בידוד ותרבית של תאי גזע שמקורם בשומן אנושי בשיטה חדשנית נטולת קסנוגניות לטיפול בבני אדם

Summary

מוצרים קסנוגניים (כימיים או מן החי) שהוכנסו בשלבי ההכנה/מניפולציה של הטיפול התא קשורים לסיכון מוגבר לתגובתיות חיסונית ולהעברה פתוגנית בחולים מארחים. כאן מתוארת שיטה שלמה נטולת קסנוגנים לבידוד והרחבה חוץ גופית של תאי גזע שמקורם בשומן אנושי.

Abstract

בהתחשב בהשפעה הגוברת של טיפול בתאי גזע, הועלו חששות בטיחות ביולוגית לגבי זיהום פוטנציאלי או העברת זיהום עקב הכנסת מוצרים שמקורם מן החי במהלך מניפולציה חוץ גופית . המרכיבים הקסנוגניים, כגון collagenase או סרום בקר עוברי, המשמשים בדרך כלל במהלך שלבי בידוד והרחבת התאים עשויים להיות קשורים לסיכונים פוטנציאליים של תגובתיות חיסונית או זיהום נגיפי, חיידקי ופריון בחולים המקבלים. בהתאם להנחיות נוהלי ייצור נאותים, יש להימנע מדיסוציאציה של רקמות כימיות, בעוד שניתן להחליף את סרום הבקר העוברי (FBS) בתוספים נטולי קסנוגניות. יתר על כן, כדי להבטיח את הבטיחות של מוצרי התא, ההגדרה של שיטות אמינות יותר לשחזור חשוב. פיתחנו שיטה חדשנית, נטולת קסנוגניות לחלוטין לבידוד והרחבה חוץ גופית של תאי גזע אנושיים שמקורם בשומן מבלי לשנות את תכונותיהם בהשוואה לפרוטוקולים סטנדרטיים של קולגנאז בתרבית FBS. כאן, תאי גזע שמקורם בשומן אנושי (hASCs) בודדו מרקמת השומן הבטנית. הדגימה נטחנה באופן מכני עם מספריים/אזמל, נותחה במיקרו ופוזרה מכנית בצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ, והוכנה עם חתכי אזמל כדי להקל על חיבור שברי הרקמה ונדידת hASCs. לאחר שלבי השטיפה, נבחרו hASCs בשל היצמדות הפלסטיק שלהם ללא עיכול אנזימטי. ה-hASCs המבודדים גודלו בתרבית עם תוספת בינונית עם 5% ליזט טסיות אדם ללא הפרין ומנותקים עם תחליף טריפסין ללא בעלי חיים. בעקבות הנחיות GMP (תנאי ייצור נאותים) על ייצור מוצרי תאים המיועדים לטיפול בבני אדם, לא נעשה שימוש באנטיביוטיקה בשום אמצעי תרבית.

Introduction

בעשורים האחרונים, הביקוש הגובר לטיפולים טיפוליים חדשניים הוליד מאמצים משמעותיים והשקעת משאבים בתחום הרפואה התרגומית¹. מוצרים מבוססי תאים קשורים לסיכונים הנקבעים על ידי מקור התא, תהליך הייצור (בידוד, הרחבה או שינוי גנטי), והתוספים הלא-תאיים (אנזימים, גורמי גדילה, תוספי תרבית ואנטיביוטיקה), וגורמי סיכון אלה תלויים בהתוויה הטיפולית הספציפית. האיכות, הבטיחות והיעילות של המוצר הסופי עשויים להיות מושפעים עמוקות מהאלמנטים שצוינו לעיל². טיפול בתאי גזע דורש דבקות בעקרונות הבטיחות הביולוגית; הסיכונים הפוטנציאליים של העברה פתוגנית עם מוצרים שמקורם מן החי בתרבית תאים עלולים להיות בעייתיים, ובדיקה יסודית של כל מוצר שהוכנס לייצור היא חיונית³.

