Isolierung und Kultivierung von humanen Fettstammzellen mit einer innovativen xenogenfreien Methode für die Humantherapie

Zusammenfassung

Xenogene (chemische oder tierische) Produkte, die in den Vorbereitungs-/Manipulationsschritten der Zelltherapie eingeführt werden, sind mit einem erhöhten Risiko für Immunreaktivität und pathogene Übertragung bei Wirtspatienten verbunden. Hier wird eine vollständige xenogenfreie Methode zur Isolierung und in vitro Expansion von humanen adipösen Stammzellen beschrieben.

Zusammenfassung

In Anbetracht der zunehmenden Auswirkungen der Stammzelltherapie wurden Bedenken hinsichtlich der biologischen Sicherheit hinsichtlich einer möglichen Kontamination oder Infektionsübertragung aufgrund der Einführung tierischer Produkte während der In-vitro-Manipulation geäußert. Die xenogenen Komponenten, wie Kollagenase oder fötales Rinderserum, die üblicherweise während der Zellisolierungs- und Expansionsschritte verwendet werden, könnten mit den potenziellen Risiken einer Immunreaktivität oder einer Virus-, Bakterien- und Prioneninfektion bei den empfangenden Patienten in Verbindung gebracht werden. Gemäß den Richtlinien der guten Herstellungspraxis sollte eine chemische Gewebedissoziation vermieden werden, während fetales Rinderserum (FBS) durch xenogenfreie Nahrungsergänzungsmittel ersetzt werden kann. Um die Sicherheit von Zellprodukten zu gewährleisten, ist es außerdem wichtig, zuverlässigere und reproduzierbarere Methoden zu definieren. Wir haben eine innovative, vollständig xenogenfreie Methode zur Isolierung und In-vitro-Expansion von humanen Fettstammzellen entwickelt, ohne deren Eigenschaften im Vergleich zu Kollagenase-FBS-kultivierten Standardprotokollen zu verändern. Hier wurden aus menschlichem Fettgewebe gewonnene Stammzellen (hASCs) aus abdominalem Fettgewebe isoliert. Die Probe wurde mechanisch mit einer Schere/einem Skalpell zerkleinert, mikropräpariert und mechanisch in einer 10 cm Petrischale dispergiert und mit Skalpellschnitten vorbereitet, um das Anheften der Gewebefragmente und die Migration von hASCs zu erleichtern. Im Anschluss an die Waschschritte wurden hASCs aufgrund ihrer plastischen Adhärenz ohne enzymatischen Aufschluss ausgewählt. Die isolierten hASCs wurden mit Medium kultiviert, das mit 5% heparinfreiem humanem Thrombozytenlysat angereichert und mit einem tierfreien Trypsinersatz abgetrennt wurde. Gemäß den Richtlinien der Guten Herstellungspraxis (GMP) zur Herstellung von Zellprodukten, die für die Humantherapie bestimmt sind, wurden keine Antibiotika in Nährmedien verwendet.

Einleitung

In den letzten Jahrzehnten hat die steigende Nachfrage nach innovativen therapeutischen Behandlungen zu erheblichen Anstrengungen und Ressourceninvestitionen im Bereich der translationalen Medizin^{geführt 1}. Zellbasierte Produkte sind mit Risiken verbunden, die durch die Zellquelle, den Herstellungsprozess (Isolierung, Expansion oder genetische Veränderung) und die nicht-zellulären Nahrungsergänzungsmittel (Enzyme, Wachstumsfaktoren, Kulturzusätze und Antibiotika) bestimmt werden, und diese Risikofaktoren hängen von der spezifischen therapeutischen Indikation ab. Die Qualität, Sicherheit und Wirksamkeit des Endprodukts könnte stark von den oben genannten Elementen^{beeinflusst werden 2}. Die Stammzelltherapie erfordert die Einhaltung der Grundsätze der biologischen Sicherheit. Die potenziellen Risiken einer pathogenen Übertragung mit tierischen Produkten in Zellkulturen könnten problematisch sein, und die gründliche Prüfung jedes Produkts, das bei der Herstellung eingeführt wird, ist unerlässlich³.

