인간 지방 유래 줄기 세포의 분리 및 배양 (Isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative Xenogeneic-free method for human therapy)

요약

세포 치료제 준비/조작 단계에 도입된 이종(화학적 또는 동물 유래) 제품은 숙주 환자에서 면역 반응성 및 병원성 전파의 위험 증가와 관련이 있습니다. 여기서, 인간 지방유래 줄기세포의 분리 및 시험관내 확장을 위한 완전한 이종발생학적 무함유 방법이 기재되어 있다.

초록

줄기 세포 치료의 증가하는 영향을 고려할 때, 체외 조작 중 동물 유래 제품의 도입으로 인한 잠재적 오염 또는 감염 전파에 대한 생물학적 안전성 문제가 제기되었습니다. 세포 분리 및 확장 단계에서 일반적으로 사용되는 콜라게나제 또는 소 태아 혈청과 같은 이종 성분은 수용 환자의 면역 반응성 또는 바이러스, 박테리아 및 프리온 감염의 잠재적 위험과 관련될 수 있습니다. Good Manufacturing Practice 지침에 따라 화학적 조직 해리를 피해야 하며 소 태아 혈청(FBS)은 이종성이 없는 보충제로 대체할 수 있습니다. 또한, 셀 제품의 안전성을 보장하기 위해서는 보다 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법의 정의가 중요합니다. 우리는 콜라겐 분해 효소 FBS 배양 표준 프로토콜과 비교하여 특성을 변경하지 않고 인간 지방 유래 줄기 세포의 분리 및 시험관 내 확장을 위한 혁신적이고 완전히 이종 발생이 없는 방법을 개발했습니다. 여기서, 복부 지방 조직으로부터 인간 지방유래 줄기세포(hASCs)를 분리하였다. 샘플을 가위/메스로 기계적으로 다진 후 미세 해부하고 10cm 페트리 접시에 기계적으로 분산시킨 다음 메스 절개로 준비하여 조직 조각의 부착과 hASC의 이동을 용이하게 했습니다. 세척 단계에 따라, hASC는 효소 소화 없이 소성 부착으로 인해 선택되었습니다. 분리된 hASC를 5% 헤파린이 없는 인간 혈소판 용해물이 보충된 배지로 배양하고 동물이 없는 트립신 대체물로 분리했습니다. 인간 치료용 세포 제품 생산에 대한 GMP(Good Manufacturing Practice) 지침에 따라 모든 배양 배지에 항생제를 사용하지 않았습니다.

서문

지난 수십 년 동안 혁신적인 치료법에 대한 수요가 증가함에 따라 중개 의학 분야에 상당한 노력과 자원 투자가 이루어졌습니다¹. 세포 기반 제품은 세포 공급원, 제조 공정(분리, 확장 또는 유전자 변형) 및 비세포 보충제(효소, 성장 인자, 배양 보충제 및 항생제)에 의해 결정되는 위험과 관련이 있으며 이러한 위험 요소는 특정 치료 적응증에 따라 다릅니다. 최종 제품의 품질, 안전성 및 효능은 위에 명시된 요소²에 의해 크게 영향을 받을 수 있습니다. 줄기 세포 치료는 생물 안전 원칙을 준수해야합니다. 세포 배양에서 동물 유래 제품으로 인한 병원성 전파의 잠재적 위험은 문제가 될 수 있으며 제조에 도입된 모든 제품에 대한 철저한 테스트가 필수적입니다³.

인간 지방유래 줄기세포(hASC)를 분리하는 전통적인 방법은 콜라게나제(collagenase)를 이용한 효소 분해 후 원심분리를 통한 세척 단계를 거친다⁴. 효소 분리는 일반적으로 세포 수율 및 생존력 측면에서 다른 기계적 기술보다 더 효율적인 것으로 간주되지만, 콜라게나제와 같은 동물 유래 성분은 미국 식품의약국(FDA)에서 최소한으로 조작하는 것 이상으로 간주됩니다. 이는 면역 반응이나 질병 전파의 위험이 현저히 증가하여 hASC 요법의 임상 환경으로의 번역을 제한한다는^{것을 의미합니다 5,6}.