השיטה המסורתית לבידוד תאי גזע שמקורם בשומן אנושי (hASCs) כוללת עיכול אנזימטי המבוצע עם collagenase ואחריו שטיפת שלבים באמצעות צנטריפוגה⁴. בעוד בידוד אנזימטי נחשב בדרך כלל יעיל יותר מאשר טכניקות מכניות אחרות במונחים של תפוקת תאים וכדאיות, רכיבים שמקורם מן החי בשימוש, כגון collagenase, נחשבים יותר מניפולציה מינימלית על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי. משמעות הדבר היא שיש סיכון מוגבר באופן משמעותי לתגובות חיסוניות או העברת מחלות, ובכך להגביל את התרגום של טיפול hASC להגדרות קליניות ^5,6.

עיכול מבוסס טריפסין הוא פרוטוקול אנזימטי נוסף לבידוד ASC. טכניקות שונות תוארו עם שינויים קלים במונחים של ריכוז טריפסין, מהירות צנטריפוגה, וזמן הדגירה. למרבה הצער, שיטה זו אינה מתוארת היטב, וחוסר השוואה קיים בספרות, במיוחד עם פרוטוקולי בידוד מכני⁷. עם זאת, במונחים של תרגום של הגישה, טריפסין יש את אותם חסרונות של collagenase.

שיטות בידוד חלופיות להשגת ASCs, המבוססות על כוחות מכניים וללא תוספת אנזימים, כוללות צנטריפוגה במהירות גבוהה (800 x גרם או 1,280 x גרם, 15 דקות) של שברי רקמת השומן. לאחר מכן, הגלולה מודגרת עם חיץ ליזה של תאי דם אדומים (5 דקות), ואחריו צעד צנטריפוגה נוסף ב 600 x גרם לפני השעיה בתווך תרבית. למרות מספר גדול יותר של תאים שבודדו בימים הראשונים בהשוואה לשיטות explant, מחקר קודם הראה התפשטות נמוכה או נעדרת מעבר לשבוע השני של תרבית⁸.

מלבד זאת, מניפולציה נוספת עם תוספת קסנוגנית, כגון סרום בקר עוברי (FBS), המשמש כתוסף גורם גדילה לתרבית תאים, קשורה לסיכון מוגבר לתגובתיות חיסונית וחשיפה לזיהומים ויראליים, חיידקיים או פריונים של החולה המארח ^9,10. תגובות חיסוניות והתפתחות פריחה באורטיקריפורמים כבר תוארו אצל אנשים שקיבלו מספר מנות של תאי גזע מזנכימליים המיוצרים עם FBS¹¹. יתר על כן, FBS נתון לשונות אצווה לאצווה, אשר יכולה להשפיע על איכות המוצר הסופי¹².

בהתאם להנחיות תנאי ייצור נאותים (GMP), יש להימנע מדיסוציאציה אנזימטית של רקמות, ויש להחליף את FBS בתוספים נטולי קסנוגניות. צעדים אלה, יחד עם פרוטוקולים אמינים יותר הניתנים לשחזור, חיוניים לתמיכה ביישום של טיפול תאי ^3,13.

בהקשר זה, הוצע ליזט טסיות דם אנושי (hPL) כתחליף ל- FBS מכיוון שהוא תוסף ללא תאים, המכיל חלבונים ומועשר בגורמי גדילה, והוא הוצג מוקדם יותר בקרב מוצרים מבוססי תאים ברמה קלינית כתוסף של מדיום גדילה לתרבית תאים חוץ גופית והרחבה^14,15. מכיוון ש- hPL הוא מוצר שמקורו בבני אדם, הוא משמש לעתים קרובות כתחליף ל- FBS במהלך תרבית החוץ גופית של hASCs המיועדים ליישומים קליניים, ובכך מפחית בעיות לגבי תגובות אימונולוגיות וזיהומים הקשורים לתרגום FBS^15,16.

למרות עלויות הייצור הגבוהות יותר, כבר הוכח כי בהשוואה ל- FBS, hPL תומך בכדאיות התא עבור סוגי תאים רבים, מגביר את ההתפשטות, מעכב הזדקנות, מבטיח יציבות גנומית ומשמר את האימונופנוטיפ התאי גם במעברי תאים מאוחרים; כל המרכיבים הללו תומכים במעבר למוסף תרבות זה¹¹.

מטרת העבודה הזו הייתה לפתח פרוטוקול סטנדרטי לבידוד ולתרבית של hASCs בשיטה מלאה נטולת בעלי חיים, מבלי לשנות את הפיזיולוגיה של התא ואת תכונות הגבעול בהשוואה ל-hASCs קלאסיים בתרבית FBS (איור 1).