Die traditionelle Methode zur Isolierung von aus menschlichem Fett gewonnenen Stammzellen (hASCs) beinhaltet einen enzymatischen Aufschluss mit Kollagenase, gefolgt von Waschschritten durch Zentrifugation⁴. Während die enzymatische Isolierung im Allgemeinen in Bezug auf Zellausbeute und Lebensfähigkeit als effizienter angesehen wird als andere mechanische Techniken, werden die verwendeten tierischen Komponenten wie Kollagenase von der US-amerikanischen Food and Drug Administration als mehr als minimal manipuliert angesehen. Dies bedeutet, dass ein signifikant erhöhtes Risiko für Immunreaktionen oder Krankheitsübertragungen besteht, wodurch die Übertragung der hASC-Therapie auf das klinische Umfeld eingeschränkt^{wird 5,6}.

Die Trypsin-basierte Verdauung ist ein weiteres enzymatisches Protokoll zur Isolierung von ASCs. Es wurden verschiedene Techniken mit geringfügigen Modifikationen in Bezug auf die Trypsinkonzentration, die Zentrifugationsgeschwindigkeit und die Inkubationszeit beschrieben. Leider ist diese Methode nicht gut beschrieben, und in der Literatur besteht ein Mangel an Vergleichen, insbesondere mit den mechanischen Isolationsprotokollen⁷. In Bezug auf die Übersetzbarkeit des Ansatzes hat Trypsin jedoch die gleichen Nachteile wie Kollagenase.

Alternative Isolationsmethoden zur Gewinnung von ASCs, die auf mechanischen Kräften und ohne Enzymzugabe basieren, beinhalten eine Hochgeschwindigkeitszentrifugation (800 x g oder 1.280 x g, 15 min) der Fettgewebefragmente. Dann wird das Pellet mit einem Lysepuffer für rote Blutkörperchen (5 min) inkubiert, gefolgt von einem weiteren Zentrifugationsschritt bei 600 x g vor der Resuspension in Kulturmedium. Obwohl in den ersten Tagen im Vergleich zu den Explantatmethoden eine größere Anzahl von Zellen isoliert wurde, zeigte eine frühere Studie eine geringere oder fehlende Proliferation über die zweite Kulturwoche hinaus⁸.

Darüber hinaus ist eine weitere Manipulation mit xenogenem zugesetztem Medium, wie z. B. fetalem Rinderserum (FBS), das als Wachstumsfaktorergänzung für die Zellkultur verwendet wird, mit einem erhöhten Risiko für Immunreaktivität und Exposition gegenüber viralen, bakteriellen oder Prioneninfektionen des Wirtspatienten verbunden ^9,10. Immunreaktionen und die Entwicklung urtikariformer Hautausschläge wurden bereits bei Personen beschrieben, die mehrere Dosen mesenchymaler Stammzellen erhielten, die mit FBS¹¹ hergestellt wurden. Darüber hinaus unterliegt FBS einer Variabilität von Charge zu Charge, die sich auf die Qualität des Endprodukts auswirken kann¹².

In Übereinstimmung mit den Richtlinien der Guten Herstellungspraxis (GMP) sollte eine enzymatische Gewebedissoziation vermieden und FBS durch xenogenfreie Nahrungsergänzungsmittel ersetzt werden. Diese Schritte sind zusammen mit zuverlässigeren und reproduzierbareren Protokollen unerlässlich, um die Anwendung der Zelltherapie zu unterstützen ^3,13.

In diesem Zusammenhang wurde humanes Thrombozytenlysat (hPL) als Ersatz für FBS vorgeschlagen, da es sich um ein zellfreies, proteinhaltiges, mit Wachstumsfaktoren angereichertes Nahrungsergänzungsmittel handelt, und es wurde früher unter den zellbasierten Produkten in klinischer Qualität als Zusatz von Wachstumsmedium für die In-vitro-Zellkultur und -expansion eingeführt^14,15. Da es sich bei hPL um ein vom Menschen stammendes Produkt handelt, wird es häufig als Ersatz für FBS während der In-vitro-Kultur von hASCs verwendet, die für klinische Anwendungen bestimmt sind, wodurch Probleme in Bezug auf immunologische Reaktionen und Infektionen im Zusammenhang mit der FBS-Übersetzbarkeit reduziert^{werden 15,16}.

Trotz der höheren Produktionskosten konnte bereits gezeigt werden, dass hPL im Vergleich zu FBS die Zelllebensfähigkeit für viele Zelltypen unterstützt, die Proliferation erhöht, die Seneszenz verzögert, die genomische Stabilität gewährleistet und den zellulären Immunphänotyp auch in späten Zellpassagen konserviert. All diese Elemente unterstützen den Wechsel zu dieser Kulturergänzung¹¹.

