ヒト異種異系フリーのヒト治療法によるヒト脂肪由来幹細胞の単離と培養

要約

細胞療法の準備/操作ステップで導入された異種(化学的または動物由来)製品は、宿主患者における免疫反応性および病原性伝播のリスクの増加と関連しています。ここでは、ヒト脂肪由来幹細胞の単離および in vitro 増殖のための完全な異種異系フリーの方法が記載されている。

要約

幹細胞治療の影響の増大を考慮して、 in vitro 操作中の動物由来製品の導入による潜在的な汚染または感染伝播に関してバイオセーフティの懸念が提起されています。細胞の単離および増殖ステップで一般的に使用されるコラゲナーゼやウシ胎児血清などの異種成分は、投与を受けた患者の免疫反応性またはウイルス、細菌、プリオン感染の潜在的なリスクに関連している可能性があります。適正製造基準のガイドラインに従って、化学的組織の解離は避ける必要がありますが、ウシ胎児血清(FBS)は異種を含まないサプリメントに置き換えることができます。さらに、細胞製品の安全性を確保するためには、より信頼性が高く再現性のある方法の定義が重要です。私たちは、コラゲナーゼFBS培養標準プロトコルと比較して、その特性を変えることなく、ヒト脂肪由来幹細胞の単離と in vitro 増殖のための革新的で完全に異種異系を含まない方法を開発しました。ここでは、腹部脂肪組織からヒト脂肪由来幹細胞(hASC)を単離した。サンプルはハサミ/メスで機械的にミンチし、マイクロ解剖して10 cmのペトリ皿に機械的に分散させ、組織片の付着とhASCの移動を容易にするためにメスの切開で調製しました。洗浄ステップに続いて、酵素消化なしでプラスチックが付着するため、hASCが選択されました。単離したhASCを、5%ヘパリンフリーヒト血小板溶解物を添加した培地で培養し、動物を含まないトリプシン代替物で剥離しました。ヒト治療を目的とした細胞製品の製造に関する適正製造基準(GMP)の指示に従って、どの培地にも抗生物質は使用されていません。

概要

過去数十年で、革新的な治療法に対する需要の高まりにより、トランスレーショナルメディシン分野への多大な努力とリソース投資が発生しました¹。細胞ベースの製品は、細胞源、製造プロセス(分離、増殖、または遺伝子組み換え)、および非細胞サプリメント(酵素、成長因子、培養サプリメント、および抗生物質)によって決定されるリスクと関連しており、これらの危険因子は特定の治療適応症に依存します。最終製品の品質、安全性、および有効性は、上記の要素²によって深く影響を受ける可能性があります。幹細胞治療は、バイオセーフティの原則を順守する必要があります。細胞培養における動物由来製品による病原性感染の潜在的なリスクは問題となる可能性があり、製造に導入された製品の徹底的なテストが不可欠です³。

ヒト脂肪由来幹細胞(hASC)を単離する従来の方法では、コラゲナーゼを用いた酵素消化とそれに続く遠心分離による洗浄ステップが行われます⁴。酵素による単離は、一般に、細胞収量と生存率の点で他の機械的技術よりも効率的であると考えられていますが、コラゲナーゼなど、使用される動物由来の成分は、米国食品医薬品局によって最小限に操作されていると考えられています。これは、免疫反応または疾患伝播のリスクが大幅に増加することを意味し、したがって、hASC療法の臨床現場への翻訳を制限します^5,6。

トリプシンベースの消化は、ASCを単離するための別の酵素プロトコルです。トリプシン濃度、遠心分離速度、およびインキュベーション時間の点でわずかな変更を加えたさまざまな技術が説明されています。残念なことに、この方法は十分に説明されておらず、文献、特に機械的絶縁プロトコル⁷との比較の欠如が存在する。しかしながら、アプローチの翻訳可能性に関して、トリプシンはコラゲナーゼと同じ欠点を有する。