Protocol

hASCs בודדו מרקמת השומן הבטני של אישה בריאה שעברה שחזור שד באמצעות דשים אוטולוגיים בטניים (דשים אפיגסטריים עמוקים נחותים, [DIEP]) בבית החולים האוניברסיטאי של לוזאן, CHUV, לוזאן, שוויץ. החלק המושלך של הדש ורקמת השומן הושג לאחר שהמטופל חתם על הסכמה מדעת. כל הפרוטוקולים נבדקו ואושרו על ידי מחלקת הביובנק של בית החולים DAL (מספר 314 GGC) וועדות האתיקה בהתאם להצהרת הלסינקי.

הערה: כל השלבים חייבים להתבצע תחת מכסה מנוע זרימה למינרית ובתנאים אספטיים. תמיד יש ללבוש כפפות ומעילי מעבדה להגנה אישית, ויש לשטוף את כל המשטחים עם ביוצידים מתאימים. יש להשליך רקמות עודפות כראוי כפסולת ביו-רפואית.

1. החומרים הדרושים והכנת פתרונות התרבות

1. לבידוד, הרחבה ושימור בהקפאה של תאים, השג את המכשירים הבאים: מספריים סטריליים; אזמלים סטריליים; פינצטה סטרילית; צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ; צינורות 15 מ"ל; T25 צלוחיות; תא בורקר; קריובלים; מיכל הקפאת תאים; מיקרוסקופ אופטי עם מטרות הגדלה פי 4 ו-10; וצנטריפוגת דלי מתנדנדת.
2. עבור immunophenotyping, להשיג את המכשירים הבאים ריאגנטים: צינורות FACS, מלוחים סטריליים פוספט חוצץ (PBS); המדיום החיוני המינימלי של דולבקו (DMEM); hPL; דימתיל סולפיד; וטריפסין ללא בעלי חיים.
3. הכן את מדיום התרבית המלא על ידי תוספת DMEM עם 5% hPL ללא הפרין. יש לאחסן את המדיום בטמפרטורה של 4°C למשך עד 3 שבועות, ולהשתמש תמיד בחום (בין טמפרטורת החדר ל-37°C). בהתאם להנחיות GMP לייצור תרופות תאיות המיועדות לטיפול בבני אדם, אין להוסיף אנטיביוטיקה למדיום התרבית.
4. הכינו אמצעי הקפאה המכיל 20% hPL ו-10% דימתיל סולפיד ב-DMEM.

2. בידוד hASCs מדגימת רקמת השומן

1. עבד את דגימת רקמת השומן תוך 6 שעות מקבלתה. לפני שתמשיך לשיטת הבידוד המכנית נטולת קסנוגניות, שטוף את הרקמה 2x עם PBS במשך 10 דקות עד לשחרור רקמת החיבור והדם.
2. אחסן את דגימת רקמת השומן המתקבלת מניתוח בטן ב- PBS ב -4 מעלות צלזיוס עד לעיבוד, ובכל מקרה, לא יותר מ -24 שעות, על מנת לא לפגוע בכדאיות hASC.
3. חותכים את רקמת השומן לחתיכות קטנות יותר של כ 1 ס"מ² עם מספריים סטריליים.
4. בעזרת אזמל, חתכו במיקרו כל חתיכה לשברים קטנים בקוטר <5 מ"מ, ופזרו חמישה מהם בצלוחית פטרי בקוטר 10 ס"מ (איור 2A).
5. על מנת לחבר כל שבר, השתמשו באזמל כדי ליצור חתכים על משטח הפלסטיק, וגררו כל שבר עד שהוא נדבק היטב לצלחת הפטרי. השתמשו בפינצטה כדי לעזור לטפל בשבר (איור 2B).
6. מוסיפים בעדינות 10 מ"ל של מדיום תרבית שלם על מנת לכסות את כל השברים מבלי לנתק אותם.
7. לדגור על צלחות פטרי ב 37 ° C ו 5% CO₂. ה- hASCs ינדדו אל מחוץ לרקמה וייבחרו בשל היצמדות הפלסטיק שלהם ללא עיכול אנזימטי.
8. עד למפגש התא, עקוב אחר התרחבות ה- hASC תחת מיקרוסקופ אופטי בהגדלה פי 4 פעם ביום. כאשר hASCs מתחילים לצאת מהרקמה, הם מופיעים כאשכולות קטנים סביב חלקי הרקמה עם מורפולוגיה טיפוסית דמוית פיברובלסט. ה- hASCs נבחרים בשל יכולתם להיצמד למשטח הפלסטיק. כל 72 שעות, להסיר כמה שיותר מדיום, ולהחליף אותו עם מדיום שלם טרי על מנת להסיר פסולת התא.
9. השאירו את שברי הרקמה במקום עד המעבר הראשון של תאים, אשר בדרך כלל לאחר 7 ימים.