Ziel dieser Arbeit war es, ein standardisiertes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von hASCs mit einer vollständig tierversuchsfreien Methode zu entwickeln, ohne die Zellphysiologie und die Stammeigenschaften im Vergleich zu klassischen FBS-kultivierten hASCs zu verändern (Abbildung 1).

Protokoll

hASCs wurden aus dem abdominalen Fettgewebe einer gesunden Frau isoliert, die sich am Universitätsspital Lausanne, CHUV, Lausanne, Schweiz, einer Brustrekonstruktion mit abdominalen Autolappen (tiefe untere epigastrische Perforatorlappen, [DIEP]) unterzogen hatte. Der verworfene Teil des Lappens und das Fettgewebe wurden erhalten, nachdem der Patient eine Einverständniserklärung unterschrieben hatte. Alle Protokolle wurden von der Biobank-Abteilung DAL (Nummer 314 GGC) und den Ethikkommissionen des Krankenhauses in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki geprüft und genehmigt.

HINWEIS: Alle Schritte müssen unter einer Laminar-Flow-Haube und unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden. Handschuhe und Laborkittel zum persönlichen Schutz sollten immer getragen werden, und alle Oberflächen sollten mit geeigneten Bioziden gewaschen werden. Überschüssiges Gewebe sollte ordnungsgemäß als biomedizinischer Abfall entsorgt werden.

1. Benötigte Materialien und Vorbereitung der Kulturlösungen

1. Besorgen Sie sich für die Zellisolierung, -expansion und -kryokonservierung die folgenden Instrumente: sterile Schere; sterile Skalpelle; sterile Pinzette; eine 10 cm Petrischale; 15-ml-Röhrchen; T25-Kolben; eine Burker-Kammer; Kryozellen; ein Gefrierbehälter für Zellen; ein optisches Mikroskop mit Objektiven mit 4-facher und 10-facher Vergrößerung; und eine schwingende Eimerzentrifuge.
2. Für die Immunphänotypisierung erhalten Sie die folgenden Instrumente und Reagenzien: FACS-Röhrchen, sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS); Dulbeccos minimales essentielles Medium (DMEM); hPL; Dimethylsulfid; und tierversuchsfreies Trypsin.
3. Bereiten Sie das komplette Nährmedium vor, indem Sie DMEM mit 5% heparinfreiem hPL ergänzen. Lagern Sie das Medium bis zu 3 Wochen bei 4 °C und verwenden Sie es immer warm (zwischen Raumtemperatur und 37 °C). Befolgen Sie die GMP-Richtlinien für die Herstellung von Zellarzneimitteln, die für die Humantherapie bestimmt sind, und fügen Sie dem Nährmedium keine Antibiotika hinzu.
4. Bereiten Sie ein Gefriermedium vor, das 20% hPL und 10% Dimethylsulfid in DMEM enthält.

2. Isolierung von hASCs aus der Fettgewebsprobe

1. Verarbeiten Sie die Fettgewebsprobe innerhalb von 6 Stunden nach der Gewinnung. Bevor Sie mit der etablierten mechanischen xenogenfreien Isolationsmethode fortfahren, waschen Sie das Gewebe 2x mit PBS für 10 Minuten, bis Bindegewebe und Blut freigesetzt werden.
2. Lagern Sie die erhaltene Fettgewebsprobe aus der abdominoplastischen Chirurgie bis zur Verarbeitung in PBS bei 4° C und in jedem Fall nicht länger als 24 h, um die hASC-Lebensfähigkeit nicht zu beeinträchtigen.
3. Schneiden Sie das Fettgewebe mit einer sterilen Schere in kleinere Stücke von ca. 1 cm² .
4. Zerlegen Sie jedes Stück mit einem Skalpell in kleine Fragmente mit einem Durchmesser <5 mm und verteilen Sie fünf davon in einer 10-cm-Petrischale (Abbildung 2A).
5. Um jedes Fragment zu befestigen, verwenden Sie das Skalpell, um Einschnitte auf der Kunststoffoberfläche zu machen, und ziehen Sie jedes Fragment, bis es fest an der Petrischale klebt. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Fragment zu handhaben (Abbildung 2B).
6. Fügen Sie vorsichtig 10 ml des vollständigen Nährmediums hinzu, um alle Fragmente abzudecken, ohne sie abzulösen.
7. Die Petrischalen werden bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert. Die hASCs wandern aus dem Gewebe und werden aufgrund ihrer plastischen Adhärenz ohne enzymatische Verdauung selektiert.
8. Überwachen Sie die hASC-Ausdehnung bis zur Zellkonfluenz einmal täglich unter einem optischen Mikroskop bei 4-facher Vergrößerung. Wenn die hASCs beginnen, aus dem Gewebe auszutreten, erscheinen sie als kleine Cluster um die Gewebestücke mit einer typischen fibroblastenähnlichen Morphologie. Die hASCs werden aufgrund ihrer Fähigkeit ausgewählt, an der Kunststoffoberfläche zu haften. Entfernen Sie alle 72 h so viel Medium wie möglich und ersetzen Sie es durch frisches vollständiges Medium, um Zelltrümmer zu entfernen.
9. Lassen Sie die Gewebefragmente bis zum ersten Zelldurchgang, der normalerweise nach 7 Tagen erfolgt, an Ort und Stelle.

