Isolamento e coltura di cellule staminali umane derivate da adiposio con un innovativo metodo xenogenico-free per la terapia umana

Riepilogo

I prodotti xenogenici (chimici o di derivazione animale) introdotti nelle fasi di preparazione/manipolazione della terapia cellulare sono associati ad un aumentato rischio di reattività immunitaria e trasmissione patogena nei pazienti ospiti. Qui viene descritto un metodo completamente privo di xenogenici per l'isolamento e l'espansione in vitro di cellule staminali derivate da adiposo umano.

Abstract

Considerando il crescente impatto della terapia con cellule staminali, sono state sollevate preoccupazioni in materia di biosicurezza per quanto riguarda la potenziale contaminazione o trasmissione di infezioni dovute all'introduzione di prodotti di origine animale durante la manipolazione in vitro . I componenti xenogenici, come la collagenasi o il siero fetale bovino, comunemente usati durante le fasi di isolamento cellulare e di espansione potrebbero essere associati ai potenziali rischi di reattività immunitaria o infezione virale, batterica e prionica nei pazienti riceventi. Seguendo le linee guida sulle buone pratiche di fabbricazione, la dissociazione chimica dei tessuti dovrebbe essere evitata, mentre il siero bovino fetale (FBS) può essere sostituito con integratori privi di xenogenici. Inoltre, per garantire la sicurezza dei prodotti cellulari, è importante definire metodi più affidabili e riproducibili. Abbiamo sviluppato un metodo innovativo, completamente xenogenico-free per l'isolamento e l'espansione in vitro di cellule staminali derivate da adiposo umano senza alterarne le proprietà rispetto ai protocolli standard di coltura FBS di collagenasi. Qui, le cellule staminali derivate dal tessuto adiposo umano (hASC) sono state isolate dal tessuto adiposo addominale. Il campione è stato tritato meccanicamente con forbici / bisturi, micro-sezionato e disperso meccanicamente in una capsula di Petri di 10 cm e preparato con incisioni di bisturi per facilitare l'attaccamento dei frammenti di tessuto e la migrazione delle hASC. Dopo le fasi di lavaggio, le hASC sono state selezionate grazie alla loro aderenza plastica senza digestione enzimatica. Le hASC isolate sono state coltivate con terreno integrato con lisato piastrinico umano privo di eparina al 5% e staccate con un sostituto della tripsina privo di animali. Seguendo le indicazioni delle buone pratiche di fabbricazione (GMP) sulla produzione di prodotti cellulari destinati alla terapia umana, non sono stati utilizzati antibiotici in alcun terreno di coltura.

Introduzione

Negli ultimi decenni, la crescente domanda di trattamenti terapeutici innovativi ha dato luogo a notevoli sforzi e investimenti di risorse nel campo della medicina traslazionale¹. I prodotti a base cellulare sono associati a rischi determinati dalla fonte cellulare, dal processo di produzione (isolamento, espansione o modificazione genetica) e dagli integratori non cellulari (enzimi, fattori di crescita, integratori di coltura e antibiotici) e questi fattori di rischio dipendono dalla specifica indicazione terapeutica. La qualità, la sicurezza e l'efficacia del prodotto finale potrebbero essere profondamente influenzate dagli elementi sopra indicati². La terapia con cellule staminali richiede il rispetto dei principi di biosicurezza; I potenziali rischi di trasmissione patogena con prodotti di origine animale in coltura cellulare potrebbero essere problematici e la sperimentazione approfondita di qualsiasi prodotto introdotto nella fabbricazione è essenziale³.

Il metodo tradizionale per isolare le cellule staminali derivate dal tessuto adiposo umano (hASC) prevede una digestione enzimatica eseguita con collagenasi seguita da fasi di lavaggio attraverso la centrifugazione⁴. Mentre l'isolamento enzimatico è generalmente considerato più efficiente di altre tecniche meccaniche in termini di rese cellulari e vitalità, i componenti di origine animale utilizzati, come la collagenasi, sono considerati più che minimamente manipolati dalla Food and Drug Administration degli Stati Uniti. Ciò significa che vi è un rischio significativamente aumentato di reazioni immunitarie o di trasmissione di malattie, limitando così la traduzione della terapia con hASC in contesti clinici ^5,6.

La digestione a base di tripsina è un altro protocollo enzimatico per isolare le ASC. Sono state descritte diverse tecniche con lievi modifiche in termini di concentrazione di tripsina, velocità di centrifugazione e tempo di incubazione. Sfortunatamente, questo metodo non è ben descritto e manca il confronto in letteratura, in particolare con i protocolli di isolamento meccanico⁷. Tuttavia, in termini di traducibilità dell'approccio, la tripsina presenta gli stessi inconvenienti della collagenasi.

