Модель уха мыши для оценки аллергического контактного дерматита

Резюме

Здесь мы описываем методы индуцирования аллергического контактного дерматита в ушах мышей 1-фтор-2,4-динитробензолом (DNFB) и способы оценки тяжести аллергического контактного дерматита.

Аннотация

Кожа является первой линией защиты человеческого организма и одним из органов, наиболее подверженных воздействию химических веществ окружающей среды. Аллергический контактный дерматит (АКД) является распространенным кожным заболеванием, которое проявляется в виде местной сыпи, покраснения и поражений кожи. На возникновение и развитие АКД влияют как генетические факторы, так и факторы окружающей среды. Хотя в последние годы многие ученые построили серию моделей АКД, экспериментальные протоколы всех этих моделей различны, что затрудняет читателям их установление. Поэтому стабильная и эффективная животная модель имеет большое значение для дальнейшего изучения патогенеза атопического дерматита. В этом исследовании мы подробно описываем метод моделирования с использованием 1-фтор-2,4-динитробензола (DNFB) для индуцирования ACD-подобных симптомов в ушах мышей и описываем несколько методов оценки тяжести дерматита во время моделирования. Этот экспериментальный протокол был успешно применен в некоторых экспериментах и играет определенную рекламную роль в области исследований ACD.

Введение

Аллергический контактный дерматит (АКД) является распространенным кожным заболеванием, которое характеризуется экземоподобными симптомами в месте контакта, отеком и эритемой в умеренных случаях, а также папулами, эрозиями, экссудацией или даже массивными рубцами в тяжелых случаях¹. Он поражает до 20% населения и может поражать людей любого возраста². ACD часто возникает у людей, которые неоднократно подвергались воздействию аллергенов, и может быть вызван иммунным ответом человека на один или несколько аллергенов в их доме или на рабочем месте³. Отсроченная гиперчувствительность IV типа считается основным типом иммунного ответа при ACD⁴. На участках кожи, которые неоднократно подвергались воздействию аллергенов, циркулирующие Т-клетки памяти накапливаются в большом количестве и вызывают иммунные и воспалительные реакции ^3,5,6. Целью данной работы является предложение надежной лабораторной методики для дальнейшего исследования иммунологических и воспалительных реакций при развитии АКД.

Начало АКД обычно связано с контактной гиперчувствительностью, вызванной повторным воздействием химических веществ. В течение последних нескольких десятилетий многочисленные исследователи разработали различные модели животных ACD у домашних мышей^7,8, морских свинок ^9,10 и других животных^, чтобы имитировать начало заболевания. Большинство экспериментальных методов состоят из двух этапов: абдоминальная сенсибилизация (индукция) и обеспечение стимулов на спине или мочке уха (стимуляция). Обычно используемые химические вещества в основном включают 1-фтор-2,4-динитробензол (DNFB) / 1-хлор-2,4-динитробензол (DNCB) ^8,9,11, оксазолон 12^, урушиол ¹³ и т. Д. Среди них наиболее широко используются DNFB и DNCB, о которых впервые сообщалось в октябре 1958 года¹⁰. Также часто используются модель^{сенсибилизации никеля 14} и фотоаллергический контактный дерматит модели¹⁵.

Представлен экспериментальный метод построения модели ACD. Этот метод обобщен и оптимизирован на основе предыдущих исследований и после сравнения с несколькими экспериментами. По сравнению с другими моделями ACD эта модель имеет некоторые преимущества, такие как небольшие индивидуальные различия, короткие периоды эксперимента, небольшое количество химической стимуляции и т. д. Кроме того, это исследование применимо к мышам, которые не только экономичны, но и имеют больше возможностей для нокаута генов или подготовки трансгенных мышей¹⁶. Мы также описываем различные методы, используемые для мониторинга прогресса ACD в эксперименте, такие как измерение толщины уха, использование синего красителя Эванса для измерения воспалительной экссудации и т. д. Эта модель может не только анализировать мышиные уши, кровь, селезенку и другие образцы лабораторными средствами для изучения патогенеза АКД, но также применима для доклинической оценки новых терапевтических методов, что имеет определенное рекламное значение.