트립신 기반 소화는 ASC를 분리하는 또 다른 효소 프로토콜입니다. 트립신 농도, 원심분리 속도 및 배양 시간 측면에서 약간의 수정을 가하여 다양한 기술이 설명되었습니다. 안타깝게도 이 방법은 잘 설명되어 있지 않으며, 문헌, 특히 기계적 격리 프로토콜⁷에 대한 비교가 부족하다. 그러나, 접근법의 번역 가능성의 관점에서, 트립신은 콜라게나제와 동일한 단점을 가지고 있습니다.

기계적 힘에 기초하고 효소를 첨가하지 않고 ASC를 얻기 위한 대체 분리 방법에는 지방 조직 조각의 고속 원심분리(800 x g 또는 1,280 x g, 15분)가 포함됩니다. 이어서, 펠렛을 적혈구 용해 완충액(5분)과 함께 인큐베이션한 후, 배양 배지에서 재현탁하기 전에 600 x g에서 또 다른 원심분리 단계를 거친다. 체외이식편 방법에 비해 첫 번째 날에 더 많은 수의 세포가 분리되었음에도 불구하고, 이전 연구에서는 배양 2주 이후에 증식이 더 낮거나 없는 것으로 나타났다⁸.

그 외에도, 세포 배양을 위한 성장 인자 보충제로 사용되는 소 태아 혈청(FBS)과 같은 이종 첨가 배지를 사용한 추가 조작은 숙주 환자의 면역 반응성 위험 증가 및 바이러스, 박테리아 또는 프리온 감염에 대한 노출과 관련이 있다 ^9,10. 면역 반응과 두드러기형 발진 발달은 FBS¹¹로 생산된 중간엽 줄기 세포를 여러 번 투여받은 개인에서 이미 설명되었습니다. 또한, FBS는 배치-배치(batch-to-batch) 변동성을 가지며, 이는 최종 제품 품질에 영향을 미칠 수 있다¹².

GMP(Good Manufacturing Practice) 지침에 따라 효소 조직 해리를 피해야 하며 FBS는 이종유전자가 없는 보충제로 대체해야 합니다. 이러한 단계들은 보다 신뢰할 수 있고 재현 가능한 프로토콜과 함께, 세포 치료제의 적용을 지원하는 데 필수적이다 ^3,13.

이러한 맥락에서, 인간 혈소판 용해물(hPL)은 무세포, 단백질 함유, 성장 인자 강화 보충제이기 때문에 FBS의 대체품으로 제안되어 왔으며, 시험관 내 세포 배양 및 확장을 위한 성장 배지의 첨가제로서 임상 등급 세포 기반 제품들 사이에 일찍이 도입되었다^14,15. hPL은 인간 유래 제품이기 때문에 임상 적용을 위한 hASC의 체외 배양 중에 FBS의 대체물로 자주 사용되어 FBS 번역성과 관련된 면역학적 반응 및 감염과 관련된 문제를 줄입니다^15,16.

더 높은 생산 비용에도 불구하고 FBS에 비해 hPL은 많은 세포 유형에 대한 세포 생존력을 지원하고, 증식을 증가시키고, 노화를 지연시키고, 게놈 안정성을 보장하고, 후기 세포 계대에서도 세포 면역 표현형을 보존한다는 것이 이미 입증되었습니다. 이러한 모든 요소는 이 문화 보충¹¹로의 전환을 지원합니다.

이 연구의 목적은 기존의 FBS 배양 hASC와 비교하여 세포 생리학 및 줄기 특성을 수정하지 않고 완전한 동물 없는 방법으로 hASC를 분리 및 배양하는 표준화된 프로토콜을 개발하는 것이었습니다(그림 1).

