Isolement et culture de cellules souches humaines dérivées du tissu adipeux à l’aide d’une méthode innovante sans xénogène pour la thérapie humaine

Résumé

Les produits xénogéniques (chimiques ou d’origine animale) introduits dans les étapes de préparation/manipulation de la thérapie cellulaire sont associés à un risque accru de réactivité immunitaire et de transmission pathogène chez les patients hôtes. Ici, une méthode complète sans xénogénétique pour l’isolement et l’expansion in vitro de cellules souches humaines dérivées du tissu adipeux est décrite.

Résumé

Compte tenu de l’impact croissant de la thérapie par cellules souches, des préoccupations en matière de biosécurité ont été soulevées concernant la contamination potentielle ou la transmission d’infections due à l’introduction de produits d’origine animale lors de manipulations in vitro . Les composants xénogéniques, tels que la collagénase ou le sérum bovin fœtal, couramment utilisés pendant les étapes d’isolement et d’expansion cellulaires pourraient être associés aux risques potentiels de réactivité immunitaire ou d’infection virale, bactérienne et à prion chez les patients receveurs. Conformément aux directives de bonnes pratiques de fabrication, la dissociation chimique des tissus doit être évitée, tandis que le sérum bovin fœtal (FBS) peut être remplacé par des suppléments sans xénophobie. De plus, pour assurer la sécurité des produits cellulaires, la définition de méthodes plus fiables et reproductibles est importante. Nous avons développé une méthode innovante, totalement exempte de xénophobie, pour l’isolement et l’expansion in vitro de cellules souches humaines dérivées du tissu adipeux sans altérer leurs propriétés par rapport aux protocoles standard de culture FBS de collagénase. Ici, des cellules souches dérivées du tissu adipeux humain (hASC) ont été isolées du tissu adipeux abdominal. L’échantillon a été haché mécaniquement avec des ciseaux / un scalpel, micro-disséqué et dispersé mécaniquement dans une boîte de Petri de 10 cm, et préparé avec des incisions au scalpel pour faciliter la fixation des fragments de tissu et la migration des hASC. Après les étapes de lavage, les hASC ont été sélectionnés en raison de leur adhérence plastique sans digestion enzymatique. Les hASCs isolés ont été cultivés avec un milieu supplémenté en lysat plaquettaire humain sans héparine à 5% et détachés avec un substitut de trypsine sans animaux. Conformément aux directives des bonnes pratiques de fabrication (BPF) sur la production de produits cellulaires destinés à la thérapie humaine, aucun antibiotique n’a été utilisé dans les milieux de culture.

Introduction

Au cours des dernières décennies, la demande croissante de traitements thérapeutiques innovants a donné lieu à des efforts et à des investissements de ressources importants dans le domaine de la médecine translationnelle¹. Les produits à base de cellules sont associés à des risques déterminés par la source cellulaire, le processus de fabrication (isolement, expansion ou modification génétique) et les suppléments non cellulaires (enzymes, facteurs de croissance, suppléments de culture et antibiotiques), et ces facteurs de risque dépendent de l’indication thérapeutique spécifique. La qualité, la sécurité et l’efficacité du produit final pourraient être profondément influencées par^{les éléments 2} indiqués ci-dessus. La thérapie par cellules souches exige le respect des principes de biosécurité; Les risques potentiels de transmission pathogène avec des produits d’origine animale en culture cellulaire pourraient être problématiques, et l’analyse approfondie de tout produit introduit dans la fabrication est essentielle³.

La méthode traditionnelle d’isolement des cellules souches adipeuses humaines (hASC) implique une digestion enzymatique effectuée avec de la collagénase suivie d’étapes de lavage par centrifugation⁴. Alors que l’isolement enzymatique est généralement considéré comme plus efficace que d’autres techniques mécaniques en termes de rendements cellulaires et de viabilité, les composants d’origine animale utilisés, tels que la collagénase, sont considérés comme plus que peu manipulés par la Food and Drug Administration des États-Unis. Cela signifie qu’il existe un risque significativement accru de réactions immunitaires ou de transmission de maladies, limitant ainsi la traduction du traitement par hASC dans les milieux cliniques ^5,6.

La digestion à base de trypsine est un autre protocole enzymatique pour isoler les ASC. Différentes techniques ont été décrites avec de légères modifications en termes de concentration de trypsine, de vitesse de centrifugation et de temps d’incubation. Malheureusement, cette méthode n’est pas bien décrite, et un manque de comparaison existe dans la littérature, notamment avec les protocoles d’isolation mécanique⁷. Cependant, en termes de traduisibilité de l’approche, la trypsine présente les mêmes inconvénients que la collagénase.