Metodi di isolamento alternativi per ottenere ASC, basati su forze meccaniche e senza aggiunta enzimatica, comportano la centrifugazione ad alta velocità (800 x g o 1.280 x g, 15 min) dei frammenti di tessuto adiposo. Quindi, il pellet viene incubato con un tampone di lisi dei globuli rossi (5 min), seguito da un'altra fase di centrifugazione a 600 x g prima della risospensione in terreno di coltura. Nonostante un numero maggiore di cellule isolate nei primi giorni rispetto ai metodi di espianto, uno studio precedente ha mostrato una proliferazione inferiore o assente oltre la seconda settimana di coltura⁸.

Oltre a ciò, un'ulteriore manipolazione con mezzo aggiunto xenogenico, come il siero bovino fetale (FBS), che viene utilizzato come integratore del fattore di crescita per la coltura cellulare, è associata ad un aumentato rischio di reattività immunitaria ed esposizione a infezioni virali, batteriche o prioniche del paziente ospite ^9,10. Reazioni immunitarie e sviluppo di rash orticariforme sono già stati descritti in soggetti trattati con diverse dosi di cellule staminali mesenchimali prodotte con FBS¹¹. Inoltre, FBS è soggetta a variabilità da lotto a lotto, che può avere un impatto sulla qualità del prodotto finale¹².

In conformità con le linee guida sulle buone pratiche di fabbricazione (GMP), la dissociazione enzimatica dei tessuti deve essere evitata e l'FBS deve essere sostituito con integratori privi di xenogenici. Questi passaggi, insieme a protocolli più affidabili e riproducibili, sono essenziali per supportare l'applicazione della terapia cellulare ^3,13.

In questo contesto, il lisato piastrinico umano (hPL) è stato suggerito come sostituto di FBS poiché è un integratore privo di cellule, contenente proteine, arricchito con fattore di crescita, ed è stato precedentemente introdotto tra i prodotti cellulari di grado clinico come additivo del mezzo di crescita per la coltura cellulare in vitro e^{l'espansione 14,15}. Poiché l'hPL è un prodotto di derivazione umana, viene spesso utilizzato come sostituto dell'FBS durante la coltura in vitro di hASC destinate ad applicazioni cliniche, riducendo così i problemi relativi alle reazioni immunologiche e alle infezioni correlate alla traducibilità della FBS^15,16.

Nonostante i maggiori costi di produzione, è già stato dimostrato che rispetto all'FBS, l'hPL supporta la vitalità cellulare per molti tipi cellulari, aumenta la proliferazione, ritarda la senescenza, assicura la stabilità genomica e conserva l'immunofenotipo cellulare anche nei passaggi cellulari tardivi; Tutti questi elementi supportano il passaggio a questo supplemento culturale¹¹.

Lo scopo di questo lavoro era quello di sviluppare un protocollo standardizzato per isolare e coltivare hASC con un metodo completo privo di animali, senza modificare la fisiologia cellulare e le proprietà di staminalità rispetto alle classiche hASC coltivate con FBS (Figura 1).

Protocollo

Le hASC sono state isolate dal tessuto adiposo addominale di una donna sana sottoposta a ricostruzione mammaria utilizzando lembi autologhi addominali (lembi perforatori epigastrici inferiori profondi, [DIEP]) presso l'Ospedale universitario di Losanna, CHUV, Losanna, Svizzera. La parte scartata del lembo e del tessuto adiposo è stata ottenuta dopo che il paziente ha firmato il consenso informato. Tutti i protocolli sono stati esaminati e approvati dal Dipartimento della Biobanca dell'ospedale DAL (numero 314 GGC) e dai comitati etici in conformità con la Dichiarazione di Helsinki.

NOTA: Tutti i passaggi devono essere eseguiti sotto una cappa a flusso laminare e con condizioni asettiche. Guanti e camici da laboratorio per la protezione personale devono essere sempre indossati e tutte le superfici devono essere lavate con biocidi appropriati. Il tessuto in eccesso deve essere smaltito correttamente come rifiuto biomedico.

1. Materiali necessari e preparazione delle soluzioni colturali

1. Per l'isolamento, l'espansione e la crioconservazione delle cellule, ottenere i seguenti strumenti: forbici sterili; bisturi sterili; pinzette sterili; una capsula di Petri da 10 cm; Tubi da 15 ml; palloni T25; una camera Burker; criovali; un contenitore di congelamento cellulare; un microscopio ottico con obiettivi di ingrandimento 4x e 10x; e una centrifuga a secchio oscillante.
2. Per l'immunofenotipizzazione, ottenere i seguenti strumenti e reagenti: tubi FACS, soluzione salina tampone fosfato sterile (PBS); Il mezzo essenziale minimo (DMEM) di Dulbecco; hPL; solfuro di dimetile; e tripsina senza animali.
3. Preparare il terreno di coltura completo integrando DMEM con hPL privo di eparina al 5%. Conservare il fluido a 4 °C per un massimo di 3 settimane e utilizzare sempre in caldo (tra temperatura ambiente e 37 °C). Seguendo le linee guida GMP per la produzione di farmaci cellulari destinati alla terapia umana, non aggiungere antibiotici al terreno di coltura.
4. Preparare il mezzo di congelamento contenente il 20% di hPL e il 10% di dimetil solfuro in DMEM.