протокол

Весь уход и лечение мышей осуществлялись в соответствии с руководящими принципами, установленными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Янчжоу, и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в соответствии с лицензией проекта SYXK (SU) 2022-0044. В этом исследовании использовались самцы и самки мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель. Каждая группа состояла из шести мышей (см. Таблицу материалов). Клетки были помещены в камеру с регулируемой температурой (22 ± 2 °C, 12-часовой цикл свет/темнота) со свободным доступом к пище и воде. Экспериментальная блок-схема показана на рисунке 1.

1. Подготовка животных

1. Приступайте к моделированию после 1 недели акклиматизации к окружающей среде.
2. Используйте ультрафиолетовую лампу и дезинфицирующее средство с 75% спиртом для очистки и дезинфекции окружающей среды и столешниц перед манипуляциями с мышами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание влияния внешних факторов маркировка мышей для идентификации не может быть выполнена на ухе мыши; В качестве альтернативы можно использовать окрашивание на спине или на хвосте.
3. С помощью небольшого ватного тампона нанесите мыльную воду на брюшко мышей (размером примерно 1-2 см² дюйма). Побрейте область по направлению роста волос лезвием или бритвой (см. Таблицу материалов) в начале моделирования (0-й день; Рисунок 2А).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование прямого бритвенного лезвия для удаления волос требует квалифицированного оператора. При неправильном выполнении это может вызвать раздражение кожи. Рассмотрите возможность использования крема для депиляции, машинок для стрижки или безопасной бритвы для удаления волос.
4. Взвесьте мышь и сравните изменения веса в каждой группе.

2. Стимуляция абдоминальной сенсибилизации

1. Обеспечьте полное восстановление любых незначительных повреждений кожи живота, вызванных бритьем. Применяют сенсибилизацию живота через 2 дня после бритья (2-й день).
2. Приготовьте 0,5% раствор DNFB: разбавьте DNFB смесью ацетона: оливкового масла в соотношении 4:1 (например, 400 мкл ацетона, смешанного со 100 мкл оливкового масла; см. Таблицу материалов). С помощью пипетки выдуйте и перемешайте 20 раз, чтобы тщательно перемешать раствор DNFB. Перед каждым введением раствора ДНФБ в мышь продувают и перемешивают его три-пять раз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте раствор перед использованием и заверните его в алюминиевую фольгу, чтобы защитить его от прямых солнечных лучей.
3. Нанесите 25 мкл 0,5% раствора ДНФБ на кожу бритого участка на животе мышей с помощью пипетки (рис. 2Б).
4. Нанесите раствор DNFB на середину области бритья живота и слегка распределите гладкой стороной наконечника пипетки, чтобы равномерно рассеять его.
5. Через 30 секунд после стимуляции DNFB поместите мышей в пустые клетки без подстилки, чтобы они не вытирали раствор DNFB. Когда раствор DNFB полностью высохнет (около 2 минут), верните мышей в исходную клетку.
6. При работе с раствором DNFB надевайте перчатки, так как он сильно раздражает кожу человека.

3. Стимуляция сенсибилизации уха

1. Приготовьте 0,2% раствор DNFB, как указано выше, раствор транспортного средства (смесь ацетона и оливкового масла 4:1) и чистую воду.
2. Ориентируйте тело мыши и сделайте внешнюю границу ушной раковины обращенной вниз в течение всей операции, чтобы предотвратить попадание раствора в слуховой проход во время стимуляции DNFB.
3. На 4, 6, 8 и 10-й дни с помощью пипетки медленно и равномерно наносите 20 мкл 0,2% раствора ДНФБ или раствора носителя на внутреннюю поверхность левых ушных раковин мышей. Чтобы избежать попадания раствора DNFB в ушной канал, используйте гладкую сторону наконечника пипетки, чтобы аккуратно распределить раствор DNFB во время введения. Оставьте правое ухо без лечения (рис. 2C).
4. Подождите, пока раствор DNFB высохнет, и поместите мышей обратно в клетку (около 30 с).
5. Надевайте перчатки при работе с раствором DNFB.