프로토콜

hASC는 스위스 로잔 CHUV에 있는 로잔 대학 병원에서 복부 자가 피판(심부 하복부 천공 피판, [DIEP])을 사용하여 유방 재건술을 받은 건강한 여성의 복부 지방 조직에서 분리되었습니다. 플랩의 폐기된 부분과 지방 조직은 환자가 정보에 입각한 동의서에 서명한 후 얻었습니다. 모든 프로토콜은 헬싱키 선언에 따라 병원의 바이오뱅크 부서 DAL(번호 314 GGC) 및 윤리 위원회에서 검토하고 승인했습니다.

알림: 모든 단계는 층류 후드와 무균 조건에서 수행해야 합니다. 개인 보호를 위한 장갑과 실험복은 항상 착용해야 하며 모든 표면은 적절한 살생물제로 세척해야 합니다. 과도한 조직은 생물 의학 폐기물로 적절하게 처리해야 합니다.

1. 필요한 재료 및 배양 용액 준비

1. 세포 분리, 확장 및 냉동 보존을 위해 다음 기기를 구하십시오: 멸균 가위; 멸균 메스; 멸균 핀셋; 10cm 페트리 접시; 15mL 튜브; T25 플라스크; 버커 챔버; 극저온; 세포 동결 용기; 4x 및 10x 배율 대물렌즈를 가진 광학 현미경; 그리고 스윙 버킷 원심 분리기.
2. 면역 표현형을 위해, 다음의 기구 및 시약을 얻는다: FACS 튜브, 멸균 인산염 완충 식염수 (PBS); 둘베코의 최소 필수 배지 (DMEM); hPL입니다. 디메틸 설파이드; 그리고 동물성 없는 트립신.
3. DMEM에 5% 헤파린이 없는 hPL을 보충하여 완전한 배양액을 준비합니다. 배지를 4°C에서 최대 3주 동안 보관하고 항상 따뜻하게 사용하십시오(실온에서 37°C 사이). 인간 치료를위한 세포 의약품 생산에 대한 GMP 지침에 따라 배양 배지에 항생제를 첨가하지 마십시오.
4. DMEM에서 20% hPL과 10% 디메틸설파이드를 포함하는 동결배지를 준비한다.

2. 지방 조직 샘플에서 hASC의 분리

1. 지방 조직 샘플을 얻은 후 6시간 이내에 처리합니다. 확립된 기계적 이종발생이 없는 분리 방법을 진행하기 전에 결합 조직과 혈액이 방출될 때까지 10분 동안 PBS로 조직을 2배 세척합니다.
2. hASC 생존력을 손상시키지 않기 위해, 복부성형수술로부터 얻어진 지방 조직 샘플을 처리될 때까지 4°C에서 PBS에 보관하고, 어떤 경우에도 24시간 이하로 보관한다.
3. 멸균 가위로 지방 조직을 약 1cm² 의 작은 조각으로 자릅니다.
4. 메스를 사용하여 각 조각을 직경 <5mm의 작은 조각으로 미세 해부하고 그 중 5개를 10cm 페트리 접시에 분산시킵니다(그림 2A).
5. 각 조각을 부착하려면 메스를 사용하여 플라스틱 표면에 절개를 만들고 페트리 접시에 단단히 붙을 때까지 각 조각을 끕니다. 핀셋을 사용하여 조각을 처리할 수 있습니다(그림 2B).
6. 모든 단편을 분리하지 않고 덮을 수 있도록 완전한 배양 배지 10mL를 부드럽게 추가합니다.
7. 페트리 접시를 37°C 및 5%_CO2에서 배양한다. hASC는 조직 밖으로 이동하여 효소 소화 없이 소성 부착으로 인해 선택됩니다.
8. 세포가 합류할 때까지 하루에 한 번 4배 배율로 광학 현미경으로 hASC 확장을 모니터링합니다. hASC가 조직에서 빠져 나오기 시작하면 전형적인 섬유 아세포와 같은 형태를 가진 조직 조각 주위에 작은 클러스터로 나타납니다. hASC는 플라스틱 표면에 부착할 수 있는 능력 때문에 선택됩니다. 72시간마다 가능한 한 많은 배지를 제거하고 세포 파편을 제거하기 위해 새로운 완전 배지로 교체합니다.
9. 일반적으로 7 일 후에 세포의 첫 번째 통과가 이루어질 때까지 조직 조각을 그대로 두십시오.

