Alerjik Kontakt Dermatit Değerlendirmesi için Fare Kulak Modeli

Özet

Burada, fare kulaklarında alerjik kontakt dermatiti 1-floro-2,4-dinitrobenzen (DNFB) ile indükleme yöntemlerini ve alerjik kontakt dermatitin ciddiyetinin nasıl değerlendirileceğini açıklıyoruz.

Özet

Deri, insan vücudunun ilk savunma hattıdır ve çevresel kimyasallara en çok maruz kalan organlardan biridir. Allerjik kontakt dermatit (AKB), lokal döküntü, kızarıklık ve deri lezyonları şeklinde kendini gösteren yaygın bir deri hastalığıdır. AKB'nin oluşumu ve gelişimi hem genetik hem de çevresel faktörlerden etkilenir. Son yıllarda birçok bilim adamı bir dizi ACD modeli oluşturmuş olsa da, bu modellerin deneysel protokollerinin hepsi farklıdır, bu da okuyucuların bunları iyi bir şekilde kurmasını zorlaştırmaktadır. Bu nedenle, atopik dermatitin patogenezini daha fazla incelemek için istikrarlı ve etkili bir hayvan modeli büyük önem taşımaktadır. Bu çalışmada, farelerin kulaklarında ACD benzeri semptomları indüklemek için 1-floro-2,4-dinitrobenzen (DNFB) kullanan bir modelleme yöntemini detaylandırdık ve modelleme sırasında dermatitin şiddetini değerlendirmek için çeşitli yöntemleri tanımladık. Bu deneysel protokol bazı deneylerde başarıyla uygulanmıştır ve ACD araştırması alanında belirli bir tanıtım rolüne sahiptir.

Giriş

Allerjik kontakt dermatit (AKB), temas bölgesinde egzama benzeri semptomlar, orta derecede vakalarda ödem ve eritem ve ağır vakalarda papüller, erozyon, eksüdasyon ve hatta masif yara izleri ile karakterize yaygın bir deri hastalığıdır¹. Nüfusun% 20'sine kadar etkiler ve² yaştaki her insanı etkileyebilir. ACD genellikle tekrar tekrar alerjenlere maruz kalan bireylerde görülür ve bireyin evlerinde veya işyerlerinde bir veya daha fazla alerjene karşı bağışıklık tepkisinden kaynaklanabilir³. Tip IV gecikmiş aşırı duyarlılık, ACD^4'te ana immün yanıt tipi olarak kabul edilir. Cildin tekrar tekrar alerjenlere maruz kalan bölgelerinde, dolaşımdaki hafıza T hücreleri çok sayıda birikir ve immün ve enflamatuar yanıtları indükler ^3,5,6. Bu çalışmanın amacı, AKB gelişiminde immünolojik ve inflamatuar yanıtların daha fazla araştırılması için güvenilir bir laboratuvar tekniği önermektir.

ACD'nin başlangıcı genellikle kimyasallara tekrar tekrar maruz kalmanın neden olduğu temas aşırı duyarlılığından kaynaklanmaktadır. Çok sayıda araştırmacı, hastalığın başlangıcını simüle etmek için son birkaç on yılda ev fareleri^7,8, kobaylar ^9,10 ve diğer hayvanlarda çeşitli ACD hayvan modelleri geliştirmiştir. Deneysel yöntemlerin çoğu iki aşamadan oluşur: abdominal sensitizasyon (indüksiyon) ve sırtta veya kulak memesinde uyaran sağlama (stimülasyon). Yaygın olarak kullanılan kimyasal maddeler arasında esas olarak 1-floro-2,4-dinitrobenzen (DNFB) / 1-kloro-2,4-dinitrobenzen (DNCB)^8,9,11, oksazolon 12, urushiol ^13, vb. Bulunur. Bunlar arasında, DNFB ve DNCB en yaygın kullanılanlardır, ilk olarak Ekim 1958'de bildirilmiştir¹⁰. Nikel sensitizasyon modeli¹⁴ ve fotoalerjik kontakt dermatit modeli¹⁵ de sıklıkla kullanılmaktadır.

