Un modello di orecchio di topo per la valutazione della dermatite allergica da contatto

Riepilogo

Qui, descriviamo i metodi per indurre la dermatite allergica da contatto nelle orecchie di topo da 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) e come valutare la gravità della dermatite allergica da contatto.

Abstract

La pelle è la prima linea di difesa del corpo umano e uno degli organi più esposti alle sostanze chimiche ambientali. La dermatite allergica da contatto (ACD) è una malattia della pelle comune che si manifesta come eruzione cutanea locale, arrossamento e lesioni cutanee. La presenza e lo sviluppo di ACD sono influenzati da fattori sia genetici che ambientali. Sebbene molti studiosi abbiano costruito una serie di modelli di ACD negli ultimi anni, i protocolli sperimentali di questi modelli sono tutti diversi, il che rende difficile per i lettori stabilirli bene. Pertanto, un modello animale stabile ed efficiente è di grande importanza per studiare ulteriormente la patogenesi della dermatite atopica. In questo studio, descriviamo in dettaglio un metodo di modellazione che utilizza 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) per indurre sintomi simili ad ACD nelle orecchie dei topi e descriviamo diversi metodi per valutare la gravità della dermatite durante la modellazione. Questo protocollo sperimentale è stato applicato con successo in alcuni esperimenti e ha un certo ruolo promozionale nel campo della ricerca ACD.

Introduzione

La dermatite allergica da contatto (ACD) è una malattia della pelle comune caratterizzata da sintomi simili all'eczema nel sito di contatto, edema ed eritema nei casi moderati e papule, erosione, essudazione o anche cicatrici massicce nei casi più gravi¹. Colpisce fino al 20% della popolazione e può colpire persone di qualsiasi età². L'ACD si verifica spesso in individui che sono stati esposti ripetutamente agli allergeni e può essere causata dalla risposta immunitaria dell'individuo a uno o più allergeni nella loro casa o sul posto di lavoro³. L'ipersensibilità ritardata di tipo IV è considerata il principale tipo di risposta immunitaria nell'ACD⁴. Nelle aree della pelle che sono state ripetutamente esposte agli allergeni, le cellule T della memoria circolante si accumulano in gran numero e inducono risposte immunitarie e infiammatorie ^3,5,6. Lo scopo di questo lavoro è quello di proporre una tecnica di laboratorio affidabile per ulteriori indagini sulle risposte immunologiche e infiammatorie nello sviluppo di ACD.

L'insorgenza di ACD è solitamente dovuta all'ipersensibilità da contatto causata da ripetute esposizioni a sostanze chimiche. Numerosi ricercatori hanno sviluppato vari modelli animali ACD in topi domestici^7,8, porcellini d'India^9,10 e altri animali nel corso degli ultimi decenni^, al fine di simulare l'insorgenza della malattia. La maggior parte dei metodi sperimentali consiste in due fasi: sensibilizzazione addominale (induzione) e fornitura di stimoli sulla schiena o sul lobo dell'orecchio (stimolazione). Le sostanze chimiche comunemente usate includono principalmente 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) / 1-cloro-2,4-dinitrobenzene (DNCB) ^8,9,11, ossazolone¹², urushiol^13, ecc. Tra questi, DNFB e DNCB sono i più utilizzati, segnalati per la prima volta nell'ottobre 1958¹⁰. Anche la sensibilizzazione al nichel modello¹⁴ e la dermatite fotoallergica da contatto modello¹⁵ sono frequentemente utilizzate.

Presentiamo un metodo sperimentale per la costruzione del modello ACD. Questo metodo è riassunto e ottimizzato sulla base di studi precedenti e sul confronto con più esperimenti. Rispetto ad altri modelli ACD, questo modello presenta alcuni vantaggi, come piccole differenze individuali, brevi periodi sperimentali, una piccola quantità di stimolazione chimica, ecc. Inoltre, questo studio è applicabile ai topi, che non sono solo economici, ma hanno anche più opzioni per il knockout genico o la preparazione di topi transgenici¹⁶. Descriviamo anche i vari metodi utilizzati per monitorare i progressi dell'ACD nell'esperimento, come la misurazione dello spessore dell'orecchio, l'uso del colorante blu di Evans per misurare l'essudazione infiammatoria, ecc. Questo modello non solo può analizzare orecchie di topo, sangue, milza e altri campioni con mezzi di laboratorio per esplorare la patogenesi dell'ACD, ma è anche applicabile per la valutazione preclinica di nuovi metodi terapeutici, che ha un certo significato promozionale.