3. 분리 단계 후의 hASC 배양

1. hASC 배양이 70%-80% 밀도에 도달하면 hASC를 분리하고 추가로 확장하여 다른 실험이나 장기 보관에 사용할 수 있습니다.
2. 멸균 핀셋을 사용하여 페트리 접시에서 모든 티슈 조각을 제거하고 버립니다. hASC를 분리하지 않도록 만지지 않도록 주의하면서 소진된 매체를 제거하고 폐기하십시오.
3. PBS 10mL로 세포를 조심스럽게 한 번 세척합니다. 1x 동물성 없는 트립신 1mL를 넣고 페트리 접시를 37°C의 인큐베이터에 5분 동안 둡니다.
4. 모든 세포가 분리되었는지 4배 배율로 광학 현미경으로 확인합니다. 그렇지 않으면 페트리 접시를 인큐베이터에 추가로 2분 동안 그대로 두고 플라스틱 표면을 부드럽게 두드려 세포 분리를 지원합니다.
5. 2mL의 완전 배지를 추가하여 트립신 작용을 중지하고 15mL 튜브에 모든 세포를 수집합니다.
6. 남아 있는 트립신을 제거하기 위해 튜브를 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 5mL의 완전 배지로 세포를 현탁한 다음 세포 현탁액을 새로운 T25 플라스크에 옮깁니다. hASC를 배양 물에 보관하고 필요할 때까지 확장하십시오.

4. 유세포 분석에 의한 면역표현형 조사

1. hASC 배양이 70%-80% 밀도에 도달하면 섹션 3에서 설명한 대로 hASC를 분리합니다.
2. 세포를 수집한 후 1mL의 완전 배지에 현탁하고 광학 현미경으로 10x 배율로 세포 계수기로 분취량을 계산합니다.
3. hASC를 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 1 x 10⁶ cells/mL의 FACS 완충액에서 현탁합니다. 1 x 10⁵ 세포를 함유하는 현탁액 100 μL을 하나의 FACS 튜브에 옮깁니다. 조사된 각 항원에 대해 하나의 FACS 튜브를 사용하고 각 동형 대조군에 대해 하나의 FACS 튜브를 더 사용합니다.
4. FACS 완충액에 희석된 다음 항체 100μL로 세포를 염색합니다: 항-CD73(1:1,000, IgG1, FITC 표지), 항-CD105(1:200, IgG1, PE 표지); 항-CD34 (1:66, IgG1, FITC-표지됨); 항-CD45 (1:66, IgG1, FITC-표지됨); 및 각 형광단, IgG1 FITC 표지(1:1,000) 및 IgG1 PE 표지(1:50)에 대한 동형 대조군.
5. 샘플을 4°C에서 교반하면서 암실에서 1시간 동안 인큐베이션합니다. 튜브를 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 버리고, 500 μL의 FACS 완충액에 세포를 현탁시킵니다.
6. 유세포 분석 기기로 세포 면역표현형을 평가하고, 세포 파편을 배제하기 위해 선택된 게이트 내부의 각 튜브에 대해 50,000개의 이벤트를 기록합니다. 발현 세포의 백분율을 특정 동형 대조군과의 차이로 계산합니다.