Les méthodes alternatives d’isolement pour obtenir des ASC, basées sur les forces mécaniques et sans ajout d’enzyme, impliquent une centrifugation à grande vitesse (800 x g ou 1 280 x g, 15 min) des fragments de tissu adipeux. Ensuite, la pastille est incubée avec un tampon de lyse érythrocytaire (5 min), suivie d’une autre étape de centrifugation à 600 x g avant remise en suspension dans le milieu de culture. Malgré un plus grand nombre de cellules isolées dans les premiers jours par rapport aux méthodes d’explantation, une étude précédente a montré une prolifération plus faible ou absente au-delà de la deuxième semaine de culture⁸.

En outre, une manipulation supplémentaire avec un milieu xénogénique ajouté, tel que le sérum bovin fœtal (FBS), qui est utilisé comme supplément de facteur de croissance pour la culture cellulaire, est associée à un risque accru de réactivité immunitaire et d’exposition aux infections virales, bactériennes ou à prions du patient hôte ^9,10. Des réactions immunitaires et le développement d’éruptions urticariformes ont déjà été décrits chez des personnes recevant plusieurs doses de cellules souches mésenchymateuses produites avec FBS¹¹. En outre, FBS est soumis à une variabilité d’un lot à l’autre, ce qui peut avoir un impact sur la qualité du produit final¹².

Conformément aux lignes directrices des bonnes pratiques de fabrication (BPF), la dissociation des tissus enzymatiques doit être évitée et le FBS doit être remplacé par des suppléments sans xénophobie. Ces étapes, ainsi que des protocoles plus fiables et reproductibles, sont essentielles pour soutenir l’application de la thérapie cellulaire ^3,13.

Dans ce contexte, le lysat plaquettaire humain (hPL) a été suggéré comme substitut du FBS puisqu’il s’agit d’un supplément acellulaire, contenant des protéines et enrichi en facteur de croissance, et qu’il a déjà été introduit parmi les produits cellulaires de qualité clinique en tant qu’additif de milieu de croissance pour la culture cellulaire in vitro et l’expansion^14,15. Comme hPL est un produit d’origine humaine, il est fréquemment utilisé comme substitut du FBS lors de la culture in vitro de hASC destinés à des applications cliniques, réduisant ainsi les problèmes concernant les réactions immunologiques et les infections liées à la translatabilité FBS^15,16.

Malgré les coûts de production plus élevés, il a déjà été démontré que, par rapport au FBS, hPL soutient la viabilité cellulaire pour de nombreux types de cellules, augmente la prolifération, retarde la sénescence, assure la stabilité génomique et conserve l’immunophénotype cellulaire même dans les passages cellulaires tardifs; Tous ces éléments soutiennent le passage à ce supplément de culture¹¹.

L’objectif de ce travail était de développer un protocole standardisé pour isoler et cultiver les hASCs avec une méthode complète sans animaux, sans modifier la physiologie cellulaire et les propriétés de souche par rapport aux hASC classiques cultivés par FBS (Figure 1).

Protocole

Les hASCs ont été isolées du tissu adipeux abdominal d’une femme en bonne santé qui a subi une reconstruction mammaire à l’aide de lambeaux autologues abdominaux (lambeaux perforateurs épigastriques inférieurs profonds, [DIEP]) à l’hôpital universitaire de Lausanne, CHUV, Lausanne, Suisse. La partie jetée du lambeau et du tissu adipeux a été obtenue après que le patient a signé le consentement éclairé. Tous les protocoles ont été examinés et approuvés par le département de biobanque DAL (numéro 314 GGC) de l’hôpital et les comités d’éthique conformément à la Déclaration d’Helsinki.

NOTE: Toutes les étapes doivent être effectuées sous une hotte à flux laminaire et dans des conditions aseptiques. Des gants et des blouses de laboratoire pour la protection personnelle doivent toujours être portés, et toutes les surfaces doivent être lavées avec des biocides appropriés. Les tissus excédentaires doivent être éliminés correctement comme déchets biomédicaux.

1. Matériel nécessaire et préparation des solutions de culture

1. Pour l’isolement, l’expansion et la cryoconservation des cellules, procurez-vous les instruments suivants: ciseaux stériles; scalpels stériles; pince à épiler stérile; une boîte de Petri de 10 cm; tubes de 15 mL; Fioles T25; une chambre Burker; cryoviaux; un récipient de congélation de cellules; un microscope optique avec des objectifs de grossissement 4x et 10x; et une centrifugeuse à godet oscillant.
2. Pour l’immunophénotypage, obtenir les instruments et réactifs suivants: tubes FACS, solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS); le milieu essentiel minimal de Dulbecco (DMEM); hPL; sulfure de diméthyle; et trypsine sans animaux.
3. Préparer le milieu de culture complet en complétant le DMEM avec 5% d’hPL sans héparine. Conserver le milieu à 4 °C jusqu’à 3 semaines et toujours utiliser chaud (entre la température ambiante et 37 °C). En suivant les directives BPF pour la production de médicaments cellulaires destinés à la thérapie humaine, n’ajoutez pas d’antibiotiques au milieu de culture.
4. Préparer le milieu de congélation contenant 20% de hPL et 10% de sulfure de diméthyle dans du DMEM.

