عزل وزراعة الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الدهون بطريقة مبتكرة خالية من الجينات الخارجية للعلاج البشري

Summary

ترتبط المنتجات Xenogenec (الكيميائية أو المشتقة من الحيوانات) التي يتم إدخالها في خطوات تحضير / معالجة العلاج بالخلايا بزيادة خطر التفاعل المناعي وانتقال مسببات الأمراض في المرضى المضيفين. هنا ، يتم وصف طريقة كاملة خالية من xenogenec لعزل وتوسيع الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الدهون في المختبر .

Abstract

وبالنظر إلى التأثير المتزايد للعلاج بالخلايا الجذعية، أثيرت شواغل تتعلق بالسلامة البيولوجية فيما يتعلق بالتلوث المحتمل أو انتقال العدوى بسبب إدخال المنتجات المشتقة من الحيوانات أثناء التلاعب في المختبر . يمكن أن ترتبط المكونات الغريبة ، مثل كولاجيناز أو مصل الجنين البقري ، الذي يشيع استخدامه أثناء عزل الخلايا وخطوات التوسع بالمخاطر المحتملة للتفاعل المناعي أو العدوى الفيروسية والبكتيرية والبريون في المرضى المستقبلين. باتباع إرشادات ممارسات التصنيع الجيدة ، يجب تجنب تفكك الأنسجة الكيميائية ، بينما يمكن استبدال مصل الأبقار الجنيني (FBS) بمكملات خالية من الزينوجينيك. علاوة على ذلك ، لضمان سلامة المنتجات الخلوية ، من المهم تحديد طرق أكثر موثوقية وقابلة للتكرار. لقد طورنا طريقة مبتكرة وخالية تماما من الزينوجينيا لعزل الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الدهون وتوسيعها في المختبر دون تغيير خصائصها مقارنة بالبروتوكولات القياسية المستزرعة بالكولاجيناز FBS. هنا ، تم عزل الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الدهون (hASCs) من الأنسجة الدهنية البطنية. تم فرم العينة ميكانيكيا بمقص / مشرط ، وتم تشريحها بدقة وتشتيتها ميكانيكيا في طبق بتري 10 سم ، وتحضيرها بشقوق مشرط لتسهيل ربط شظايا الأنسجة وهجرة hASCs. بعد خطوات الغسيل ، تم اختيار hASCs بسبب التصاق البلاستيك دون هضم إنزيمي. تم استزراع hASCs المعزولة بوسط مكمل بمحلول الصفائح الدموية البشري الخالي من الهيبارين بنسبة 5٪ وفصله ببديل التربسين الخالي من الحيوانات. باتباع توجيهات ممارسات التصنيع الجيدة (GMP) بشأن إنتاج منتجات الخلايا المخصصة للعلاج البشري ، لم يتم استخدام أي مضادات حيوية في أي وسائط ثقافية.

Introduction

في العقود الماضية ، أدى الطلب المتزايد على العلاجات العلاجية المبتكرة إلى بذل جهود كبيرة واستثمار الموارد في مجال الطب الانتقالي¹. ترتبط المنتجات القائمة على الخلايا بالمخاطر التي يحددها مصدر الخلية ، وعملية التصنيع (العزل ، أو التوسع ، أو التعديل الوراثي) ، والمكملات غير الخلوية (الإنزيمات ، وعوامل النمو ، ومكملات الثقافة ، والمضادات الحيوية) ، وتعتمد عوامل الخطر هذه على المؤشر العلاجي المحدد. يمكن أن تتأثر جودة وسلامة وفعالية المنتج النهائي بعمق بالعناصر المشار إليها أعلاه². يتطلب العلاج بالخلايا الجذعية الالتزام بمبادئ السلامة البيولوجية. يمكن أن تكون المخاطر المحتملة لانتقال مسببات الأمراض مع المنتجات المشتقة من الحيوانات في زراعة الخلايا مشكلة ، والاختبار الشامل لأي منتج يتم إدخاله في التصنيع ضروري³.

