نموذج أذن الفأر لتقييم التهاب الجلد التماسي التحسسي

Summary

هنا ، نصف طرق إحداث التهاب الجلد التماسي التحسسي في آذان الفئران بواسطة 1-fluoro-2،4-dinitrobenzene (DNFB) وكيفية تقييم شدة التهاب الجلد التماسي التحسسي.

Abstract

الجلد هو خط الدفاع الأول لجسم الإنسان وأحد أكثر الأعضاء تعرضا للمواد الكيميائية البيئية. التهاب الجلد التماسي التحسسي (ACD) هو مرض جلدي شائع يظهر على شكل طفح جلدي موضعي واحمرار وآفات جلدية. يتأثر حدوث وتطور ACD بالعوامل الوراثية والبيئية. على الرغم من أن العديد من العلماء قد بنوا سلسلة من نماذج ACD في السنوات الأخيرة ، إلا أن البروتوكولات التجريبية لهذه النماذج مختلفة ، مما يجعل من الصعب على القراء تأسيسها جيدا. لذلك ، فإن النموذج الحيواني المستقر والفعال له أهمية كبيرة لمواصلة دراسة التسبب في التهاب الجلد التأتبي. في هذه الدراسة ، قمنا بتفصيل طريقة النمذجة باستخدام 1-fluoro-2،4-dinitrobenzene (DNFB) للحث على أعراض تشبه ACD في آذان الفئران ووصف عدة طرق لتقييم شدة التهاب الجلد أثناء النمذجة. تم تطبيق هذا البروتوكول التجريبي بنجاح في بعض التجارب وله دور ترويجي معين في مجال أبحاث ACD.

Introduction

التهاب الجلد التماسي التحسسي (ACD) هو مرض جلدي شائع يتميز بأعراض تشبه الأكزيما في موقع التلامس ، وذمة وحمامي في الحالات المعتدلة ، وحطاطات ، تآكل ، نضح ، أو حتى ندوب ضخمة في الحالات الشديدة¹. يؤثر على ما يصل إلى 20٪ من السكان ويمكن أن يؤثر على الأشخاص من أي عمر². غالبا ما يحدث ACD في الأفراد الذين تعرضوا لمسببات الحساسية بشكل متكرر ويمكن أن يكون سببه الاستجابة المناعية للفرد لواحد أو أكثر من مسببات الحساسية في منزلهم أو مكان عملهم³. يعتبر فرط الحساسية المتأخر من النوع الرابع النوع الرئيسي من الاستجابة المناعية في ACD⁴. في مناطق الجلد التي تعرضت مرارا وتكرارا لمسببات الحساسية ، تتراكم خلايا الذاكرة التائية المنتشرة بأعداد كبيرة وتحفز الاستجابات المناعية والالتهابية³،^5،6. الغرض من هذا العمل هو اقتراح تقنية مختبرية موثوقة لمزيد من التحقيق في الاستجابات المناعية والالتهابية في تطوير ACD.

عادة ما يكون ظهور ACD بسبب فرط الحساسية للتلامس الناجم عن التعرض المتكرر للمواد الكيميائية. طور العديد من الباحثين نماذج حيوانية مختلفة ل ACD في الفئران المنزلية^7,8 ، وخنازير غينيا ^9,10 ، أخرى على مدار العقود القليلة الماضية ، من أجل محاكاة ظهور المرض. تتكون معظم الطرق التجريبية من مرحلتين: تحسس البطن (الحث) وتوفير المحفزات على الظهر أو شحمة الأذن (التحفيز). تشمل المواد الكيميائية شائعة الاستخدام بشكل أساسي 1-فلورو-2،4-دينيتروبنزين (DNFB) / 1-كلورو-2،4-دينيتروبنزين (DNCB) ⁸،⁹،11 ، أوكسازولون¹² ، يوروشيول ^{13 ،} إلخ. من بينها ، DNFB و DNCB هي الأكثر استخداما ، تم الإبلاغ عنها لأول مرة في أكتوبر 1958¹⁰. كما يتم استخدام نموذج تحسس النيكل¹⁴ والتهاب الجلد التماسي الضوئي¹⁵ بشكل متكرر.

نقدم طريقة تجريبية لبناء نموذج ACD. يتم تلخيص هذه الطريقة وتحسينها على أساس الدراسات السابقة وعند المقارنة مع تجارب متعددة. بالمقارنة مع نماذج ACD الأخرى ، فإن هذا النموذج له بعض المزايا ، مثل الاختلافات الفردية الصغيرة ، والفترات التجريبية القصيرة ، وكمية صغيرة من التحفيز الكيميائي ، وما إلى ذلك. بالإضافة إلى ذلك ، تنطبق هذه الدراسة على الفئران ، التي ليست اقتصادية فحسب ، بل لديها أيضا المزيد من الخيارات للضربة القاضية الجينية أو إعداد الفئران المعدلة وراثيا¹⁶. نصف أيضا الطرق المختلفة المستخدمة لمراقبة تقدم ACD في التجربة ، مثل قياس سمك الأذن ، واستخدام صبغة إيفانز الزرقاء لقياس النضح الالتهابي ، وما إلى ذلك. لا يمكن لهذا النموذج تحليل آذان الفأر والدم والطحال والعينات الأخرى بالوسائل المختبرية لاستكشاف التسبب في ACD فحسب ، بل ينطبق أيضا على التقييم قبل السريري للطرق العلاجية الجديدة ، والتي لها أهمية ترويجية معينة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