ACD modelini oluşturmak için deneysel bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, önceki çalışmalara dayanarak ve çoklu deneylerle karşılaştırılarak özetlenmiş ve optimize edilmiştir. Diğer ACD modelleriyle karşılaştırıldığında, bu modelin küçük bireysel farklılıklar, kısa deney süreleri, az miktarda kimyasal stimülasyon vb. gibi bazı avantajları vardır. Ek olarak, bu çalışma sadece ekonomik değil, aynı zamanda gen nakavtı veya transgenik farelerin hazırlanması için daha fazla seçeneğe sahip olan fareler için de geçerlidir¹⁶. Ayrıca, deneyde ACD ilerlemesini izlemek için kullanılan kulak kalınlığını ölçmek, enflamatuar eksüdasyonu ölçmek için Evans mavi boyası kullanmak gibi çeşitli yöntemleri de açıklıyoruz. Bu model sadece AKB'nin patogenezini araştırmak için fare kulaklarını, kanını, dalağı ve diğer örnekleri laboratuvar araçlarıyla analiz etmekle kalmaz, aynı zamanda belirli bir tanıtım önemi olan yeni terapötik yöntemlerin klinik öncesi değerlendirmesi için de geçerlidir.

Protokol

Farelerin tüm bakım ve tedavisi, Yangzhou Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından belirlenen yönergelere uygun olarak yapıldı ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından SYXK (SU) 2022-0044 proje lisansı kapsamında onaylandı. Bu çalışmada 6-8 haftalık BALB/c erkek ve dişi fareler kullanıldı. Her grup altı fareden oluşuyordu (bakınız Malzeme Tablosu). Kafesler, yiyecek ve suya serbest erişimi olan sıcaklık kontrollü bir odaya (22 ± 2 ° C, 12 saat ışık / karanlık döngüsü) yerleştirildi. Deneysel bir akış diyagramı Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. Hayvan hazırlama

1. Çevreye 1 haftalık alışmadan sonra modellemeye başlayın.
2. Fareleri manipüle etmeden önce çevreyi ve tezgahları temizlemek ve dezenfekte etmek için ultraviyole lamba ve% 75 alkol dezenfektanı kullanın.
   NOT: Dış etkenlerin etkisinden kaçınmak için, fareleri tanımlama için işaretlemek fare kulağında gerçekleştirilemez; Arkada veya kuyrukta lekelenme alternatif olarak kullanılabilir.
3. Farelerin karnına sabunlu su uygulamak için küçük bir pamuklu çubuk kullanın (yaklaşık 1-2^cm2 büyüklüğünde). Modellemenin başında (gün 0; Şekil 2A).
   NOT: Epilasyon için düz tıraş bıçağı kullanımı yetenekli bir operatör gerektirir. Doğru şekilde yapılmazsa, cilt tahrişine neden olabilir. Epilasyon için tüy dökücü krem, kesme makineleri veya güvenli bir tıraş bıçağı kullanmayı düşünün.
4. Fareyi tartın ve her grup arasındaki ağırlık değişikliklerini karşılaştırın.