تتضمن الطريقة التقليدية لعزل الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الدهون (hASCs) عملية هضم إنزيمية يتم إجراؤها باستخدام كولاجيناز تليها خطوات غسيل من خلال الطرد المركزي⁴. في حين أن العزل الأنزيمي يعتبر عموما أكثر كفاءة من التقنيات الميكانيكية الأخرى من حيث غلة الخلايا وصلاحيتها ، فإن المكونات المشتقة من الحيوانات المستخدمة ، مثل الكولاجين ، تعتبر أكثر من الحد الأدنى من التلاعب بها من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية. هذا يعني أن هناك خطرا متزايدا بشكل كبير من ردود الفعل المناعية أو انتقال المرض ، مما يحد من ترجمة علاج hASC إلى الإعدادات السريرية ^5,6.

الهضم القائم على التربسين هو بروتوكول إنزيمي آخر لعزل ASCs. تم وصف تقنيات مختلفة مع تعديلات طفيفة من حيث تركيز التربسين وسرعة الطرد المركزي ووقت الحضانة. لسوء الحظ ، لم يتم وصف هذه الطريقة بشكل جيد ، ويوجد نقص في المقارنة في الأدبيات ، لا سيما مع بروتوكولات العزل الميكانيكية⁷. ومع ذلك ، من حيث قابلية ترجمة النهج ، فإن التربسين له نفس عيوب الكولاجيناز.

تتضمن طرق العزل البديلة للحصول على ASCs ، بناء على القوى الميكانيكية وبدون إضافة إنزيم ، الطرد المركزي عالي السرعة (800 × جم أو 1280 × جم ، 15 دقيقة) لشظايا الأنسجة الدهنية. بعد ذلك ، يتم تحضين الحبيبات بمخزن مؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء (5 دقائق) ، تليها خطوة طرد مركزي أخرى عند 600 × جم قبل إعادة التعليق في وسط الاستزراع. على الرغم من وجود عدد أكبر من الخلايا التي تم عزلها في الأيام الأولى مقارنة بطرق الزرع ، أظهرت دراسة سابقة انتشارا أقل أو غائبا بعد الأسبوع الثاني من الثقافة⁸.

إلى جانب ذلك ، يرتبط المزيد من التلاعب بالوسط المضاف xenogenec ، مثل مصل الأبقار الجنيني (FBS) ، والذي يستخدم كمكمل لعامل النمو لزراعة الخلايا ، بزيادة خطر التفاعل المناعي والتعرض للعدوى الفيروسية أو البكتيرية أو البريون للمريض المضيف ^9,10. تم بالفعل وصف ردود الفعل المناعية وتطور الطفح الجلدي الشروي في الأفراد الذين يتلقون عدة جرعات من الخلايا الجذعية الوسيطة المنتجة باستخدام FBS¹¹. علاوة على ذلك، تخضع FBS لتقلبات من دفعة إلى أخرى، والتي يمكن أن يكون لها تأثير على جودة المنتج النهائي¹².

وفقا لإرشادات ممارسات التصنيع الجيدة (GMP) ، يجب تجنب تفكك الأنسجة الأنزيمية ، ويجب استبدال FBS بمكملات خالية من الجينات. هذه الخطوات ، جنبا إلى جنب مع بروتوكولات أكثر موثوقية وقابلة للتكرار ، ضرورية لدعم تطبيق العلاج الخلوي ^3,13.

في هذا السياق ، تم اقتراح تحلل الصفائح الدموية البشرية (hPL) كبديل ل FBS لأنه مكمل خال من الخلايا ويحتوي على البروتين وغني بعامل النمو ، وقد تم تقديمه سابقا بين المنتجات القائمة على الخلايا السريرية كمادة مضافة لوسط النمو لزراعة الخلايا في المختبر والتوسع^14,15. نظرا لأن hPL منتج مشتق من الإنسان ، فإنه يستخدم بشكل متكرر كبديل ل FBS أثناء الثقافة المختبرية ل hASCs المخصصة للتطبيقات السريرية ، وبالتالي تقليل المشكلات المتعلقة بالتفاعلات المناعية والالتهابات المتعلقة بقابلية ترجمة FBS^15,16.

على الرغم من ارتفاع تكاليف الإنتاج ، فقد ثبت بالفعل أنه بالمقارنة مع FBS ، فإن hPL يدعم صلاحية الخلية للعديد من أنواع الخلايا ، ويزيد من الانتشار ، ويؤخر الشيخوخة ، ويضمن الاستقرار الجيني ، ويحافظ على النمط المناعي الخلوي حتى في ممرات الخلايا المتأخرة. كل هذه العناصر تدعم التحول نحو ملحق الثقافة^{هذا 11}.