3. תרבית hASC לאחר שלב הבידוד

1. כאשר תרבית ה-hASC מגיעה למפגש של 70%-80%, ה-hASCs מוכנים לניתוק ולהרחבה נוספת כדי שישמשו לניסויים אחרים או לאחסון לטווח ארוך.
2. בעזרת פינצטה סטרילית, מוציאים ומשליכים את כל חתיכות הרקמה מצלחת הפטרי. מוציאים ומשליכים את המדיום המותש, נזהרים לא לגעת ב- hASCs כדי לא לנתק אותם.
3. בזהירות לשטוף את התאים פעם אחת עם 10 מ"ל של PBS. הוסף 1 מ"ל של 1x טריפסין ללא בעלי חיים, ולהשאיר את צלחת פטרי באינקובטור ב 37 ° C למשך 5 דקות.
4. בדוק תחת מיקרוסקופ אופטי בהגדלה פי 4 אם כל התאים התנתקו; אחרת, השאירו את צלחת הפטרי למשך 2 דקות נוספות באינקובטור, ובסופו של דבר טפחו בעדינות על משטח הפלסטיק כדי לתמוך בניתוק התא.
5. עצור את פעולת הטריפסין על ידי הוספת 2 מ"ל של מדיום שלם, ולאסוף את כל התאים בצינור 15 מ"ל.
6. על מנת להסיר את שאריות הטריפסין, צנטריפוגה את הצינור ב 300 x גרם במשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט, השהו את התאים עם 5 מ"ל של תווך שלם, והעבירו את תרחיף התא לצלוחית T25 חדשה. שמור את hASCs בתרבית, ולהרחיב אותם עד הצורך.

4. חקירת אימונופנוטיפ על ידי ציטומטריית זרימה

1. כאשר תרבית ה- hASC מגיעה למפגש של 70%-80%, נתק את ה- hASCs כפי שתואר קודם בסעיף 3.
2. לאחר איסוף התאים, להשעות אותם ב 1 מ"ל של תווך שלם, ולספור aliquot עם מונה התא תחת מיקרוסקופ אופטי בהגדלה 10x.
3. צנטריפוגו את ה- hASCs ב- 300 x g למשך 5 דקות, והשהו אותם ב- 1 x 10⁶ תאים/מ"ל של מאגר FACS. העבר 100 μL של המתלה המכיל 1 x 10⁵ תאים לתוך צינור FACS אחד. השתמש בשפופרת FACS אחת עבור כל אנטיגן שנחקר, ועוד אחת עבור כל בקרה איזוטיפית.
4. לצבוע את התאים עם 100 μL של הנוגדנים הבאים מדולל במאגר FACS: anti-CD73 (1:1,000, IgG1, FITC-labeled), anti-CD105 (1:200, IgG1, PE-labeled); אנטי-CD34 (1:66, IgG1, עם תווית FITC); אנטי-CD45 (1:66, IgG1, עם תווית FITC); ובקרות איזוטיפיות עבור כל פלואורופור, עם תווית IgG1 FITC (1:1,000) ועם תווית IgG1 PE (1:50).
5. לדגור את הדגימות במשך 1 שעה בחושך עם תסיסה ב 4 ° C. צנטריפוגו את הצינורות ב 300 x גרם במשך 5 דקות, להשליך את supernatant, ולהשהות את התאים ב 500 μL של חיץ FACS.
6. להעריך את האימונופנוטיפ של התא באמצעות מכשיר ציטומטריית זרימה, המתעד 50,000 אירועים עבור כל צינור בתוך השער שנבחר כדי להוציא פסולת תאים. חשב את אחוז התאים המבטאים כהפרש מהבקרה האיזוטיפית הספציפית.

