transgen ekspresyonunu sağlamak için floresan stereoskop kullanarak hayvanları seçin.

4. Çözelti hazırlama

1. 10x stok çözeltisinden 1x S Bazal tampon (100 mM NaCl ve 0,05 M KPO₄, pH 6,0) hazırlayın.
2. 1x S Bazal'da 1 M stoğu seyrelterek 1 mM tetramisol tamponu hazırlayın. Tüm uyaranları hazırlamak için bu paralitik tamponu kullanın. Bir deney genellikle yaklaşık 150 mL kullanır.
3. Akışı görselleştirmek için "kontrol" tampon rezervuarlarına 0,1-1 μg/mL floresein ekleyin.
4. İstenilen son konsantrasyona seri seyreltme ile uyaran çözeltileri oluşturun. Örneğin, önce ^10-3 stok oluşturarak diasetil çekicinin ^10-7 seyreltilmesini oluşturun.
   NOT: Uyaran zamanlamasını doğrulamak için uyarana veya tampon çözeltisine az miktarda floresein (0.1–1 μg / mL) eklenebilir, ancak nöral floresandaki artefaktları önlemek için konsantrasyon minimum düzeyde olmalıdır.

5. Mikroakışkan cihaz hazırlama

NOT: Rezervuar üretimini, cihaz kurulumunu ve hayvanların yüklenmesini gösteren bir video protokolü için Reilly et ^al.9'a bakınız. Ayrıca birçok yararlı ipucu içeren yazılı bir protokol için Lagoy ve ^ark.17'ye bakınız.

1. Üç veya daha fazla sıvı rezervuarı hazırlayın. Her biri için, üç bir Luer valfine 30 mL veya 60 mL şırınga haznesi, 3 mL astar şırıngası ve bir iğne saplaması takın (Şekil 2D). İğneyi sonunda metal bir tüp bulunan mikro delikli boruya bağlayın. Rezervuarları etiketleyin, halka standına bağlı bir rafa monte edin ve karşılık gelen tampon veya uyaran sıvılarıyla doldurun (Şekil 2E).
2. Toplanan mikroakışkan cihazın gazını ~ 1 saat boyunca bir vakum kurutucuda çözün.
3. Astar şırıngasını kullanarak hava kabarcıklarını rezervuar borusundan doldurun ve çıkarın. Çıkış borusunu tamponla doldurun.
4. Mikroakışkan cihazı vakumdan çıkarın ve çıkış borusunu hızlı bir şekilde yerleştirin ve bir girişten bir damlacık çıkana kadar sıvıyı cihazdan enjekte edin.
5. Bu girişte, karşılık gelen akışkan giriş tüpünü yerleştirmek için bir "damladan damlaya" bağlantı¹⁷ kullanın (Şekil 2F). Kabarcık oluşmasını önlemek için hem giriş borusunda hem de cihaz bağlantı noktası deliğinde sıvı damlalarının bulunduğundan emin olun.
6. Çıkıştan daha fazla sıvı enjekte edin, bir sonraki giriş tüpünü bağlayın ve tüm girişler dolana kadar tekrarlayın. Kullanılmayan girişlere ve sonsuz yükleme portuna sağlam bir engelleme pimi yerleştirin.
7. Giriş ve çıkış Luer valflerini açarak akışı başlatın. Cihazı girişlerde ve cam tabanda sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Canlı modda mikroskop görüntü yakalama yazılımını kullanarak cihazı akış kanalları veya girişler içindeki kabarcıklar açısından inceleyin.
   NOT: Kabarcıklar varsa, PDMS malzemesine emilmelerini bekleyin.

6. Hayvan yükleme

NOT: Bkz. Lagoy ve ^ark.17.