كان الهدف من هذا العمل هو تطوير بروتوكول موحد لعزل وزراعة hASCs بطريقة كاملة خالية من الحيوانات ، دون تعديل فسيولوجيا الخلية وخصائص الجذعية مقارنة ب hASCs التقليدية المستزرعة FBS (الشكل 1).

Protocol

تم عزل hASCs من الأنسجة الدهنية البطنية لامرأة سليمة خضعت لإعادة بناء الثدي باستخدام اللوحات الذاتية البطنية (اللوحات المثقوبة الشرسوفية السفلية العميقة ، [DIEP]) في مستشفى جامعة لوزان ، CHUV ، لوزان ، سويسرا. تم الحصول على الجزء المهمل من السديلة والأنسجة الدهنية بعد توقيع المريض على الموافقة المستنيرة. تمت مراجعة جميع البروتوكولات والموافقة عليها من قبل قسم البنك الحيوي بالمستشفى DAL (رقم 314 GGC) ولجان الأخلاقيات وفقا لإعلان هلسنكي.

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات تحت غطاء التدفق الصفحي ومع ظروف معقمة. يجب دائما ارتداء القفازات ومعاطف المختبر للحماية الشخصية ، ويجب غسل جميع الأسطح بالمبيدات الحيوية المناسبة. يجب التخلص من الأنسجة الزائدة بشكل صحيح كنفايات طبية حيوية.

1. المواد اللازمة وإعداد حلول الثقافة

1. لعزل الخلايا وتوسيعها وحفظها بالتبريد ، احصل على الأدوات التالية: مقص معقم مشارط معقمة ملاقط معقمة طبق بتري 10 سم ؛ أنابيب 15 مل قوارير T25 غرفة بوركر كريوفيال. حاوية تجميد الخلية ؛ مجهر بصري بأهداف تكبير 4x و 10x ؛ وأجهزة طرد مركزي دلو متأرجحة.
2. للتنميط المناعي ، احصل على الأدوات والكواشف التالية: أنابيب FACS ، محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) ؛ الحد الأدنى من الوسط الأساسي لشركة Dulbecco (DMEM) ؛ hPL. ثنائي ميثيل كبريتيد والتربسين الخالي من الحيوانات.
3. قم بإعداد وسط الاستزراع الكامل عن طريق استكمال DMEM ب 5٪ hPL خال من الهيبارين. قم بتخزين الوسط على حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع ، واستخدمه دائما دافئا (بين درجة حرارة الغرفة و 37 درجة مئوية). باتباع إرشادات GMP لإنتاج الأدوية الخلوية المخصصة للعلاج البشري ، لا تضيف أي مضادات حيوية إلى وسط الثقافة.
4. تحضير وسط تجميد يحتوي على 20٪ hPL و 10٪ ثنائي ميثيل كبريتيد في DMEM.

2. عزل hASCs من عينة الأنسجة الدهنية

1. معالجة عينة الأنسجة الدهنية في غضون 6 ساعات من الحصول عليها. قبل الشروع في طريقة العزل الميكانيكية الخالية من الزينة ، اغسل المنديل 2x باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق حتى يتم إطلاق النسيج الضام والدم.
2. قم بتخزين عينة الأنسجة الدهنية التي تم الحصول عليها من جراحة تجميل البطن في PBS عند 4 درجات مئوية حتى المعالجة ، وعلى أي حال ، لا تزيد عن 24 ساعة ، حتى لا تتلف صلاحية hASC.
3. قطع الأنسجة الدهنية إلى قطع أصغر من حوالي 1 سم² مع مقص معقم.
4. باستخدام مشرط ، قم بتشريح كل قطعة إلى أجزاء صغيرة بأقطار <5 مم ، وتفريق خمسة منها في طبق بتري 10 سم (الشكل 2 أ).
5. من أجل إرفاق كل جزء ، استخدم المشرط لإنشاء شقوق على السطح البلاستيكي ، واسحب كل جزء حتى يلتصق بقوة بطبق بتري. استخدم الملقط للمساعدة في التعامل مع الجزء (الشكل 2 ب).
6. أضف برفق 10 مل من وسط الاستزراع الكامل لتغطية جميع الأجزاء دون فصلها.
7. احتضان أطباق بتري في 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂. سوف تهاجر hASCs من الأنسجة ويتم اختيارها بسبب التصاق البلاستيك دون الهضم الأنزيمي.
8. حتى التقاء الخلية ، راقب تمدد hASC تحت المجهر الضوئي عند تكبير 4x مرة واحدة في اليوم. عندما تبدأ hASCs في الخروج من الأنسجة ، فإنها تظهر كمجموعات صغيرة حول قطع الأنسجة مع مورفولوجيا نموذجية تشبه الخلايا الليفية. يتم اختيار hASCs نظرا لقدرتها على الالتصاق بالسطح البلاستيكي. كل 72 ساعة ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسط ، واستبدله بوسط كامل جديد لإزالة بقايا الخلايا.
9. اترك شظايا الأنسجة في مكانها حتى مرور الخلايا الأول ، والذي عادة ما يكون بعد 7 أيام.