5. בדיקת התפשטות של hASC

1. כאשר תרבית ה- hASC מגיעה למפגש של 70%-80%, נתק את ה- hASC כמתואר בסעיף 3.
2. לאחר איסוף התאים, להשעות אותם ב 1 מ"ל של תווך שלם, ולספור aliquot עם מונה התא תחת מיקרוסקופ אופטי בהגדלה 10x.
3. זרע 5 x 10² hASCs ב 200 μL של מדיום שלם בלוחות שקופים 96 באר. זרעו את התאים בשכפולים טכניים, עם באר אחת לכל נקודת זמן.
4. לאחר 3 ימים לאחר הזריעה, התחל לזהות את התפשטות התאים באמצעות ערכת בדיקת התפשטות בהתאם להוראות היצרן. בקיצור, להחליף את המדיום תרבית עם 100 μL של מדיום טרי הוסיף 20 μL של מגיב assay לכל באר. לדגור על hASCs במשך 2.5 שעות ב 37 ° C, 5% CO₂ לפיתוח מגיבים, ולאחר מכן לזהות ספיגה ב 490 ננומטר עם ספקטרופוטומטר.
5. בטא את התפשטות ה- hASC כאחוז הספיגה לאחר הסרת הספיגה הריקה.

6. שימור ואחסון בהקפאה של hASCs

1. נתקו את התאים כמתואר בסעיף 3, וספרו אליציטוט עם מונה התא תחת מיקרוסקופ אופטי בהגדלה של פי 10.
2. צנטריפוגו את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות, ולזרוק את supernatant. להשהות את התאים עם תערובת הקפאה בצפיפות של 1 x 10⁶ hASCs/mL, ולהעביר 1 מ"ל של תמיסת התא לתוך cryovial אחד.
3. שים את הקריובלים ב -80 ° C במיכל הקפאה שמוריד את הטמפרטורה ב -1 ° C / min, ולאחר מכן להעביר את cryovials לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.

תוצאות

ביישום שיטת הבידוד המפורטת לעיל, hASCs התקבלו בהצלחה מדגימות רקמת שומן בטני ללא שימוש בקולגנאז. יתר על כן, hASCs הורחבו בתנאים נטולי קסנוגניות לחלוטין בנוכחות hPL וללא רכיבים אחרים ממוצא מן החי. התוצאות הבאות תומכות בפרוטוקול ומתקבלות מ- hASCs בתרבית במקביל ל- hPL ועם FBS כתנאי הבקרה.

לא...

Discussion

תאי גזע שמקורם בשומן משכו את העניין של מחקר תרגומי בעשור האחרון בשל השפע שלהם, שיטות בידוד מהירות ובמחיר סביר, שיעור גבוה של ריבוי מבחנה / in vivo, ותכונות גזע / התמיינות^18,19,20. כתוצאה מכך, hASCs נחשבים מועמדים מצוינים לאסטרטגיות מבוססות ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL tubes	euroclone	et5015b
anti-CD105	BD Biosciences	BD560839
anti-CD34	BD Biosciences	BD555821
anti-CD45	BD Biosciences	BD555482
anti-CD73	BD Biosciences	BD561254
autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer)	Miltenyi	130-091-222
BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument)	BD accuri	-
Burker chamber	Blaubrand	717810
Cell freezing container	corning	CLS432002
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay	Promega	G3582
CoolCell Freezing container	Corning	CLS432002
Cryovials	clearline	390701
Dimethyl sulfide	Sigma Aldrich	D2650-100mL
disposabile blade scalpel	paragon	bs 2982
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose	GIBCO	11965092
Human Platelet Lysate FD (GMP grade)	Stemulate	PL-NH-500
Infinite F50 spectrophotometer	Tecan	-
Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives	Olympus	CKX41
Petri dish 10 cm	Greiner bio-one	664160
Sterile scalpels	Reda	07104-00
Sterile scissors	Bochem	4071
Sterile tweezers	Bochem	1152
Swinging bucket centrifuge	Sigma	3-16K
T25 flasks	Greiner bio-one	6910170
TrypLe (animal free trypsin substitute)	GIBCO	12604-013