Protocollo

Tutte le cure e il trattamento dei topi erano conformi alle linee guida stabilite dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Yangzhou e sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali con la licenza del progetto SYXK (SU) 2022-0044. In questo studio sono stati utilizzati topi maschi e femmine BALB/c di età compresa tra 6 e 8 settimane. Ogni gruppo era composto da sei topi (vedi Tabella dei materiali). Le gabbie sono state collocate in una camera a temperatura controllata (22 ± 2 °C, ciclo luce/buio 12 ore) con libero accesso al cibo e all'acqua. Un diagramma di flusso sperimentale è mostrato nella Figura 1.

1. Preparazione degli animali

1. Iniziare la modellazione dopo 1 settimana di acclimatazione all'ambiente.
2. Utilizzare una lampada a raggi ultravioletti e un disinfettante alcolico al 75% per pulire e disinfettare l'ambiente e i controsoffitti prima di manipolare i topi.
   NOTA: Al fine di evitare l'influenza di fattori esterni, la marcatura dei topi per l'identificazione non può essere eseguita sull'orecchio del mouse; La colorazione sul retro o sulla coda può essere utilizzata come alternativa.
3. Utilizzare un piccolo batuffolo di cotone per applicare acqua saponata all'addome dei topi (circa 1-2 cm² di dimensione). Rasare l'area nella direzione della crescita dei peli con una lama o un rasoio (vedi Tabella dei materiali) all'inizio della modellazione (giorno 0; Figura 2A).
   NOTA: L'uso di una lametta dritta per la depilazione richiede un operatore esperto. Se non eseguita correttamente, potrebbe causare irritazione della pelle. Prendi in considerazione l'uso di crema depilatoria, tosatrici o un rasoio di sicurezza per la depilazione.
4. Pesare il mouse e confrontare le variazioni di peso tra ciascun gruppo.

2. Stimolazione della sensibilizzazione addominale

1. Garantire il pieno recupero di eventuali lesioni minori alla pelle dell'addome indotte dalla rasatura. Applicare la sensibilizzazione addominale 2 giorni dopo la rasatura (giorno 2).
2. Preparare la soluzione di DNFB allo 0,5%: diluire DNFB con una miscela acetone:olio d'oliva in rapporto 4:1 (ad esempio, 400 μL di acetone miscelati con 100 μL di olio d'oliva; vedere Tabella dei materiali). Utilizzare una pistola per pipette per soffiare e miscelare 20 volte per miscelare accuratamente la soluzione DNFB. Prima di ogni somministrazione di soluzione DNFB al mouse, soffiare e mescolare da tre a cinque volte.
   NOTA: preparare la soluzione prima dell'uso e avvolgerla in un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce solare diretta.
3. Applicare 25 μL della soluzione di DNFB allo 0,5% sulla pelle dell'area rasata sull'addome dei topi con un pipettor (Figura 2B).
4. Gocciolare la soluzione di DNFB al centro dell'area di rasatura addominale e distribuire leggermente con il lato liscio della punta del pipettor per disperderla uniformemente.
5. A 30 secondi dopo la stimolazione con DNFB, posizionare i topi in gabbie vuote senza lettiera per evitare che si stampino dalla soluzione di DNFB. Quando la soluzione di DNFB è completamente asciutta (circa 2 minuti), riportare i topi nella loro gabbia originale.
6. Indossare guanti quando si maneggia la soluzione DNFB in quanto è fortemente irritante per la pelle umana.

3. Stimolazione della sensibilizzazione dell'orecchio

1. Preparare una soluzione di DNFB allo 0,2% come sopra, la soluzione del veicolo (una miscela 4: 1 di acetone e olio d'oliva) e acqua pura.
2. Orientare il corpo del topo e posizionare il bordo esterno del padiglione auricolare rivolto verso il basso durante l'intera operazione per evitare che la soluzione entri nel condotto uditivo durante la stimolazione DNFB.
3. Nei giorni 4, 6, 8 e 10, utilizzare un pipettor per applicare 20 μL della soluzione di DNFB allo 0,2% o della soluzione del veicolo lentamente e uniformemente sulla superficie interna dei padiglioni auricolari sinistri dei topi. Per evitare che la soluzione di DNFB entri nel condotto uditivo, utilizzare il lato liscio della punta del pipettor per distribuire delicatamente la soluzione di DNFB durante la somministrazione. Lasciare le orecchie destre non trattate (Figura 2C).
4. Attendere che la soluzione di DNFB sia asciutta e riposizionare i topi nella gabbia (circa 30 s).
5. Indossare guanti quando si maneggia la soluzione DNFB.