3. hASC-Kultur nach der Isolationsphase

1. Wenn die hASC-Kultur eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreicht, können die hASCs abgelöst und weiter expandiert werden, um entweder für andere Experimente oder für die Langzeitlagerung verwendet zu werden.
2. Entfernen Sie mit einer sterilen Pinzette alle Gewebestücke aus der Petrischale und entsorgen Sie sie. Entfernen Sie das erschöpfte Medium und entsorgen Sie es, wobei Sie darauf achten, die hASCs nicht zu berühren, um sie nicht zu lösen.
3. Waschen Sie die Zellen einmal vorsichtig mit 10 ml PBS. 1 ml 1x tierfreies Trypsin zugeben und die Petrischale 5 min bei 37 °C im Inkubator stehen lassen.
4. Überprüfen Sie unter einem optischen Mikroskop bei 4-facher Vergrößerung, ob sich alle Zellen gelöst haben. Andernfalls lassen Sie die Petrischale weitere 2 Minuten im Inkubator und klopfen Sie schließlich vorsichtig auf die Kunststoffoberfläche, um die Zellablösung zu unterstützen.
5. Stoppen Sie die Trypsin-Wirkung, indem Sie 2 ml des vollständigen Mediums hinzufügen und alle Zellen in einem 15-ml-Röhrchen sammeln.
6. Um das restliche Trypsin zu entfernen, zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 x g für 5 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand, suspendieren Sie die Zellen mit 5 ml vollständigem Medium und überführen Sie die Zellsuspension in einen neuen T25-Kolben. Halten Sie die hASCs in Kultur und erweitern Sie sie, bis sie benötigt werden.

4. Immunphänotypuntersuchung mittels Durchflusszytometrie

1. Wenn die hASC-Kultur eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreicht, trennen Sie die hASCs wie zuvor in Abschnitt 3 beschrieben.
2. Nachdem Sie die Zellen gesammelt haben, suspendieren Sie sie in 1 ml vollständigem Medium und zählen Sie ein Aliquot mit dem Zellzähler unter einem optischen Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung.
3. Zentrifugieren Sie die hASCs bei 300 x g für 5 min und suspendieren Sie sie bei 1 x 10⁶ Zellen/ml FACS-Puffer. 100 μl der Suspension mit 1 x 10⁵ Zellen werden in ein FACS-Röhrchen überführt. Verwenden Sie ein FACS-Röhrchen für jedes untersuchte Antigen sowie ein weiteres für jede isotypische Kontrolle.
4. Färben Sie die Zellen mit 100 μl der folgenden Antikörper, verdünnt in FACS-Puffer: Anti-CD73 (1:1.000, IgG1, FITC-markiert), Anti-CD105 (1:200, IgG1, PE-markiert); Anti-CD34 (1:66, IgG1, FITC-markiert); Anti-CD45 (1:66, IgG1, FITC-markiert); und isotypische Kontrollen für jedes Fluorophor, IgG1 FITC-markiert (1:1.000) und IgG1 PE-markiert (1:50).
5. Inkubation der Proben für 1 h im Dunkeln unter Rühren bei 4 °C. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 x g für 5 min, verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 500 μl FACS-Puffer.
6. Beurteilen Sie den Immunphänotyp der Zelle mit einem Durchflusszytometrie-Gerät und zeichnen Sie 50.000 Ereignisse für jedes Röhrchen innerhalb des Tors auf, das ausgewählt wurde, um Zelltrümmer auszuschließen. Berechnen Sie den Prozentsatz der exprimierenden Zellen als Differenz zur spezifischen isotypischen Kontrolle.

