מודל אוזן עכבר להערכת דרמטיטיס במגע אלרגי

Summary

כאן, אנו מתארים את השיטות לגרימת דרמטיטיס מגע אלרגי באוזני עכבר על ידי 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) וכיצד להעריך את חומרת דרמטיטיס מגע אלרגי.

Abstract

העור הוא קו ההגנה הראשון של גוף האדם ואחד האיברים החשופים ביותר לכימיקלים סביבתיים. דרמטיטיס מגע אלרגי (ACD) היא מחלת עור נפוצה המתבטאת בפריחה מקומית, אדמומיות ונגעים בעור. המופע וההתפתחות של ACD מושפעים מגורמים גנטיים וסביבתיים כאחד. למרות שחוקרים רבים בנו סדרה של מודלים של ACD בשנים האחרונות, הפרוטוקולים הניסיוניים של מודלים אלה שונים זה מזה, מה שמקשה על הקוראים לבסס אותם היטב. לכן, מודל יציב ויעיל של בעלי חיים הוא בעל משמעות רבה למחקר נוסף של הפתוגנזה של אטופיק דרמטיטיס. במחקר זה, אנו מפרטים שיטת מידול באמצעות 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) כדי לגרום לתסמינים דמויי ACD באוזניים של עכברים ומתארים מספר שיטות להערכת חומרת דרמטיטיס במהלך דוגמנות. פרוטוקול ניסויי זה יושם בהצלחה בכמה ניסויים ויש לו תפקיד קידום מכירות מסוים בתחום מחקר ACD.

Introduction

דלקת עור אלרגית במגע (ACD) היא מחלת עור נפוצה המאופיינת בתסמינים דמויי אקזמה במקום המגע, בצקת ואריתמה במקרים מתונים, ופפולות, שחיקה, הפרשה או אפילו צלקות מסיביות במקרים חמורים¹. זה משפיע על עד 20% מהאוכלוסייה והוא יכול להשפיע על אנשים בכל גיל². ACD מתרחשת לעתים קרובות אצל אנשים שנחשפו לאלרגנים שוב ושוב ויכולה להיגרם על ידי התגובה החיסונית של הפרט לאלרגן אחד או יותר בבית^{או במקום העבודה} 3. רגישות יתר מאוחרת מסוג IV נחשבת לסוג העיקרי של תגובה חיסונית ב- ACD⁴. באזורים בעור שנחשפו שוב ושוב לאלרגנים, תאי זיכרון T מצטברים במספרים גדולים ומעוררים תגובות חיסוניות ודלקתיות ^3,5,6. מטרת עבודה זו היא להציע טכניקת מעבדה אמינה לחקירה נוספת של תגובות אימונולוגיות ודלקתיות בפיתוח ACD.

הופעת ACD נובעת בדרך כלל מרגישות יתר למגע הנגרמת על ידי חשיפה חוזרת ונשנית לכימיקלים. חוקרים רבים פיתחו מודלים שונים של בעלי חיים ACD בעכברי בית^7,8, שרקנים ^9,10 ובעלי חיים אחרים במהלך העשורים האחרונים^, על מנת לדמות את הופעת המחלה. רוב שיטות הניסוי מורכבות משני שלבים: רגישות בטן (אינדוקציה) ומתן גירויים על הגב או על תנוך האוזן (גירוי). חומרים כימיים נפוצים כוללים בעיקר 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB)/1-chloro-2,4-dinitrobenzene (DNCB)^8,9,11, oxazolone 12, urushiol ^13, וכו ' ביניהם, DNFB ו- DNCB הם הנפוצים ביותר, שדווחו לראשונה באוקטובר 1958¹⁰. דגם רגישות ניקל¹⁴ ודרמטיטיס מגע פוטואלרגי מודל¹⁵ משמשים לעתים קרובות.

אנו מציגים שיטה ניסיונית לבניית מודל ACD. שיטה זו מסוכמת ומותאמת על בסיס מחקרים קודמים והשוואה עם ניסויים מרובים. בהשוואה למודלים אחרים של ACD, למודל זה יש כמה יתרונות, כגון הבדלים בודדים קטנים, תקופות ניסוי קצרות, כמות קטנה של גירוי כימי וכו '. בנוסף, מחקר זה חל על עכברים, שהם לא רק חסכוניים אלא גם יש אפשרויות רבות יותר עבור נוקאאוט גנים או הכנת עכברים טרנסגניים¹⁶. אנו מתארים גם את השיטות השונות המשמשות למעקב אחר התקדמות ACD בניסוי, כגון מדידת עובי האוזן, שימוש בצבע כחול אוונס למדידת הפרשה דלקתית ועוד. מודל זה יכול לא רק לנתח אוזני עכבר, דם, טחול ודגימות אחרות באמצעי מעבדה כדי לחקור את הפתוגנזה של ACD, אלא גם ישים להערכה פרה-קלינית של שיטות טיפוליות חדשות, שיש לה משמעות פרסומית מסוימת.