2. Isolamento delle hASC dal campione di tessuto adiposo

1. Elaborare il campione di tessuto adiposo entro 6 ore dal suo ottenimento. Prima di procedere al metodo di isolamento meccanico privo di xenogenici stabilito, lavare il tessuto 2x con PBS per 10 minuti fino al rilascio di tessuto connettivo e sangue.
2. Conservare il campione di tessuto adiposo ottenuto dalla chirurgia addominoplastica in PBS a 4°C fino alla lavorazione e, comunque, non più di 24 h, al fine di non danneggiare la vitalità dell'hASC.
3. Tagliare il tessuto adiposo in pezzi più piccoli di circa 1 cm² con forbici sterili.
4. Con un bisturi, micro-sezionare ogni pezzo in piccoli frammenti con diametri <5 mm, e disperderne cinque in una capsula di Petri di 10 cm (Figura 2A).
5. Per attaccare ogni frammento, utilizzare il bisturi per creare incisioni sulla superficie di plastica, trascinando ogni frammento fino a quando non è saldamente attaccato alla capsula di Petri. Utilizzare una pinzetta per gestire il frammento (Figura 2B).
6. Aggiungere delicatamente 10 ml di terreno di coltura completo per coprire tutti i frammenti senza staccarli.
7. Incubare le piastre di Petri a 37 °C e 5% di CO₂. Le hASC migreranno fuori dal tessuto e saranno selezionate a causa della loro aderenza plastica senza digestione enzimatica.
8. Fino alla confluenza cellulare, monitorare l'espansione hASC al microscopio ottico con un ingrandimento 4x una volta al giorno. Quando le hASC iniziano a uscire dal tessuto, appaiono come piccoli gruppi attorno ai pezzi di tessuto con una tipica morfologia simile ai fibroblasti. Gli hASC sono selezionati in base alla loro capacità di aderire alla superficie plastica. Ogni 72 ore, rimuovere quanto più mezzo possibile e sostituirlo con un mezzo completo fresco per rimuovere i detriti cellulari.
9. Lasciare i frammenti di tessuto sul posto fino al primo passaggio delle cellule, che di solito è dopo 7 giorni.

3. Coltura hASC dopo la fase di isolamento

1. Quando la coltura hASC raggiunge il 70%-80% di confluenza, le hASC sono pronte per essere staccate e ulteriormente espanse per essere utilizzate per altri esperimenti o per la conservazione a lungo termine.
2. Con una pinzetta sterile, rimuovere e scartare tutti i pezzi di tessuto dalla capsula di Petri. Rimuovere e scartare il mezzo esausto, facendo attenzione a non toccare le hASC per non staccarle.
3. Lavare accuratamente le cellule una volta con 10 ml di PBS. Aggiungere 1 mL di 1x tripsina senza animali e lasciare la capsula di Petri nell'incubatrice a 37 °C per 5 minuti.
4. Controllare al microscopio ottico con ingrandimento 4x se tutte le cellule si sono staccate; altrimenti, lasciare la capsula di Petri per altri 2 minuti nell'incubatrice e infine picchiettare delicatamente la superficie di plastica per supportare il distacco della cella.
5. Interrompere l'azione della tripsina aggiungendo 2 ml di terreno completo e raccogliere tutte le cellule in una provetta da 15 ml.
6. Per rimuovere la tripsina residua, centrifugare il tubo a 300 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante, sospendere le cellule con 5 ml di terreno completo e trasferire la sospensione cellulare in un nuovo matraccio T25. Mantieni le hASC in cultura ed espandile fino a quando necessario.