3. ثقافة hASC بعد مرحلة العزل

1. عندما تصل ثقافة hASC إلى التقاء 70٪ -80٪ ، تكون hASCs جاهزة للفصل والتوسع بشكل أكبر لاستخدامها إما في تجارب أخرى أو تخزين طويل الأجل.
2. باستخدام ملاقط معقمة ، قم بإزالة وتجاهل جميع قطع الأنسجة من طبق بتري. قم بإزالة الوسط المنهك والتخلص منه ، مع الحرص على عدم لمس hASCs حتى لا يتم فصلها.
3. اغسل الخلايا بعناية مرة واحدة باستخدام 10 مل من برنامج تلفزيوني. أضف 1 مل من 1x تربسين خال من الحيوانات ، واترك طبق بتري في الحاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
4. تحقق تحت المجهر الضوئي عند تكبير 4x إذا كانت جميع الخلايا قد انفصلت ؛ خلاف ذلك ، اترك طبق بتري لمدة 2 دقيقة إضافية في الحاضنة ، وفي النهاية اضغط برفق على السطح البلاستيكي لدعم انفصال الخلايا.
5. أوقف عمل التربسين بإضافة 2 مل من الوسط الكامل ، واجمع كل الخلايا في أنبوب سعة 15 مل.
6. من أجل إزالة أي تربسين متبقي ، قم بطرد الأنبوب عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وقم بتعليق الخلايا ب 5 مل من الوسط الكامل ، وانقل تعليق الخلية إلى قارورة T25 جديدة. احتفظ ب hASCs في الثقافة ، وقم بتوسيعها لحين الحاجة.

4. فحص النمط المناعي عن طريق قياس التدفق الخلوي

1. عندما تصل ثقافة hASC إلى التقاء 70٪ -80٪ ، افصل hASCs كما هو موضح سابقا في القسم 3.
2. بعد جمع الخلايا ، قم بتعليقها في 1 مل من الوسط الكامل ، واحسب حصة مع عداد الخلية تحت المجهر الضوئي عند تكبير 10x.
3. أجهزة الطرد المركزي hASCs عند 300 × g لمدة 5 دقائق ، وتعليقها عند 1 × 10⁶ خلايا / مل من المخزن المؤقت FACS. نقل 100 ميكرولتر من المعلق الذي يحتوي على 1 × 10⁵ خلايا في أنبوب FACS واحد. استخدم أنبوب FACS واحدا لكل مستضد تم فحصه ، بالإضافة إلى أنبوب آخر لكل عنصر تحكم متماثل النمط.
4. تلطيخ الخلايا ب 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة التالية المخففة في المخزن المؤقت FACS: مضاد CD73 (1: 1000 ، IgG1 ، المسمى FITC) ، مضاد CD105 (1: 200 ، IgG1 ، PE المسمى) ؛ مكافحة CD34 (1:66 ، IgG1 ، المسمى FITC) ؛ مكافحة CD45 (1:66 ، IgG1 ، المسمى FITC) ؛ وعناصر التحكم متساوية النمط لكل فلوروفور ، المسمى IgG1 FITC (1: 1,000) والمسمى IgG1 PE (1:50).
5. احتضان العينات لمدة 1 ساعة في الظلام مع التحريك عند 4 درجات مئوية. قم بطرد الأنابيب عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية ، وقم بتعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
6. قم بتقييم النمط المناعي للخلية باستخدام أداة قياس التدفق الخلوي ، وتسجيل 50000 حدث لكل أنبوب داخل البوابة المختارة لاستبعاد حطام الخلية. احسب النسبة المئوية للتعبير عن الخلايا كفرق عن عنصر التحكم المتماثل المحدد.