機械的な力に基づいて酵素を添加しないASCを得るための代替単離方法には、脂肪組織断片の高速遠心分離(800 x gまたは1,280 x g、15分)が含まれます。次いで、ペレットを赤血球溶解緩衝液(5分間)と共にインキュベートし、続いて培養培地に再懸濁する前に600 x gで別の遠心分離工程を行う。外植片法と比較して最初の数日間に単離された細胞の数が多いにもかかわらず、以前の研究では、培養2週目以降の増殖が少ないか、または存在しないことが示されました⁸。

それに加えて、細胞培養のための成長因子サプリメントとして使用されるウシ胎児血清(FBS)などの異種添加培地によるさらなる操作は、免疫反応性のリスクおよび宿主患者のウイルス、細菌、またはプリオン感染への曝露の増加と関連している^9,10。免疫反応および蕁麻疹様発疹の発生は、FBS¹¹で産生された間葉系幹細胞を数回投与された個体において既に説明されている。さらに、FBSはバッチ間のばらつきを受け、最終製品の品質に影響を与える可能性があります¹²。

適正製造基準(GMP)ガイドラインに従って、酵素組織の解離を回避し、FBSを異種を含まないサプリメントに置き換える必要があります。これらのステップは、より信頼性が高く再現性のあるプロトコルとともに、細胞療法の適用をサポートするために不可欠です^3、13。

これに関連して、ヒト血小板ライセート(hPL)は、無細胞、タンパク質含有、成長因子が豊富なサプリメントであり、in vitro細胞培養および増殖のための増殖培地の添加剤として臨床グレードの細胞ベースの製品の間で以前に導入されたため、FBSの代替として提案されています^14,15。hPLはヒト由来の産物であるため、臨床応用を目的としたhASCのin vitro培養中にFBSの代替として頻繁に使用され、FBSの翻訳可能性に関連する免疫反応や感染症に関する問題を軽減します^15,16。

より高い生産コストにもかかわらず、FBSと比較して、hPLは多くの細胞タイプの細胞生存率をサポートし、増殖を増加させ、老化を遅らせ、ゲノム安定性を保証し、後期細胞継代でも細胞免疫表現型を保存することがすでに実証されています。これらすべての要素は、この文化サプリメント¹¹への切り替えをサポートします。

この研究の目的は、従来のFBS培養hASCと比較して、細胞生理学とステムネスの特性を変更することなく、完全な動物を含まない方法でhASCを分離および培養するための標準化されたプロトコルを開発することでした(図1)。

プロトコル

hASCは、スイス、ローザンヌ、CHUVのローザンヌ大学病院で腹部自家皮弁(深部下上腹部穿孔フラップ、[DIEP])を使用して乳房再建術を受けた健康な女性の腹部脂肪組織から分離されました。フラップと脂肪組織の廃棄部分は、患者がインフォームドコンセントに署名した後に取得されました。すべてのプロトコルは、ヘルシンキ宣言に従って、病院のバイオバンク部門DAL(番号314 GGC)および倫理委員会によってレビューおよび承認されました。

注意: すべてのステップは、層流フードの下で無菌状態で実行する必要があります。個人用保護用の手袋と白衣は常に着用し、すべての表面は適切な殺生物剤で洗う必要があります。余分な組織は生物医学廃棄物として適切に処分する必要があります。

1.必要な材料と培養液の調製

1. 細胞の単離、増殖、および凍結保存のために、以下の器具を入手してください:滅菌ハサミ;滅菌メス;滅菌ピンセット;10cmのペトリ皿。15 mLチューブ;T25フラスコ;バーカーチャンバー;クライオバイアル;細胞凍結容器;4倍と10倍の倍率対物レンズを備えた光学顕微鏡。スイングバケット遠心分離機。
2. イムノフェノタイピングのために、以下の器具および試薬を入手してください:FACSチューブ、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS);ダルベッコの最小必須培地(DMEM);hPL;ジメチルスルフィド;動物を含まないトリプシン。
3. DMEMに5%ヘパリンフリーhPLを添加して、完全な培地を調製します。培地を4°Cで最大3週間保管し、常に温かいもの(室温から37°Cの間)を使用してください。ヒト治療を目的とした細胞医薬品の製造に関するGMPガイドラインに従って、培養液に抗生物質を添加しないでください。
4. DMEMで20%hPLと10%ジメチルスルフィドを含む凍結培地を準備します。