5. Proliferationstest von hASC

1. Wenn die hASC-Kultur eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreicht, trennen Sie die hASCs wie in Abschnitt 3 beschrieben.
2. Nachdem Sie die Zellen gesammelt haben, suspendieren Sie sie in 1 ml vollständigem Medium und zählen Sie ein Aliquot mit dem Zellzähler unter einem optischen Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung.
3. Aussaat von 5 x 10² hASCs in 200 μl vollständigem Medium in transparenten 96-Well-Platten. Säen Sie die Zellen in technische Replikate, mit einer Vertiefung für jeden Zeitpunkt.
4. Beginnen Sie 3 Tage nach der Aussaat mit dem Nachweis der Zellproliferation mit einem Proliferations-Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Kurz gesagt, ersetzen Sie das Kulturmedium durch 100 μl frisches Medium, das zu 20 μl Assay-Reagenz pro Vertiefung hinzugefügt wird. Inkubieren Sie die hASCs 2,5 h lang bei 37 °C, 5 % CO₂ für die Reagenzienentwicklung und messen Sie dann die Absorption bei 490 nm mit einem Spektralphotometer.
5. Drücken Sie die hASC-Proliferation als prozentuale Absorption nach Entfernung der Blindabsorption aus.

6. Kryokonservierung und Lagerung der hASCs

1. Lösen Sie die Zellen wie in Abschnitt 3 beschrieben ab und zählen Sie ein Aliquot mit dem Zellzähler unter einem Lichtmikroskop bei 10-facher Vergrößerung.
2. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min und verwerfen Sie den Überstand. Suspendieren Sie die Zellen mit einer Gefriermischung bei einer Dichte von 1 x 10⁶ hASCs/ml und geben Sie 1 ml der Zelllösung in ein Kryoventil.
3. Legen Sie die Kryobiale bei −80 °C in einen Gefrierbehälter, der die Temperatur um 1 °C/min senkt, und stellen Sie die Kryobiale dann zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff.

Ergebnisse

Unter Anwendung der oben beschriebenen Isolationsmethode wurden hASCs erfolgreich aus abdominalen Fettgewebeproben ohne den Einsatz von Kollagenase gewonnen. Darüber hinaus wurden die hASCs unter vollständig xenogenfreien Bedingungen in Gegenwart von hPL und ohne weitere Bestandteile tierischen Ursprungs expandiert. Die folgenden Ergebnisse unterstützen das Protokoll und werden aus hASCs gewonnen, die parallel zu hPL und mit FBS als Kontrollbedingung kultiviert wurden.

Nach dem ersten Clust...

Diskussion

Aus Fett gewonnene Stammzellen haben in den letzten zehn Jahren aufgrund ihrer Häufigkeit, ihrer schnellen und erschwinglichen Isolationsmethoden, ihrer hohen In-vitro/In-vivo-Proliferationsrate und ihrer Stamm-/Differenzierungseigenschaften das Interesse der translationalen Forschung geweckt^18,19,20. Daher gelten hASCs als hervorragender Kandidat für zellbasierte Strategien in der regenerativen Medizin

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL tubes	euroclone	et5015b
anti-CD105	BD Biosciences	BD560839
anti-CD34	BD Biosciences	BD555821
anti-CD45	BD Biosciences	BD555482
anti-CD73	BD Biosciences	BD561254
autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer)	Miltenyi	130-091-222
BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument)	BD accuri	-
Burker chamber	Blaubrand	717810
Cell freezing container	corning	CLS432002
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay	Promega	G3582
CoolCell Freezing container	Corning	CLS432002
Cryovials	clearline	390701
Dimethyl sulfide	Sigma Aldrich	D2650-100mL
disposabile blade scalpel	paragon	bs 2982
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose	GIBCO	11965092
Human Platelet Lysate FD (GMP grade)	Stemulate	PL-NH-500
Infinite F50 spectrophotometer	Tecan	-
Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives	Olympus	CKX41
Petri dish 10 cm	Greiner bio-one	664160
Sterile scalpels	Reda	07104-00
Sterile scissors	Bochem	4071
Sterile tweezers	Bochem	1152
Swinging bucket centrifuge	Sigma	3-16K
T25 flasks	Greiner bio-one	6910170
TrypLe (animal free trypsin substitute)	GIBCO	12604-013