كانت جميع رعاية وعلاج الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات بجامعة يانغتشو وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات بموجب ترخيص المشروع SYXK (SU) 2022-0044. تم استخدام BALB / c ذكور وإناث الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع في هذه الدراسة. تألفت كل مجموعة من ستة فئران (انظر جدول المواد). تم وضع الأقفاص في غرفة يتم التحكم في درجة حرارتها (22 ± 2 درجة مئوية ، دورة الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة) مع حرية الوصول إلى الطعام والماء. يوضح الشكل 1 مخطط تدفق تجريبي.

1. إعداد الحيوان

1. بدء النمذجة بعد 1 أسبوع من التأقلم مع البيئة.
2. استخدم مصباح الأشعة فوق البنفسجية ومطهر الكحول بنسبة 75٪ لتنظيف وتطهير البيئة وأسطح العمل قبل التلاعب بالفئران.
   ملاحظة: من أجل تجنب تأثير العوامل الخارجية ، لا يمكن إجراء وضع علامة على الفئران لتحديد الهوية على أذن الفأر ؛ يمكن استخدام تلطيخ على الظهر أو على الذيل كبديل.
3. استخدم قطعة قطن صغيرة لتطبيق الماء والصابون على بطن الفئران (حوالي 1-2 سم² في الحجم). حلق المنطقة في اتجاه نمو الشعر بشفرة أو ماكينة حلاقة (انظر جدول المواد) في بداية النمذجة (اليوم 0 ؛ الشكل 2 أ).
   ملاحظة: يتطلب استخدام شفرة حلاقة مستقيمة لإزالة الشعر مشغلا ماهرا. إذا لم يتم إجراؤها بشكل صحيح ، فقد يتسبب ذلك في تهيج الجلد. ضع في اعتبارك استخدام كريم مزيل الشعر أو كليبرز أو ماكينة حلاقة آمنة لإزالة الشعر.
4. وزن الماوس ومقارنة تغيرات الوزن بين كل مجموعة.

2. تحفيز حساسية البطن

1. تأكد من الشفاء التام لأي إصابة طفيفة في جلد البطن ناتجة عن الحلاقة. تطبيق حساسية البطن بعد يومين من الحلاقة (اليوم 2).
2. تحضير محلول DNFB بنسبة 0.5٪: قم بتخفيف DNFB بالأسيتون: خليط زيت الزيتون بنسبة 4: 1 (على سبيل المثال ، 400 ميكرولتر من الأسيتون الممزوج ب 100 ميكرولتر من زيت الزيتون ؛ انظر جدول المواد). استخدم مسدس ماصة للنفخ والخلط 20 مرة لخلط محلول DNFB جيدا. قبل كل إدارة لمحلول DNFB للماوس ، قم بنفخه وخلطه ثلاث إلى خمس مرات.
   ملاحظة: قم بإعداد المحلول قبل الاستخدام ولفه بورق الألمنيوم لحمايته من أشعة الشمس المباشرة.
3. ضع 25 ميكرولتر من محلول DNFB بنسبة 0.5٪ على جلد المنطقة المحلوقة على بطن الفئران باستخدام ماصة (الشكل 2 ب).
4. قم بتقطير محلول DNFB على منتصف منطقة حلاقة البطن ووزعه برفق مع الجانب الأملس من طرف الماصة لتفريقه بشكل موحد.
5. بعد 30 ثانية من تحفيز DNFB ، ضع الفئران في أقفاص فارغة بدون فراش لمنعها من فرك محلول DNFB. عندما يجف محلول DNFB تماما (حوالي 2 دقيقة) ، أعد الفئران إلى قفصها الأصلي.
6. ارتد القفازات عند التعامل مع محلول DNFB لأنه مهيج بشدة لجلد الإنسان.

3. تحفيز حساسية الأذن

1. قم بإعداد محلول DNFB بنسبة 0.2٪ على النحو الوارد أعلاه ، ومحلول السيارة (خليط 4: 1 من الأسيتون وزيت الزيتون) ، والماء النقي.
2. قم بتوجيه جسم الفأر واجعل الحد الخارجي للأذن متجها لأسفل أثناء العملية بأكملها لمنع المحلول من دخول قناة الأذن أثناء تحفيز DNFB.
3. في الأيام 4 و 6 و 8 و 10 ، استخدم ماصة لتطبيق 20 ميكرولتر من محلول DNFB بنسبة 0.2٪ أو محلول السيارة ببطء وبشكل موحد على السطح الداخلي للأذن اليسرى للفئران. لتجنب دخول محلول DNFB إلى قناة الأذن ، استخدم الجانب الأملس من طرف الماصة لتوزيع محلول DNFB برفق أثناء الإعطاء. اترك الأذنين اليمنى دون علاج (الشكل 2C).
4. انتظر حتى يجف محلول DNFB وضع الفئران مرة أخرى في القفص (حوالي 30 ثانية).
5. ارتد قفازات عند التعامل مع محلول DNFB.