5. hASC의 증식 분석

1. hASC 배양이 70%-80% 밀도에 도달하면 섹션 3에 설명된 대로 hASC를 분리합니다.
2. 세포를 수집한 후 1mL의 완전 배지에 현탁하고 광학 현미경으로 10x 배율로 세포 계수기로 분취량을 계산합니다.
3. 96웰 투명 플레이트에서 200μL의 완전 배지에 5 x 10^2hASC 를 시드합니다. 각 시점에 대해 하나의 웰을 사용하여 기술 반복실험에서 셀을 시드합니다.
4. 파종 후 3일째에 제조업체의 지침에 따라 증식 분석 키트를 사용하여 세포 증식을 검출하기 시작합니다. 간단히 말해서, 배양 배지를 웰당 20 μL의 분석 시약에 첨가된 100 μL의 새로운 배지로 교체합니다. 시약 개발을 위해 hASC를 37°C, 5%_CO2 에서 2.5시간 동안 배양한 다음 분광광도계로 490nm에서 흡광도를 검출합니다.
5. hASC 증식을 블랭크 흡광도를 제거한 후의 흡광도 백분율로 표현한다.

6. hASC의 냉동 보존 및 보관

1. 섹션 3에 설명된 대로 세포를 분리하고 10x 배율의 광학 현미경 하에서 세포 계수기로 분취량을 계수합니다.
2. 세포를 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 1 x 10⁶ hASCs/mL의 밀도로 동결 혼합물로 세포를 현탁하고 1mL의 세포 용액을 하나의 극저온 난에 옮깁니다.
3. 온도를 1°C/min으로 낮추는 냉동 용기에 -80°C의 극저온 액체를 넣은 다음 장기 보관을 위해 극저온 액체를 액체 질소로 옮깁니다.

결과

위에서 설명한 분리 방법을 적용하면 콜라게나제를 사용하지 않고 복부 지방 조직 샘플에서 hASC를 성공적으로 얻을 수 있습니다. 더욱이, hASC는 hPL의 존재 하에 그리고 동물 기원의 다른 성분 없이 완전한 이종유전자가 없는 조건에서 확장되었다. 다음 결과는 프로토콜을 지원하며 hPL 및 FBS를 대조 조건으로 병행하여 배양된 hASC에서 얻습니다.

초기 클러스터 출현 후, hASC는 고...

토론

지방유래 줄기세포는 풍부함, 빠르고 저렴한 분리 방법, 높은 in vitro/in vivo 증식률 및 줄기/분화 특성으로 인해 지난 10년 동안 중개 연구의 관심을 끌었습니다^18,19,20. 그 결과, hASC는 재생 의학에서 세포 기반 전략의 우수한 후보로 간주된다²¹. 지방 조직으로부터 분리된 후, hASC는 시험관 내에?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL tubes	euroclone	et5015b
anti-CD105	BD Biosciences	BD560839
anti-CD34	BD Biosciences	BD555821
anti-CD45	BD Biosciences	BD555482
anti-CD73	BD Biosciences	BD561254
autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer)	Miltenyi	130-091-222
BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument)	BD accuri	-
Burker chamber	Blaubrand	717810
Cell freezing container	corning	CLS432002
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay	Promega	G3582
CoolCell Freezing container	Corning	CLS432002
Cryovials	clearline	390701
Dimethyl sulfide	Sigma Aldrich	D2650-100mL
disposabile blade scalpel	paragon	bs 2982
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose	GIBCO	11965092
Human Platelet Lysate FD (GMP grade)	Stemulate	PL-NH-500
Infinite F50 spectrophotometer	Tecan	-
Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives	Olympus	CKX41
Petri dish 10 cm	Greiner bio-one	664160
Sterile scalpels	Reda	07104-00
Sterile scissors	Bochem	4071
Sterile tweezers	Bochem	1152
Swinging bucket centrifuge	Sigma	3-16K
T25 flasks	Greiner bio-one	6910170
TrypLe (animal free trypsin substitute)	GIBCO	12604-013