5. مقايسة انتشار hASC

1. عندما تصل ثقافة hASC إلى التقاء 70٪ -80٪ ، افصل hASCs كما هو موضح في القسم 3.
2. بعد جمع الخلايا ، قم بتعليقها في 1 مل من الوسط الكامل ، واحسب حصة مع عداد الخلية تحت المجهر الضوئي عند تكبير 10x.
3. بذرة 5 × 10² hASCs في 200 ميكرولتر من الوسط الكامل في 96 لوحة شفافة جيدا. زرع الخلايا في النسخ المتماثلة التقنية ، مع بئر واحد لكل نقطة زمنية.
4. في 3 أيام بعد البذر ، ابدأ في اكتشاف تكاثر الخلايا باستخدام مجموعة فحص الانتشار باتباع تعليمات الشركة المصنعة. باختصار ، استبدل وسط الاستزراع ب 100 ميكرولتر من الوسط الطازج مضافا إلى 20 ميكرولتر من كاشف الفحص لكل بئر. احتضان hASCs لمدة 2.5 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO₂ لتطوير الكاشف ، ثم اكتشف الامتصاص عند 490 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
5. عبر عن انتشار hASC كنسبة امتصاص بعد إزالة الامتصاص الفارغ.

6. الحفظ بالتبريد وتخزين hASCs

1. افصل الخلايا كما هو موضح في القسم 3 ، واحسب حصة مع عداد الخلية تحت المجهر الضوئي عند تكبير 10x.
2. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 × غرام لمدة 5 دقائق ، والتخلص من المواد الطافية. قم بتعليق الخلايا بمزيج التجميد بكثافة 1 × 10⁶ hASCs / mL ، وانقل 1 مل من محلول الخلية إلى cryovial واحد.
3. ضع الكريوفيالات عند -80 درجة مئوية في وعاء تجميد يقلل درجة الحرارة بمقدار 1 درجة مئوية / دقيقة ، ثم انقل المبردات إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل.

النتائج

بتطبيق طريقة العزل المفصلة أعلاه ، تم الحصول على hASCs بنجاح من عينات الأنسجة الدهنية البطنية دون استخدام كولاجيناز. علاوة على ذلك ، تم توسيع hASCs في ظروف خالية تماما من xenogenec في وجود hPL وبدون أي مكونات أخرى من أصل حيواني. النتائج التالية تدعم البروتوكول ويتم الحصول عليها من hASCs المستزرعة بالتو?...

Discussion

جذبت الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون اهتمام الأبحاث الانتقالية في العقد الماضي بسبب وفرتها ، وطرق عزلها السريعة وبأسعار معقولة ، وارتفاع معدل الانتشار في المختبر / في الجسم الحي ، وخصائص الجذعية / التمايز¹⁸،^19،20. نتيجة لذلك ، ت?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL tubes	euroclone	et5015b
anti-CD105	BD Biosciences	BD560839
anti-CD34	BD Biosciences	BD555821
anti-CD45	BD Biosciences	BD555482
anti-CD73	BD Biosciences	BD561254
autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer)	Miltenyi	130-091-222
BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument)	BD accuri	-
Burker chamber	Blaubrand	717810
Cell freezing container	corning	CLS432002
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay	Promega	G3582
CoolCell Freezing container	Corning	CLS432002
Cryovials	clearline	390701
Dimethyl sulfide	Sigma Aldrich	D2650-100mL
disposabile blade scalpel	paragon	bs 2982
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose	GIBCO	11965092
Human Platelet Lysate FD (GMP grade)	Stemulate	PL-NH-500
Infinite F50 spectrophotometer	Tecan	-
Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives	Olympus	CKX41
Petri dish 10 cm	Greiner bio-one	664160
Sterile scalpels	Reda	07104-00
Sterile scissors	Bochem	4071
Sterile tweezers	Bochem	1152
Swinging bucket centrifuge	Sigma	3-16K
T25 flasks	Greiner bio-one	6910170
TrypLe (animal free trypsin substitute)	GIBCO	12604-013