2.脂肪組織サンプルからのhASCの分離

1. 脂肪組織サンプルを入手してから6時間以内に処理します。確立された機械的異種異系フリーの分離方法に進む前に、結合組織と血液が放出されるまで組織をPBSで2回10分間洗浄します。
2. 腹部形成外科手術から得られた脂肪組織サンプルは、hASCの生存率を損なわないように、処理されるまで、そしていずれの場合も24時間以内に、4°CのPBSに保管してください。
3. 脂肪組織を滅菌ハサミで約1cm² の小片に切断する。
4. メスで、各ピースを直径<5 mmの小さな断片に細かく解剖し、そのうちの5つを10 cmのペトリ皿に分散させます(図2A)。
5. 各フラグメントを取り付けるには、メスを使用してプラスチック表面に切り込みを入れ、ペトリ皿にしっかりとくっつくまで各フラグメントをドラッグします。ピンセットを使用してフラグメントを処理します(図2B)。
6. 10 mLの完全培養液を穏やかに加え、すべての断片を剥離せずにカバーします。
7. ペトリ皿を37°Cおよび5%_CO2でインキュベートする。hASCは組織から移動し、酵素消化なしで可塑性接着のために選択されます。
8. 細胞コンフルエントになるまで、1日1回、光学顕微鏡下で4倍の倍率でhASC増殖をモニターする。hASCが組織から出始めると、典型的な線維芽細胞様形態の組織片の周りに小さなクラスターとして現れます。hASCは、プラスチック表面に接着する能力のために選択されます。72時間ごとに、できるだけ多くの培地を除去し、細胞残骸を除去するために新鮮な完全培地と交換します。
9. 細胞の最初の通過まで、つまり通常7日後まで、組織の断片をそのままにしておきます。

3. 単離段階後のhASC培養

1. hASC培養が70%〜80%のコンフルエントに達すると、hASCを分離してさらに拡張して、他の実験または長期保存に使用する準備が整います。
2. 滅菌ピンセットを使用して、ペトリ皿からすべての組織片を取り出して廃棄します。消耗した培地を取り外して廃棄し、hASCを切り離さないように注意します。
3. 細胞を10 mLのPBSで一度慎重に洗浄します。動物を含まないトリプシン1 mLを1 mL加え、ペトリ皿を37°Cのインキュベーターに5分間放置します。
4. すべての細胞が剥離したかどうかを4倍の倍率で光学顕微鏡で確認します。それ以外の場合は、ペトリ皿をインキュベーター内にさらに2分間放置し、最終的にプラスチック表面を軽くたたいて細胞の剥離をサポートします。
5. 2 mLの完全培地を加えてトリプシン作用を停止し、15 mLチューブにすべての細胞を回収します。
6. 残っているトリプシンを除去するには、チューブを300 x g で5分間遠心分離します。上清を廃棄し、5 mLの完全培地で細胞を懸濁し、細胞懸濁液を新しいT25フラスコに移します。hASCを培養に保持し、必要になるまで拡張します。

4. フローサイトメトリーによる免疫表現型調査

1. hASC培養が70%〜80%のコンフルエントに達したら、セクション3で前述したようにhASCを剥離します。
2. 細胞を回収した後、1 mLの完全培地に懸濁し、光学顕微鏡下でセルカウンターで10倍の倍率でアリコートを数えます。
3. hASCを300 x g で5分間遠心分離し、1 x 10⁶ 細胞/mLのFACSバッファーで懸濁します。1 x 10⁵ 細胞を含む懸濁液100 μLを1本のFACSチューブに移します。調査対象の抗原ごとに1本のFACSチューブを使用し、さらにアイソタイプコントロールごとにもう1本を使用します。
4. FACSバッファーで希釈した100 μLの抗体で細胞を染色します:抗CD73(1:1,000、IgG1、FITC標識)、抗CD105(1:200、IgG1、PE標識);抗CD34(1:66、IgG1、FITC標識);抗CD45(1:66、IgG1、FITC標識);各蛍光色素のアイソタイプコントロール、IgG1 FITC標識(1:1,000)およびIgG1 PE標識(1:50)。
5. サンプルを暗所で1時間インキュベートし、4°Cで攪拌します。 チューブを300 x g で5分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を500 μLのFACSバッファーに懸濁します。
6. フローサイトメトリー装置で細胞免疫表現型を評価し、細胞デブリを除外するために選択したゲート内のチューブごとに50,000イベントを記録します。発現細胞の割合を特定のアイソタイプコントロールとの差として算出する。