1. Genç yetişkin hayvanları, tel uçlu bir "toplama" kullanarak tohumlanmamış bir NGM agar plakasına aktarın.
2. Plakayı, hayvanların yüzeceği şekilde yaklaşık 5 mL 1x S Bazal tamponla doldurun.
3. Solucanları bir yükleme şırıngasına çekin (1x S Bazal ile önceden doldurulmuş bağlı borulu 1 mL veya 3 mL şırınga).
   1. Bir stereoskop kullanarak, boru ucunu bir elinizle sıvı yüzeyin altına istediğiniz her hayvana hareket ettirin ve diğer elinizde tutulan şırıngayı kullanarak boruya çekin.
   2. Solucanları şırıngaya değil, sadece boruya çekin.
      NOT: Boru tipik olarak sadece yaklaşık 100 μL tutar. Hayvanlar yerel bir alana atılabilir ve daha sonra küçük bir hacimle tekrar boruya çekilebilir.
4. Çıkış hattını kapatın, solucan yükleme pimini çıkarın ve solucan yükleme şırıngasını bir damladan damlaya bağlantı kullanarak cihaza bağlayın.
5. Hayvanları yavaşça arenaya akıtın, tampon akışı sağlayın ve tetramisol ile immobilizasyon için 1 saate kadar bekleyin.
   NOT: İmmobilizasyon süresi boyunca, arenaya sadece tampon sıvısının girdiğinden emin olun. Uyaran ve kontrol rezervuarları bu süre zarfında kapatılabilir, ancak stimülasyon denemelerini çalıştırmadan önce bunları açın ve doğru akışı doğrulayın.

7. Otomatik stimülasyon ve nöronal kayıt

1. Otomatik görüntü alımı için stimülasyon ayarlarını içeren bir metin düzenleyicisiyle (örneğin, Not Defteri) "Kullanıcı Tanımlı Edinme Ayarları.txt" adlı bir uyaran tanımı metin dosyası oluşturun ( bkz. Şekil 3'teki örnekler). Ayarlar iki bölüme ayrılmıştır:
   1. Mikroskop edinme ayarları: Deney türünü (Tek Uyaran veya Çok Desenli), maruz kalma ve uyarma zamanlamasını, deneme süresini ve aralıklarını tanımlayın ve dizini kaydedin.
   2. Stimülasyon ayarları: Uyaran kontrol parametrelerini tanımlayın. Bir "uyarım komutu", harf kodlarının A = valve1, B = valve2, C = valve3, L = LED ışığı olduğu sözdizimi ile belirli video karelerinde gerçekleşen eylemleri belirtir; Ayrıca, büyük harf = açık ve küçük harf = kapalı. LED yoğunluğu, "i" harf kodu ve 0 (kapalı) ila 255 (maksimum parlaklık) değeri ile ayarlanır.
      NOT: 0 ila 255 arasındaki LED yoğunluk değeri, çıkış analog voltajını 0 V ila 5 V arasında ayarlar. Burada kullanılan akım kontrolörü doğrusal bir yoğunluk ölçeklendirmesine sahiptir ve diğerleri bir ışık gücü ölçer ile kalibre edilmelidir.
      1. Yalnızca bir tekrarlanan uyarım komutu içeren bir Tek Uyaran deneyi için, Şekil 3A'daki biçimi kullanın.
      2. Birden çok stimülasyon komutu içeren Çok Desenli bir deney için, Şekil 3B'deki biçimi kullanın. Uyaran desenlerinin sırasını temsil eden basamaklardan oluşan bir "Desen Dizisi" ekleyin. Her desen için ayrı bir satıra bir uyarım komutu girin.
         NOT: Bir sözde rasgele dizi veya m-dizisi, uyaran geçmişi bağımlılığını araştırmak için yararlı olabilir.
2. Mikroskop kontrol yazılımını çalıştırın. Tüm akışkan girişlerin açık olduğunu, akışın arena içinde istenildiği gibi olduğunu (bkz. Şekil 2H) ve ilgilenilen nöronların canlı pencerede odaklandığını doğrulayın.
3. Canlı pencereyi kapatın ve yazılım içinde "MultiPattern_RunScript.bsh" betiğini çalıştırın.
   NOT: Doğru akışı ve stimülasyonu doğrulamak için hayvanlar olmadan bir test deneyi yapmak yararlıdır. Her uyaran sıvısı için farklı bir floresein konsantrasyonunun değiştirilmesi, yeni uyaran modellerinin görselleştirilmesine ve belgelenmesine yardımcı olabilir.
4. Deneyden sonra, mikroakışkan cihazı sökün ve tüm yüzeyleri, boruları ve rezervuarları suyla durulayın.
   NOT: Tüm bileşenler temiz tutulursa düzinelerce kez tekrar kullanılabilir. Tıkanabilen ve çıkarılması zor olan tuz kristalleşmesini önlemek için rezervuarların, boruların ve mikroakışkan cihazların bir hava akımında ıslak veya tamamen kurutulmuş halde tutulduğundan emin olun. Cihazlar sterilize etmek için etanol içinde tutulabilir, ancak yeniden kullanımdan önce tamamen kurutulmalıdır (65 ° C'de >1 saat)¹⁷.