Protocol

כל הטיפול והטיפול בעכברים היו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת יאנגג'ואו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים תחת רישיון הפרויקט SYXK(SU) 2022-0044. במחקר זה נעשה שימוש בעכברים זכרים ונקבות BALB/c בגילאי 6-8 שבועות. כל קבוצה כללה שישה עכברים (ראו טבלת חומרים). הכלובים הוכנסו לתא מבוקר טמפרטורה (22 ± 2 מעלות צלזיוס, מחזור אור/חושך של 12 שעות) עם גישה חופשית למזון ומים. דיאגרמת זרימה ניסיונית מוצגת באיור 1.

1. הכנת בעלי חיים

1. התחל את הדוגמנות לאחר שבוע של התאקלמות לסביבה.
2. השתמשו במנורה אולטרה סגולה ובחומר חיטוי 75% אלכוהול כדי לנקות ולחטא את הסביבה ואת משטחי העבודה לפני ביצוע מניפולציה על העכברים.
   הערה: על מנת למנוע השפעה של גורמים חיצוניים, לא ניתן לבצע סימון העכברים לזיהוי על אוזן העכבר; כתמים על הגב או על הזנב יכולים לשמש כחלופה.
3. השתמש צמר גפן קטן כדי להחיל מי סבון על הבטן של העכברים (כ 1-2^ס" מ גודל). יש לגלח את האזור בכיוון צמיחת השיער בעזרת להב או מכונת גילוח (ראו טבלת חומרים) בתחילת הדוגמנות (יום 0; איור 2A).
   הערה: השימוש בסכין גילוח ישר להסרת שיער דורש מפעיל מיומן. אם לא מבוצע כראוי, הוא עלול לגרום לגירוי בעור. שקלו להשתמש בקרם מסיר שיער, קוצץ או סכין גילוח בטיחותי להסרת שיער.
4. שקלו את העכבר והשוו את שינויי המשקל בין כל קבוצה.

2. גירוי רגישות בטן

1. להבטיח החלמה מלאה של כל פציעה קלה בעור הבטן הנגרמת על ידי גילוח. יש למרוח את רגישות הבטן יומיים לאחר הגילוח (יום 2).
2. הכינו את תמיסת DNFB 0.5%: דללו DNFB בתערובת אצטון:שמן זית ביחס של 4:1 (למשל, 400 מיקרוליטר אצטון מעורבב עם 100 מיקרוליטר שמן זית; ראו טבלת חומרים). השתמש באקדח פיפטה כדי לנשוף ולערבב 20 פעמים כדי לערבב היטב את תמיסת DNFB. לפני כל מתן של פתרון DNFB לעכבר, לנשוף ולערבב אותו שלוש עד חמש פעמים.
   הערה: הכינו את התמיסה לפני השימוש ועטפו אותה ברדיד אלומיניום כדי להגן עליה מפני אור שמש ישיר.
3. מרחו 25 μL של תמיסת DNFB 0.5% על העור של האזור המגולח על בטן העכברים עם פיפטור (איור 2B).
4. טפטפו את תמיסת ה-DNFB על אמצע אזור גילוח הבטן ופזרו קלות עם הצד החלק של קצה הפיפטור לפיזור אחיד.
5. בגיל 30 שניות לאחר גירוי DNFB, הניחו את העכברים בכלובים ריקים ללא מצעים כדי למנוע מהם לשפשף את תמיסת DNFB. כאשר תמיסת DNFB יבשה לחלוטין (כ-2 דקות), החזירו את העכברים לכלוב המקורי שלהם.
6. יש ללבוש כפפות בעת הטיפול בתמיסת DNFB מכיוון שהיא מגרה מאוד את עור האדם.

3. גירוי רגישות האוזן

1. הכינו תמיסת DNFB 0.2% כאמור לעיל, תמיסת הרכב (תערובת 4:1 של אצטון ושמן זית) ומים טהורים.
2. כיוון את גוף העכבר והפוך את הגבול החיצוני של האאוריקל כלפי מטה במהלך כל הניתוח כדי למנוע מהתמיסה להיכנס לתעלת האוזן במהלך גירוי DNFB.
3. בימים 4, 6, 8 ו-10, השתמשו בפיפטור כדי למרוח 20 μL של תמיסת DNFB 0.2% או תמיסת רכב לאט ובאופן אחיד על פני השטח הפנימיים של האאוריקים השמאליים של העכברים. כדי למנוע מתמיסת DNFB להיכנס לתעלת האוזן, השתמש בצד החלק של קצה הפיפטור כדי לפזר בעדינות את תמיסת DNFB במהלך הממשל. השאירו את אוזני ימין ללא טיפול (איור 2C).
4. המתינו עד שתמיסת DNFB יבשה והחזירו את העכברים לכלוב (כ-30 שניות).
5. יש ללבוש כפפות בעת הטיפול בתמיסת DNFB.