4. Registrazione del peso del topo e dei sintomi ACD

1. Pesare il mouse ogni giorno, iniziare il giorno 1 e confrontarlo con il peso corrispondente il giorno 0; valutare l'effetto dell'ACD sul peso corporeo dei topi come variazione di peso (g) ± errore standard della media (SEM).
2. Scatta foto ad alta risoluzione delle orecchie del topo per registrare i sintomi clinici dell'ACD ogni 2 giorni, a partire dal giorno 1.

5. Misurazione dello spessore del padiglione auricolare

1. Misurare lo spessore del padiglione auricolare ogni 2 giorni, a partire dal giorno 1. Misurare e registrare entrambe le orecchie in dettaglio.
2. Utilizzare pinze vernier (vedi Tabella dei materiali) per misurare lo spessore del padiglione auricolare alla stessa ora ogni giorno per risultati accurati (Figura 3A). Impedire alle pinze vernier di continuare il serraggio verso l'interno quando c'è un leggero blocco, per evitare danni ai tessuti all'orecchio del topo. Mantieni fissa la posizione e registra i dati.
3. Raccogliete lo spessore da tre diverse posizioni su ciascun padiglione auricolare (Figura 3B). Registrare la media dei tre dati come valore valido. Valutare il gonfiore dell'orecchio in micrometri (μm) ± errore standard della media (SEM).

6. Valutazione del grado di gonfiore infiammatorio

1. Preparare la soluzione di colorante blu Evans allo 0,5% (vedi tabella dei materiali): diluire il colorante blu di Evans con soluzione salina tamponata fosfato (PBS) il giorno 11. Indossare un camice da laboratorio e guanti in ogni momento, poiché la tintura blu Evans è leggermente tossica per l'uomo.
2. Immobilizzare i topi con un fissatore: aprire il coperchio del fissatore (vedere Tabella dei materiali), tenere la coda del mouse, fare in modo che la testa del topo sia rivolta verso il fissatore e far sì che il topo si arrampichi istintivamente sul fissatore. Coprire il coperchio, far uscire la coda del mouse dal foro sul coperchio e regolare la lunghezza del fissatore per esporre l'intera coda del mouse.
3. Pulire ripetutamente la coda con un batuffolo di cotone alcolico o immergerla in acqua tiepida per 30 secondi e pizzicare delicatamente la radice della coda per riempire ed espandere le vene su entrambi i lati. Eseguire l'iniezione sotto l'irradiazione di una fonte di luce fredda.
4. Iniettare lentamente la soluzione di colorante blu Evans nella vena della coda del topo usando un ago da insulina da 1 mm. Attendere 15 minuti e poi scattare foto delle orecchie del mouse.
   NOTA: Posizionare il mouse sul tavolo e tenerlo delicatamente premuto per esporre la regione dell'orecchio per l'acquisizione dell'immagine. Poco dopo l'iniezione con la soluzione di colorante blu Evans e osservando le indicazioni corrispondenti, utilizzare la dislocazione cervicale per eutanasia del topo.

Risultati

Sotto ripetuta stimolazione DNFB, le orecchie di topo del gruppo DNFB hanno mostrato evidenti sintomi clinici paragonabili all'ACD, con aree sensibili che mostrano i sintomi tipici di arrossamento, secchezza e persino erosione ed essudazione. Tuttavia, la somministrazione auricolare di acqua pura (gruppo di controllo) o di controllo del solvente (gruppo veicolo) non ha prodotto sintomi simili (Figura 4).

Nel frattempo, nel gruppo DNFB, rispetto all'orecchio destro...

Discussione

Il protocollo qui descritto per indurre sintomi simili all'ACD nelle orecchie dei topi può essere utilizzato per studiare la fisiopatologia dell'ACD e come strumento di screening per lo sviluppo di nuovi farmaci.

Ci sono due passaggi chiave per stabilire un modello ACD: sensibilizzazione iniziale e successiva stimolazione. L'addome è di solito il sito di sensibilizzazione iniziale, ma il sito di stimolazione successivo è stato scelto in modo leggermente diverso. Studi precedenti hanno dimos...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB)	Merck	200-734-3	1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene, ≥99%
Acetone	Sinopharm Chemical Reagent Co. LTD	10000418	≥99.5%
Aluminum foil	Cleanwrap	CF-2
Evans blue dye	Solarbio	314-13-6	Dye content approx. 80%
Mouse fixator	ZHUYANBANG	GEGD-SM1830
Olive oil	Solarbio	8001-25-0	500 ml
Pipet tip	Biofount	FT-200	10 - 200 μl
Pipettor	Eppendorf AG	3123000250	20 - 200 μl
Razor blade	Shanghai Gillette Co. LTD	74-S
Vernier calipers	Delixi Electric	DECHOTVCS1200