8. NeuroTracker kullanarak veri analizi

NOT: NeuroTracker 4,18,19^, denemeler sırasında hareket ederken bile çoklu nöronların ve hayvanların floresan yoğunluğunu izlemek için bir ImageJ / FIJI²⁰ yazılım eklentisidir. Bu eklenti, verileri her nöronun konumu ve arka plan düzeltilmiş floresan yoğunluğu (F) ile metin dosyaları olarak kaydeder. Floresan verileri, örneğin stimülasyondan önceki birkaç saniyenin ortalaması olan temel floresana (F 0) normalleştirilir, çünkü popülasyonlar arasında ortalaması alınabilen Δ F / F 0 = (F -F 0) / F ₀.

1. NeuroTracker komut dosyalarını talimat verildiği şekilde yükleyin (github.com/albrechtLab/Neurotracker).
2. Eklentiler'e tıklayarak NeuroTracker'ı çalıştırın | Takip | NeuroTracker.
3. öğesini içeren klasörü seçin. İzlenecek TIF video dosyalarını seçin ve istediğiniz ayarları seçin.
   NOT: Video dosyalarının yalnızca bir alt kümesi izlenecekse, istemde analiz edilecek dosyaların sayısal aralığını seçin. Varsayılan izleme ayarları, 250 piksel/mm çözünürlükte hareketsiz hayvanlar için uygundur. Diğer çözünürlükler için parametreleri orantılı olarak ayarlayın. Daha fazla ayar bilgisi için Kullanım Kılavuzu^19'a bakın.
4. Yoğunluk eşiğini, nöronlar seçilim için görünür olacak şekilde ayarlayın (Şekil 4).
5. Parlaklık/ Kontrast (S/C) ve Eşik denetimi pencerelerini Görüntü | Menüyü ayarlayın .
6. B/C penceresinde, nöronlar açıkça ayırt edilebilene kadar Minimum ve Maksimum kaydırıcıları ayarlayın (Şekil 4A).
7. Eşik penceresinde, Koyu arka plan ve Aralığı Sıfırlama'yı işaretleyin.
8. Nöron hareketini ve yoğunluk değişikliklerini gözlemlemek için çerçeve kaydırıcısını kaydırın ve diğer hayvanlarla örtüşme nedeniyle izleme dışında bırakılacak hayvanları not edin.
9. İzleme için nöronları tanımlayın.
10. Her hayvan için, eşik seviyesini, nöronun üzerindeki kırmızı eşik alanı, stimülasyondan önce, sırasında ve sonrasında her karede görülebilecek şekilde ayarlayın.
11. Konumunu ve eşik seviyesini kaydetmek için nörona tıklayın.
12. İzlenecek her hayvan ve nöron için eşik ayarını ve seçimini tekrarlayın. İyi bir eşik düzeyi örneği için Şekil 4C'ye, eşik üstü ve eşik altı örnekler için Şekil 4D,E'ye bakın. Daha önce seçilen nöronlar küçük bir kutu ile gösterilir.
13. Tüm nöronlar seçildiğinde, izlemeye başlamak için boşluk çubuğuna basın.
    NOT: Ek NeuroTracker örnekleri için, önceki referanslar ^4,19'a bakın.
14. Her hayvan için izleme sürecini izleyin ve gerekli düzeltmeleri yapın.
15. NeuroTracker duraklarsa, nöronu kaybetmiştir. Nörona tekrar tıklayın ve eşik seviyesini gerektiği gibi ayarlayın.
16. Entegrasyon kutusu yakındaki başka bir hayvana veya nöronal olmayan yapıya atlarsa, duraklatmak için boşluk çubuğuna basın, kaydırıcıyı ilk hatalı kareye geri getirin ve doğru nöron konumuna yeniden tıklayın.

9. Veri keşfi ve görselleştirme

NOT: MATLAB analiz komut dosyası, veri işleme ve görselleştirme için ve her analiz için özet PDF'ler oluşturmak için kullanılır.

1. MATLAB'da "NeuroTrackerSummary_pdf.m" dosyasını çalıştırın ve NeuroTracker veri metin dosyalarını içeren klasörü seçin.
2. İzleme sürecinin doğrulanmasına izin veren bir özet PDF'nin üretilmesini bekleyin (Şekil 5). Hayvanlar bir sayı ile tanımlanır (Şekil 5A) ve popülasyon değişkenliğini değerlendirmek için her hayvandan ve denemeden gelen sinirsel tepkiler görüntülenebilir (Şekil 5B).
3. Nöral verileri keşfetmek için "databrowse.m" işlevini kullanın, örneğin, deneme numarasına (Şekil 5C), hayvan sayısına (Şekil 5D), stimülasyon modeline veya başka bir kategoriye göre gruplandırma.