2. Isolement des CSAh de l’échantillon de tissu adipeux

1. Traiter l’échantillon de tissu adipeux dans les 6 heures suivant son obtention. Avant de passer à la méthode d’isolement mécanique sans xénogénie, laver le tissu 2x avec du PBS pendant 10 minutes jusqu’à ce que le tissu conjonctif et le sang soient libérés.
2. Conserver l’échantillon de tissu adipeux obtenu lors de la chirurgie abdominoplastique dans du PBS à 4 ° C jusqu’au traitement et, dans tous les cas, pas plus de 24 heures, afin de ne pas nuire à la viabilité de l’hASC.
3. Couper le tissu adipeux en petits morceaux d’environ 1 cm² avec des ciseaux stériles.
4. À l’aide d’un scalpel, micro-disséquer chaque pièce en petits fragments de diamètre <5 mm, et disperser cinq d’entre eux dans une boîte de Petri de 10 cm (Figure 2A).
5. Afin d’attacher chaque fragment, utilisez le scalpel pour créer des incisions sur la surface en plastique, en faisant glisser chaque fragment jusqu’à ce qu’il soit fermement collé à la boîte de Pétri. Utilisez une pince à épiler pour manipuler le fragment (Figure 2B).
6. Ajouter délicatement 10 mL de milieu de culture complet afin de couvrir tous les fragments sans les détacher.
7. Incuber les boîtes de Petri à 37 °C et 5% de CO₂. Les hASC migreront hors du tissu et seront sélectionnés en raison de leur adhérence plastique sans digestion enzymatique.
8. Jusqu’à la confluence cellulaire, surveiller l’expansion de l’hASC au microscope optique à un grossissement 4x une fois par jour. Lorsque les hASC commencent à sortir du tissu, ils apparaissent comme de petits amas autour des morceaux de tissu avec une morphologie typique de fibroblaste. Les hASC sont sélectionnés en raison de leur capacité à adhérer à la surface plastique. Toutes les 72 h, enlever autant de milieu que possible et le remplacer par un milieu complet frais afin d’éliminer les débris cellulaires.
9. Laissez les fragments de tissu en place jusqu’au premier passage des cellules, qui est généralement après 7 jours.

3. Culture hASC après la phase d’isolement

1. Lorsque la culture hASC atteint une confluence de 70% à 80%, les hASC sont prêts à être détachés et étendus pour être utilisés pour d’autres expériences ou un stockage à long terme.
2. Avec une pince à épiler stérile, retirez et jetez tous les morceaux de tissu de la boîte de Pétri. Retirer et jeter le milieu épuisé, en prenant soin de ne pas toucher les hASC afin de ne pas les détacher.
3. Lavez soigneusement les cellules une fois avec 10 ml de PBS. Ajouter 1 mL de 1x trypsine sans animaux et laisser la boîte de Petri dans l’incubateur à 37 °C pendant 5 min.
4. Vérifiez au microscope optique à un grossissement de 4x si toutes les cellules se sont détachées; Sinon, laissez la boîte de Petri pendant 2 minutes supplémentaires dans l’incubateur, puis tapotez doucement la surface en plastique pour soutenir le détachement cellulaire.
5. Arrêter l’action de la trypsine en ajoutant 2 mL de milieu complet et recueillir toutes les cellules dans un tube de 15 mL.
6. Afin d’éliminer la trypsine restante, centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant, suspendre les cellules avec 5 mL de milieu complet et transférer la suspension cellulaire dans une nouvelle fiole T25. Gardez les hASC en culture et développez-les jusqu’à ce que cela soit nécessaire.