2. Abdominal sensitizasyon stimülasyonu

1. Tıraştan kaynaklanan karın derisindeki herhangi bir küçük yaralanmanın tam olarak iyileşmesini sağlayın. Karın hassasiyetini tıraştan 2 gün sonra uygulayın (2. gün).
2. % 0.5 DNFB çözeltisini hazırlayın: DNFB'yi bir asetonla seyreltin: zeytinyağı karışımı 4: 1 oranında (örneğin, 400 μL zeytinyağı ile karıştırılmış 100 μL aseton ; bkz. DNFB çözeltisini iyice karıştırmak için üflemek ve 20 kez karıştırmak için bir pipet tabancası kullanın. DNFB çözeltisinin fareye her uygulanmasından önce, üç ila beş kez üfleyin ve karıştırın.
   NOT: Kullanmadan önce çözeltiyi hazırlayın ve doğrudan güneş ışığından korumak için alüminyum folyoya sarın.
3. % 0.5 DNFB çözeltisinin 25 μL'sini, farelerin karnındaki tıraş edilmiş bölgenin cildine bir pipetleyici ile uygulayın (Şekil 2B).
4. DNFB solüsyonunu karın tıraş alanının ortasına sürün ve pipetleyici ucunun pürüzsüz tarafı ile hafifçe yayınlayarak düzgün bir şekilde dağıtın.
5. DNFB stimülasyonundan 30 sn sonra, DNFB çözeltisini ovalamalarını önlemek için fareleri yataksız boş kafeslere yerleştirin. DNFB çözeltisi tamamen kuruduğunda (yaklaşık 2 dakika), fareleri orijinal kafeslerine geri döndürün.
6. DNFB solüsyonunu kullanırken eldiven giyin, çünkü insan cildini ciddi şekilde tahriş eder.

3. Kulak hassaslaştırma stimülasyonu

1. Yukarıdaki gibi% 0.2'lik bir DNFB çözeltisi, araç çözeltisi (4: 1 aseton ve zeytinyağı karışımı) ve saf su hazırlayın.
2. DNFB stimülasyonu sırasında çözeltinin kulak kanalına girmesini önlemek için fare gövdesini yönlendirin ve tüm operasyon boyunca kulak kepçesinin dış kenarlığını aşağı bakacak şekilde yapın.
3. 4, 6, 8 ve 10. günlerde, farelerin sol kulak kepçelerinin iç yüzeyine yavaş ve düzgün bir şekilde% 0.2 DNFB çözeltisinin veya araç çözeltisinin 20 μL'sini uygulamak için bir pipetleyici kullanın. DNFB çözeltisinin kulak kanalına girmesini önlemek için, uygulama sırasında DNFB çözeltisini nazikçe dağıtmak üzere pipetleyici ucunun pürüzsüz tarafını kullanın. Sağ kulakları tedavi edilmeden bırakın (Şekil 2C).
4. DNFB çözeltisi kuruyana kadar bekleyin ve fareleri tekrar kafese yerleştirin (yaklaşık 30 s).
5. DNFB çözümünü kullanırken eldiven giyin.

4. Fare ağırlığını ve ACD semptomlarını kaydetme

1. Fareyi her gün tartın, 1. günde başlayın ve 0. günde karşılık gelen ağırlığıyla karşılaştırın; ACD'nin farelerin vücut ağırlığı üzerindeki etkisini, ağırlık değişimi (g) ortalamanın standart hatası (SEM) ± olarak değerlendirmek.
2. 1. günden başlayarak her 2 günde bir ACD klinik semptomlarını kaydetmek için fare kulaklarının yüksek çözünürlüklü fotoğraflarını çekin.

5. Kulak kepçesi kalınlığının ölçülmesi

1. Kulak kepçesi kalınlığını 1. günden başlayarak her 2 günde bir ölçün. Her iki kulağı da ayrıntılı olarak ölçün ve kaydedin.
2. Doğru sonuçlar için kulak kepçesi kalınlığını her gün aynı saatte ölçmek için vernier kaliperleri kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız) (Şekil 3A). Fare kulağında doku hasarını önlemek için hafif bir tıkanıklık olduğunda vernier kaliperlerinin içe doğru sıkıştırmaya devam etmesini durdurun. Konumu sabit tutun ve verileri kaydedin.
3. Her kulak kepçesi üzerindeki üç farklı konumdan kalınlığı toplayın (Şekil 3B). Üç verinin ortalamasını geçerli bir değer olarak kaydedin. Kulak şişmesini mikrometre (μm) cinsinden ortalamanın standart hatası (SEM) ± değerlendirin.