Sonuçlar

Zamansal inhibisyon, adaptasyon ve disinhibisyon dahil olmak üzere farklı nöral fenomenleri değerlendiren uyaran modellerinin birkaç örneğini sunuyoruz. Temporal inhibisyon , ilk sunumdan kısa bir süre sonra meydana gelen ikinci bir uyaran sunumuna karşı nöral bir yanıtın anlık olarak bastırılmasıdır¹⁴. Bu fenomeni test etmek için, bir çift darbe deneyinde, 0 s ila 20 s arasında değişen bir aralıkla ayrılmış iki 1 s koku verici darbeden oluşan sekiz de...

Tartışmalar

Bu protokolde, farklı uyaran modellerinin geçici olarak hassas bir şekilde verilmesini kullanarak nöral aktivite fenomenlerinin değerlendirilmesi için açık erişimli bir mikroskopi sistemi tarif ediyoruz. Mikroakışkan platform, onlarca hayvanı mikroskop görüş alanında tutarken tekrarlanabilir uyaranlar sağlar. Birkaç ticari mikroskopi yazılım paketi, çeşitli uyaran zamanlama modellerinin ve genellikle her bir modelin veya tescilli dosya formatlarının manuel olarak girilmesini gerektiren programlar?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacterial strains
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	Cat# OP50
Experimental models: Organisms/strains
C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons	Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work	NZ1091, for example
Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies
2,3-Butanedione	Sigma-Aldrich	Cat# B85307	diacetyl, example chemical stimulus
Calcium chloride, CaCl2	Sigma-Aldrich	Cat# C3881
Fluorescein, Sodium salt	Sigma-Aldrich	Cat# F6377
Glass water repellant	Rain-X	Cat #800002250	glass hydrophobic treatment (single-use)
Magnesium chloride, MgCl2	Sigma-Aldrich	Cat# M2393
Nematode Growth Medium (NGM) agar	Genesee	Cat #: 20-273NGM
Petri dishes (60 mm)	Tritech	Cat #T3305
Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184	Dow Chemical	Cat# 1673921
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	Cat# P5655
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	Cat# P8281
Sodium chloride, NaCl	Sigma-Aldrich	Cat# S7653
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS)	Gelest	CAS# 78560-45-9	glass hydrophobic treatment (durable)
Software and algorithms
Arduino IDE	Arduino	https://www.arduino.cc/en/software
ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Micro-manager	Micro-manager	https://micro-manager.org/
Microscope control software	Albrecht Lab	https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl
Neurotracker data analysis software	Albrecht Lab	https://github.com/albrechtLab/Neurotracker
Automated Microscope and Stimulation System
Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar)	Zeiss	Cat #491237-0012-000
Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator	Excelitas	Cat #XYLIS
Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera	Hamamatsu	Cat #C11440-22CU
Arduino nano	Arduino	Cat #A000005
3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12)	Parker	Cat #LQX12-3W24FF48-000	Valve 1: Control
2-way normally-closed (NC) Pinch Valve	Bio-Chem Valve Inc	Cat #075P2-S432	Valve 2: Outflow
3-way Pinch Valve	NResearch	Cat #161P091	Valve 3: Stimulus selection
Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm)	Mightex	Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2
ValveLink 8.2 digital/manual valve controller	AutoMate Scientific	Cat #01-18
Wires and connectors	various	See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021)
Microfluidic Device Preparation
Dremel variable speed rotary cutter 4000	Dremel	Cat #F0134000AB	Set speed to 5k RPM for cutting glass
Dremel drill press rotary tool workstation	Dremel	Cat #220-01
Diamond drill bit	Dremel	Cat #7134
Glass slide, 1 mm thick	VWR	Cat #75799-268
Glass scribe (Diamond scriber)	Ted Pella	Cat #54468
Luer 3-way stopcock	Cole-Parmer	Cat #EW-30600-07
Luer 23 G blunt needle	VWR	Cat #89134-100
Microfluidic device	Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article	N/A
Microfluidic device clamp	Warner Instruments (or machine shop)	P-2
Microfluidic tubing, 0.02″ ID	Cole-Parmer	Cat #EW-06419-01
Tube 19 G, 0.5″	New England Small Tube	Cat #NE-1027-12