4. Запись веса мыши и симптомов ACD

1. Взвешивайте мышь каждый день, начинайте с 1-го дня и сравнивайте с соответствующим весом в 0-й день; оценить влияние ACD на массу тела мышей по мере изменения веса (g) ± стандартной ошибки среднего значения (SEM).
2. Делайте фотографии ушей мыши с высоким разрешением, чтобы записывать клинические симптомы ACD каждые 2 дня, начиная с 1-го дня.

5. Измерение толщины ушной раковины

1. Измеряйте толщину ушной раковины каждые 2 дня, начиная с 1-го дня. Измерьте и запишите оба уха в деталях.
2. Используйте штангенциркуль (см. Таблицу материалов) для измерения толщины ушной раковины в одно и то же время каждый день для получения точных результатов (рис. 3A). Остановите штангенциркуль от продолжения зажима внутрь при небольшой закупорке, чтобы предотвратить повреждение тканей уха мыши. Сохраняйте фиксированное положение и записывайте данные.
3. Соберите толщину из трех разных мест на каждой ушной раковине (рис. 3B). Запишите среднее значение трех данных в качестве допустимого значения. Оцените отек уха в микрометрах (мкм) ± стандартную ошибку среднего значения (SEM).

6. Оценка степени воспалительного отека

1. Приготовьте 0,5% раствор синего красителя Эванса (см. Таблицу материалов): разбавьте краситель синий Эванса фосфатным буферным физиологическим раствором (PBS) на 11-й день. Всегда носите лабораторный халат и перчатки, так как синий краситель Эванса слегка токсичен для человека.
2. Обездвижите мышей с помощью фиксатора: откройте крышку фиксатора (см. Таблицу материалов), возьмитесь за хвост мыши, сделайте голову мыши лицом к фиксатору и заставьте мышь инстинктивно залезть в фиксатор. Закройте крышку, сделайте так, чтобы хвост мыши вышел из отверстия на крышке, и отрегулируйте длину фиксатора, чтобы обнажить весь хвост мыши.
3. Несколько раз протрите хвост спиртовым ватным тампоном или замочите его в теплой воде на 30 секунд и аккуратно защипните корень хвоста, чтобы заполнить и расширить жилки с обеих сторон. Выполняют инъекцию под облучение холодным источником света.
4. Медленно вводите раствор синего красителя Эванса в вену хвоста мыши с помощью инсулиновой иглы диаметром 1 мм. Подождите 15 минут, а затем сфотографируйте уши мыши.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Положите мышь на стол и осторожно удерживайте ее, чтобы обнажить область уха для получения изображения. Вскоре после инъекции раствором синего красителя Эванса и соблюдая соответствующие показания, используйте вывих шейки матки для эвтаназии мыши.

Результаты

При повторной стимуляции DNFB уши мыши в группе DNFB проявляли очевидные клинические симптомы, сравнимые с ACD, с чувствительными областями, демонстрирующими типичные симптомы покраснения, сухости и даже эрозии и экссудации. Однако введение чистой воды в ухо (контрольная группа) или контрол...

Обсуждение

Описанный здесь протокол для индуцирования ACD-подобных симптомов в ушах мышей может быть использован для изучения патофизиологии ACD и в качестве инструмента скрининга для разработки новых лекарств.

Существует два ключевых шага для создания модели ACD: начальная сенсибил?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB)	Merck	200-734-3	1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene, ≥99%
Acetone	Sinopharm Chemical Reagent Co. LTD	10000418	≥99.5%
Aluminum foil	Cleanwrap	CF-2
Evans blue dye	Solarbio	314-13-6	Dye content approx. 80%
Mouse fixator	ZHUYANBANG	GEGD-SM1830
Olive oil	Solarbio	8001-25-0	500 ml
Pipet tip	Biofount	FT-200	10 - 200 μl
Pipettor	Eppendorf AG	3123000250	20 - 200 μl
Razor blade	Shanghai Gillette Co. LTD	74-S
Vernier calipers	Delixi Electric	DECHOTVCS1200