6. Enflamatuar şişlik derecesinin değerlendirilmesi

1. % 0.5 Evans mavi boyası hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız): Evans mavi boyasını 11. günde fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltin. Evans mavi boyası insanlar için biraz toksik olduğu için her zaman bir laboratuvar önlüğü ve eldiven giyin.
2. Fareleri bir fiksatör ile hareketsiz hale getirin: fiksatörün kapağını açın (bakınız Malzeme Tablosu), fare kuyruğunu tutun, farenin kafasını fiksatöre bakacak şekilde yapın ve farenin içgüdüsel olarak fiksatöre tırmanmasını sağlayın. Kapağı kapatın, fare kuyruğunun kapaktaki delikten çıkmasını sağlayın ve tüm fare kuyruğunu ortaya çıkarmak için fiksatörün uzunluğunu ayarlayın.
3. Kuyruğu alkollü bir pamuk topu ile tekrar tekrar silin veya 30 saat boyunca ılık suya batırın ve her iki taraftaki damarları doldurmak ve genişletmek için kuyruğun kökünü hafifçe sıkıştırın. Enjeksiyonu soğuk bir ışık kaynağının ışınlaması altında gerçekleştirin.
4. Evans mavi boya çözeltisini 1 mm'lik bir insülin iğnesi kullanarak fare kuyruğu damarına yavaşça enjekte edin. 15 dakika bekleyin ve ardından fare kulaklarının fotoğraflarını çekin.
   NOT: Fareyi masanın üzerine koyun ve görüntü alma için kulak bölgesini ortaya çıkarmak üzere hafifçe tutun. Evans mavi boya çözeltisi ile enjeksiyondan kısa bir süre sonra ve ilgili endikasyonları gözlemleyerek, fareyi ötenazi yapmak için servikal çıkık kullanın.

Sonuçlar

Tekrarlanan DNFB stimülasyonu altında, DNFB grubunun fare kulakları, ACD ile karşılaştırılabilir belirgin klinik semptomlar gösterdi ve hassas bölgeler tipik kızarıklık, kuruluk ve hatta erozyon ve eksüdasyon belirtileri gösterdi. Bununla birlikte, saf suyun (kontrol grubu) veya çözücü kontrolünün (araç grubu) kulağa uygulanması benzer semptomlar üretmemiştir (Şekil 4).

Bu arada, DNFB grubunda, tedavi edilmeyen sağ kulağa kıyasla, DNF...

Tartışmalar

Farelerin kulaklarında ACD benzeri semptomları indüklemek için burada açıklanan protokol, ACD'nin patofizyolojisini incelemek ve yeni ilaçların geliştirilmesi için bir tarama aracı olarak kullanılabilir.

Bir ACD modeli oluşturmak için iki önemli adım vardır: ilk duyarlılaşma ve sonraki stimülasyon. Karın genellikle ilk duyarlılaşma bölgesidir, ancak sonraki stimülasyon bölgesi biraz farklı seçilmiştir. Önceki çalışmalar, çoğu bilim insanının farelerin arkas...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB)	Merck	200-734-3	1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene, ≥99%
Acetone	Sinopharm Chemical Reagent Co. LTD	10000418	≥99.5%
Aluminum foil	Cleanwrap	CF-2
Evans blue dye	Solarbio	314-13-6	Dye content approx. 80%
Mouse fixator	ZHUYANBANG	GEGD-SM1830
Olive oil	Solarbio	8001-25-0	500 ml
Pipet tip	Biofount	FT-200	10 - 200 μl
Pipettor	Eppendorf AG	3123000250	20 - 200 μl
Razor blade	Shanghai Gillette Co. LTD	74-S
Vernier calipers	Delixi Electric	DECHOTVCS1200