4. Immunophénotype par cytométrie de flux

1. Lorsque la culture hASC atteint une confluence de 70 % à 80 %, détachez les CSAh comme décrit précédemment à la section 3.
2. Après avoir recueilli les cellules, suspendez-les dans 1 mL de milieu complet et comptez une partie aliquote avec le compteur de cellules au microscope optique à un grossissement de 10x.
3. Centrifuger les CSAh à 300 x g pendant 5 min, et les suspendre à 1 x 10⁶ cellules/mL de tampon FACS. Transférer 100 μL de la suspension contenant 1 x 10⁵ cellules dans un tube FACS. Utiliser un tube FACS pour chaque antigène étudié, plus un autre pour chaque témoin isotypique.
4. Colorer les cellules avec 100 μL des anticorps suivants dilués dans un tampon FACS : anti-CD73 (1:1 000, IgG1, marqué FITC), anti-CD105 (1:200, IgG1, marqué PE); anti-CD34 (1:66, IgG1, marqué FITC); anti-CD45 (1:66, IgG1, marqué FITC); et des contrôles isotypiques pour chaque fluorophore, marqués IgG1 FITC (1:1 000) et IgG1 marqués PE (1:50).
5. Incuber les échantillons pendant 1 h dans l’obscurité en agitant à 4 °C. Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 5 min, jeter le surnageant et suspendre les cellules dans 500 μL de tampon FACS.
6. Évaluer l’immunophénotype cellulaire à l’aide d’un instrument de cytométrie en flux, en enregistrant 50 000 événements pour chaque tube à l’intérieur de la porte sélectionnée pour exclure les débris cellulaires. Calculez le pourcentage de cellules exprimant la différence par rapport au contrôle isotypique spécifique.

5. Essai de prolifération de l’hASC

1. Lorsque la culture hASC atteint une confluence de 70 % à 80 %, détachez les CSAh comme décrit à la section 3.
2. Après avoir recueilli les cellules, suspendez-les dans 1 mL de milieu complet et comptez une partie aliquote avec le compteur de cellules au microscope optique à un grossissement de 10x.
3. Semer 5 x 10² hASCs dans 200 μL de milieu complet dans des plaques transparentes à 96 puits. Ensemencer les cellules dans des réplications techniques, avec un puits pour chaque point temporel.
4. 3 jours après l’ensemencement, commencez à détecter la prolifération cellulaire à l’aide d’une trousse de dosage de prolifération en suivant les instructions du fabricant. En bref, remplacer le milieu de culture par 100 μL de milieu frais ajoutés à 20 μL de réactif d’essai par puits. Incuber les hASC pendant 2,5 h à 37 °C, 5% de CO₂ pour le développement du réactif, puis détecter l’absorbance à 490 nm avec un spectrophotomètre.
5. Exprimer la prolifération hASC en pourcentage d’absorbance après élimination de l’absorbance à blanc.

6. Cryoconservation et stockage des CSAh

1. Détacher les cellules comme décrit à la section 3 et compter une partie aliquote avec le compteur de cellules au microscope optique à un grossissement de 10x.
2. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min, et jeter le surnageant. Suspendre les cellules avec un mélange de congélation à une densité de 1 x 10⁶ hASCs/mL et transférer 1 mL de la solution cellulaire dans un cryovial.
3. Placez les cryovials à -80 °C dans un récipient de congélation qui diminue la température de 1 °C/min, puis déplacez les cryovials vers de l’azote liquide pour un stockage à long terme.

Résultats

En appliquant la méthode d’isolement détaillée ci-dessus, les hASC ont été obtenues avec succès à partir d’échantillons de tissu adipeux abdominal sans l’utilisation de collagénase. De plus, les CSAh ont été étendues dans des conditions totalement exemptes de xénogènes en présence de hPL et sans aucun autre composant d’origine animale. Les résultats suivants soutiennent le protocole et sont obtenus à partir de hASC cultivés en parallèle avec hPL et avec FBS comme condition de contrôle.

Discussion

Les cellules souches dérivées du tissu adipeux ont suscité l’intérêt de la recherche translationnelle au cours de la dernière décennie en raison de leur abondance, de leurs méthodes d’isolement rapides et abordables, de leur taux élevé de prolifération in vitro/in vivo et de leurs propriétés de souches/différenciation18,19,20. En conséquence, les hASCs sont considérés comme un excellent can...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL tubes	euroclone	et5015b
anti-CD105	BD Biosciences	BD560839
anti-CD34	BD Biosciences	BD555821
anti-CD45	BD Biosciences	BD555482
anti-CD73	BD Biosciences	BD561254
autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer)	Miltenyi	130-091-222
BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument)	BD accuri	-
Burker chamber	Blaubrand	717810
Cell freezing container	corning	CLS432002
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay	Promega	G3582
CoolCell Freezing container	Corning	CLS432002
Cryovials	clearline	390701
Dimethyl sulfide	Sigma Aldrich	D2650-100mL
disposabile blade scalpel	paragon	bs 2982
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose	GIBCO	11965092
Human Platelet Lysate FD (GMP grade)	Stemulate	PL-NH-500
Infinite F50 spectrophotometer	Tecan	-
Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives	Olympus	CKX41
Petri dish 10 cm	Greiner bio-one	664160
Sterile scalpels	Reda	07104-00
Sterile scissors	Bochem	4071
Sterile tweezers	Bochem	1152
Swinging bucket centrifuge	Sigma	3-16K
T25 flasks	Greiner bio-one	6910170
TrypLe (animal free trypsin substitute)	GIBCO	12604-013