4. تسجيل وزن الماوس وأعراض ACD

1. وزن الماوس كل يوم ، وابدأ في اليوم 1 ، وقارن مع وزنه المقابل في اليوم 0 ؛ تقييم تأثير ACD على وزن جسم الفئران حيث تغير الوزن (ز) ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM).
2. التقط صورا عالية الدقة لآذان الفأر لتسجيل الأعراض السريرية ل ACD كل يومين ، بدءا من اليوم 1.

5. قياس سمك الأذن

1. قياس سمك الأذن كل يومين ، بدءا من اليوم 1. قياس وتسجيل كلتا الأذنين بالتفصيل.
2. استخدم ملاقط الورنية (انظر جدول المواد) لقياس سمك الأذن في نفس الوقت كل يوم للحصول على نتائج دقيقة (الشكل 3 أ). أوقف الفرجار الورني من الاستمرار في التثبيت الداخلي عندما يكون هناك انسداد طفيف ، لمنع تلف الأنسجة في أذن الفأر. حافظ على المركز ثابتا وسجل البيانات.
3. اجمع السماكة من ثلاثة مواقع مختلفة على كل أذن (الشكل 3 ب). سجل متوسط البيانات الثلاثة كقيمة صالحة. تقييم تورم الأذن بالميكرومتر (ميكرومتر) ± الخطأ القياسي للمتوسط (SEM).

6. تقييم درجة التورم الالتهابي

1. تحضير محلول صبغة إيفانز الزرقاء بنسبة 0.5٪ (انظر جدول المواد): تمييع صبغة إيفانز الزرقاء بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) في اليوم 11. ارتد معطف المختبر والقفازات في جميع الأوقات ، لأن صبغة إيفانز الزرقاء سامة قليلا للإنسان.
2. شل حركة الفئران باستخدام مثبت: افتح غطاء المثبت (انظر جدول المواد) ، وأمسك ذيل الماوس ، واجعل رأس الماوس يواجه المثبت ، واجعل الماوس يتسلق غريزيا إلى المثبت. قم بتغطية الغطاء ، واجعل ذيل الماوس يخرج من الفتحة الموجودة على الغطاء ، واضبط طول المثبت لفضح ذيل الماوس بالكامل.
3. امسح الذيل بشكل متكرر باستخدام كرة قطنية كحولية أو انقعها في ماء دافئ لمدة 30 ثانية ، واضغط برفق على جذر الذيل لملء وتوسيع الأوردة على كلا الجانبين. إجراء الحقن تحت تشعيع مصدر الضوء البارد.
4. حقن ببطء محلول صبغة إيفانز الزرقاء في الوريد ذيل الفأر باستخدام إبرة الأنسولين 1 مم. انتظر لمدة 15 دقيقة ثم التقط صورا لآذان الماوس.
   ملاحظة: ضع الماوس على الطاولة وأمسكه برفق لكشف منطقة الأذن للحصول على الصور. بعد وقت قصير من الحقن بمحلول صبغة إيفانز الزرقاء ومراقبة المؤشرات المقابلة ، استخدم خلع عنق الرحم للقتل الرحيم للفأر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تحت التحفيز المتكرر DNFB ، أظهرت آذان الفئران لمجموعة DNFB أعراضا سريرية واضحة مماثلة ل ACD ، مع المناطق الحساسة التي تظهر الأعراض النموذجية للاحمرار والجفاف وحتى التآكل والنضح. ومع ذلك ، فإن إعطاء الأذن للمياه النقية (المجموعة الضابطة) أو التحكم في المذيبات (مجموعة المركبات) لم ينتج عنه أعراض ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يمكن استخدام البروتوكول الموصوف هنا لإحداث أعراض تشبه ACD في آذان الفئران لدراسة الفيزيولوجيا المرضية ل ACD وكأداة فحص لتطوير أدوية جديدة.

هناك خطوتان رئيسيتان لإنشاء نموذج ACD: التحسس الأولي ، والتحفيز اللاحق. عادة ما يكون البطن هو موقع التحسس الأولي ، ولكن تم اختيار موقع التح...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB)	Merck	200-734-3	1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene, ≥99%
Acetone	Sinopharm Chemical Reagent Co. LTD	10000418	≥99.5%
Aluminum foil	Cleanwrap	CF-2
Evans blue dye	Solarbio	314-13-6	Dye content approx. 80%
Mouse fixator	ZHUYANBANG	GEGD-SM1830
Olive oil	Solarbio	8001-25-0	500 ml
Pipet tip	Biofount	FT-200	10 - 200 μl
Pipettor	Eppendorf AG	3123000250	20 - 200 μl
Razor blade	Shanghai Gillette Co. LTD	74-S
Vernier calipers	Delixi Electric	DECHOTVCS1200