4. Studio immunofenotipico mediante citometria a flusso

1. Quando la coltura hASC raggiunge il 70%-80% di confluenza, staccare gli hASC come descritto in precedenza nella sezione 3.
2. Dopo aver raccolto le cellule, sospenderle in 1 mL di mezzo completo e contare un'aliquota con il contatore di cellule al microscopio ottico con un ingrandimento 10x.
3. Centrifugare gli hASC a 300 x g per 5 minuti e sospenderli a 1 x 10⁶ celle/ml di tampone FACS. Trasferire 100 μL della sospensione contenente 1 x 10⁵ celle in un tubo FACS. Utilizzare un tubo FACS per ogni antigene studiato, più un altro per ogni controllo isotipico.
4. Colorare le cellule con 100 μL dei seguenti anticorpi diluiti in tampone FACS: anti-CD73 (1:1.000, IgG1, marcato con FITC), anti-CD105 (1:200, IgG1, marcato PE); anti-CD34 (1:66, IgG1, marcato con FITC); anti-CD45 (1:66, IgG1, marcato con FITC); e controlli isotipici per ciascun fluoroforo, marcato con IgG1 con FITC (1:1.000) e con PE IgG1 (1:50).
5. Incubare i campioni per 1 ora al buio agitando a 4 °C. Centrifugare le provette a 300 x g per 5 minuti, eliminare il surnatante e sospendere le cellule in 500 μL di tampone FACS.
6. Valutare l'immunofenotipo cellulare con uno strumento di citometria a flusso, registrando 50.000 eventi per ogni tubo all'interno del cancello selezionato per escludere i detriti cellulari. Calcola la percentuale di cellule che esprimono come differenza dal controllo isotipico specifico.

5. Saggio di proliferazione di hASC

1. Quando la coltura hASC raggiunge il 70%-80% di confluenza, staccare le hASC come descritto nella sezione 3.
2. Dopo aver raccolto le cellule, sospenderle in 1 mL di mezzo completo e contare un'aliquota con il contatore di cellule al microscopio ottico con un ingrandimento 10x.
3. Semina 5 x 10² hASC in 200 μL di terreno completo in lastre trasparenti a 96 pozzetti. Semina le celle in repliche tecniche, con un pozzetto per ogni punto temporale.
4. A 3 giorni dalla semina, iniziare a rilevare la proliferazione cellulare utilizzando un kit di test di proliferazione seguendo le istruzioni del produttore. In breve, sostituire il terreno di coltura con 100 μL di terreno fresco aggiunto a 20 μL di reagente di analisi per pozzetto. Incubare le hASC per 2,5 ore a 37 °C, 5% CO₂ per lo sviluppo del reagente, quindi rilevare l'assorbanza a 490 nm con uno spettrofotometro.
5. Esprimere la proliferazione hASC come assorbanza percentuale dopo aver rimosso l'assorbanza in bianco.

6. Crioconservazione e conservazione delle hASC

1. Staccare le cellule come descritto nella sezione 3 e contare un'aliquota con il contatore di cellule al microscopio ottico con un ingrandimento 10x.
2. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Sospendere le cellule con miscela di congelamento ad una densità di 1 x 10⁶ hASCs/mL e trasferire 1 mL della soluzione cellulare in un crioviale.
3. Mettere i crioviali a -80 °C in un contenitore di congelamento che riduce la temperatura di 1 °C/min, quindi spostare i crioviali in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.

Risultati

Applicando il metodo di isolamento descritto sopra, le hASC sono state ottenute con successo da campioni di tessuto adiposo addominale senza l'uso di collagenasi. Inoltre, le hASC sono state espanse in condizioni completamente prive di xenogenici in presenza di hPL e senza altri componenti di origine animale. I seguenti risultati supportano il protocollo e sono ottenuti da hASC coltivate in parallelo con hPL e con FBS come condizione di controllo.

Dopo l'apparizione iniziale del cluster, le hA...

Discussione

Le cellule staminali derivate dall'adiposio hanno attirato l'interesse della ricerca traslazionale nell'ultimo decennio grazie alla loro abbondanza, ai metodi di isolamento rapidi e convenienti, all'alto tasso di proliferazione in vitro / in vivo e alle proprietà di staminalità / differenziazione^18,19,20. Di conseguenza, le hASC sono considerate un ottimo candidato per le strategie basate sulle cellule nella ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL tubes	euroclone	et5015b
anti-CD105	BD Biosciences	BD560839
anti-CD34	BD Biosciences	BD555821
anti-CD45	BD Biosciences	BD555482
anti-CD73	BD Biosciences	BD561254
autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer)	Miltenyi	130-091-222
BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument)	BD accuri	-
Burker chamber	Blaubrand	717810
Cell freezing container	corning	CLS432002
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay	Promega	G3582
CoolCell Freezing container	Corning	CLS432002
Cryovials	clearline	390701
Dimethyl sulfide	Sigma Aldrich	D2650-100mL
disposabile blade scalpel	paragon	bs 2982
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose	GIBCO	11965092
Human Platelet Lysate FD (GMP grade)	Stemulate	PL-NH-500
Infinite F50 spectrophotometer	Tecan	-
Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives	Olympus	CKX41
Petri dish 10 cm	Greiner bio-one	664160
Sterile scalpels	Reda	07104-00
Sterile scissors	Bochem	4071
Sterile tweezers	Bochem	1152
Swinging bucket centrifuge	Sigma	3-16K
T25 flasks	Greiner bio-one	6910170
TrypLe (animal free trypsin substitute)	GIBCO	12604-013