4. רישום משקל עכבר ותסמיני ACD

1. לשקול את העכבר כל יום, להתחיל ביום 1, ולהשוות עם המשקל המתאים שלה ביום 0; להעריך את ההשפעה של ACD על משקל הגוף של עכברים כמו שינוי משקל (g) ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM).
2. צלם תמונות ברזולוציה גבוהה של אוזני העכבר כדי להקליט תסמינים קליניים של ACD כל יומיים, החל מהיום הראשון.

5. מדידת עובי האאוריקל

1. מדדו את עובי האאוריקל כל יומיים, החל מהיום הראשון. מדוד והקלט את שתי האוזניים בפירוט.
2. השתמשו בקליפרים של ורנייה (ראו טבלת חומרים) כדי למדוד את עובי האאוריקל באותה שעה בכל יום לקבלת תוצאות מדויקות (איור 3A). עצור את קליפרים vernier מלהמשיך הידוק פנימה כאשר יש חסימה קלה, כדי למנוע נזק רקמות לאוזן העכבר. שמור על המיקום קבוע ורשום את הנתונים.
3. אספו את העובי משלושה מיקומים שונים על כל אאוריקל (איור 3B). רשום את הממוצע של שלושת הנתונים כערך חוקי. להעריך את נפיחות האוזן במיקרומטרים (מיקרומטר) ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM).

6. הערכת מידת הנפיחות הדלקתית

1. הכינו 0.5% צבע כחול אוונס (ראו טבלת חומרים) פתרון: דללו את הצבע הכחול של אוונס במי מלח חוצצים פוספט (PBS) ביום ה-11. לבשו מעיל מעבדה וכפפות בכל עת, מכיוון שהצבע הכחול של אוונס רעיל מעט לבני אדם.
2. לשתק את העכברים עם קיבוע: לפתוח את מכסה הקיבוע (ראה טבלת חומרים), להחזיק את זנב העכבר, לגרום לראש העכבר מול הקיבוע, ולגרום לעכבר לטפס אינסטינקטיבית לתוך הקיבוע. כסו את המכסה, גרמו לזנב העכבר לצאת מהחור במכסה וכווננו את אורך הקיבוע כך שיחשוף את זנב העכבר כולו.
3. נגבו את הזנב שוב ושוב עם כדור צמר גפן אלכוהולי או השרו אותו במים חמים למשך 30 שניות, וצבטו בעדינות את שורש הזנב כדי למלא ולהרחיב את הוורידים משני הצדדים. בצע את ההזרקה תחת הקרנה של מקור אור קר.
4. הזריקו באיטיות תמיסת צבע כחול של אוונס לווריד זנב העכבר באמצעות מחט אינסולין 1 מ"מ. המתן 15 דקות ולאחר מכן צלם את אוזני העכבר.
   הערה: הנח את העכבר על השולחן והחזק אותו בעדינות כדי לחשוף את אזור האוזן לצורך רכישת תמונה. זמן קצר לאחר ההזרקה עם תמיסת הצבע הכחול של אוונס והתבוננות באינדיקציות המתאימות, השתמש בנקע צוואר הרחם כדי להרדים את העכבר.

תוצאות

תחת גירוי DNFB חוזר, אוזני העכבר של קבוצת DNFB הראו תסמינים קליניים ברורים דומים ל- ACD, כאשר אזורים רגישים הראו את הסימפטומים האופייניים של אדמומיות, יובש ואפילו שחיקה והפרשה. אולם מתן אוזניים של מים טהורים (קבוצת ביקורת) או בקרת ממס (קבוצת רכב) לא הניב תסמינים דומים (איור 4).

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן לגרימת תסמינים דמויי ACD באוזניהם של עכברים יכול לשמש לחקר הפתופיזיולוגיה של ACD וככלי סינון לפיתוח תרופות חדשות.

ישנם שני שלבים מרכזיים לביסוס מודל ACD: רגישות ראשונית, וגירוי עוקב. הבטן היא בדרך כלל האתר של רגישות ראשונית, אבל אתר הגירוי הבא נבחר מעט אחרת. ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB)	Merck	200-734-3	1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene, ≥99%
Acetone	Sinopharm Chemical Reagent Co. LTD	10000418	≥99.5%
Aluminum foil	Cleanwrap	CF-2
Evans blue dye	Solarbio	314-13-6	Dye content approx. 80%
Mouse fixator	ZHUYANBANG	GEGD-SM1830
Olive oil	Solarbio	8001-25-0	500 ml
Pipet tip	Biofount	FT-200	10 - 200 μl
Pipettor	Eppendorf AG	3123000250	20 - 200 μl
Razor blade	Shanghai Gillette Co. LTD	74-S
Vernier calipers	Delixi Electric	DECHOTVCS1200