5. hASCの増殖アッセイ

1. hASC培養が70%〜80%のコンフルエントに達したら、セクション3の説明に従ってhASCを剥離します。
2. 細胞を回収した後、1 mLの完全培地に懸濁し、光学顕微鏡下でセルカウンターで10倍の倍率でアリコートを数えます。
3. 5 x 10² hASCを200 μLの完全培地に96ウェル透明プレートに播種します。テクニカルレプリケートで細胞をシードし、各時点に1つのウェルを使用します。
4. 播種後3日目に、製造元の指示に従って増殖アッセイキットを使用して細胞増殖の検出を開始します。簡単に言うと、培養液を、ウェルあたり20 μLのアッセイ試薬に加えた100 μLの新しい培地と交換します。hASCを37°C、5%_CO2 で2.5時間インキュベートして試薬開発を行い、分光光度計で490nmの吸光度を検出します。
5. hASC増殖をブランク吸光度を除去した後の吸光度百分率で表す。

6. hASCの凍結保存と保存

1. セクション3の説明に従って細胞を剥離し、10倍の倍率で光学顕微鏡下でセルカウンターでアリコートを数えます。
2. 細胞を300 x g で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。細胞を1 x 10⁶ hASC/mLの密度で凍結ミックスで懸濁し、1 mLの細胞溶液を1つのクライオバイアルに移します。
3. クライオバイアルを-80°Cで温度を1°C/分下げる冷凍容器に入れ、クライオバイアルを液体窒素に移して長期保存します。

結果

上記の単離方法を適用すると、コラゲナーゼを使用せずに腹部脂肪組織サンプルからhASCが首尾よく得られました。さらに、hASCは、hPLの存在下で、動物由来の他の成分を含まない完全な異種異系フリー条件で増殖した。以下の結果は、プロトコルを支持し、hPLと並行して培養し、FBSを対照条件として培養したhASCから得られたものです。

最初のクラスター出現後、hASCは古?...

ディスカッション

脂肪由来幹細胞は、その豊富さ、迅速で手頃な価格の単離方法、高いin vitro/in vivo増殖率、および幹細胞性/分化特性により、過去10年間でトランスレーショナル研究の関心を集めてきました^18,19,20。その結果、hASCは再生医療における細胞ベースの戦略の優れた候補と考えられています²¹。脂肪...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL tubes	euroclone	et5015b
anti-CD105	BD Biosciences	BD560839
anti-CD34	BD Biosciences	BD555821
anti-CD45	BD Biosciences	BD555482
anti-CD73	BD Biosciences	BD561254
autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer)	Miltenyi	130-091-222
BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument)	BD accuri	-
Burker chamber	Blaubrand	717810
Cell freezing container	corning	CLS432002
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay	Promega	G3582
CoolCell Freezing container	Corning	CLS432002
Cryovials	clearline	390701
Dimethyl sulfide	Sigma Aldrich	D2650-100mL
disposabile blade scalpel	paragon	bs 2982
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose	GIBCO	11965092
Human Platelet Lysate FD (GMP grade)	Stemulate	PL-NH-500
Infinite F50 spectrophotometer	Tecan	-
Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives	Olympus	CKX41
Petri dish 10 cm	Greiner bio-one	664160
Sterile scalpels	Reda	07104-00
Sterile scissors	Bochem	4071
Sterile tweezers	Bochem	1152
Swinging bucket centrifuge	Sigma	3-16K
T25 flasks	Greiner bio-one	6910170
TrypLe (animal free trypsin substitute)	GIBCO	12604-013