알레르기성 접촉성 피부염 평가를 위한 마우스 귀 모델

요약

여기에서는 1-플루오로-2,4-디니트로벤젠(DNFB)에 의해 마우스 귀에 알레르기성 접촉성 피부염을 유도하는 방법과 알레르기성 접촉성 피부염의 중증도를 평가하는 방법을 설명합니다.

초록

피부는 인체의 첫 번째 방어선이며 환경 화학 물질에 가장 많이 노출되는 기관 중 하나입니다. 알레르기성 접촉 피부염(ACD)은 국소 발진, 발적 및 피부 병변으로 나타나는 흔한 피부 질환입니다. ACD의 발생과 발달은 유전적 요인과 환경적 요인의 영향을 받습니다. 최근 몇 년 동안 많은 학자들이 일련의 ACD 모델을 구축했지만 이러한 모델의 실험 프로토콜이 모두 다르기 때문에 독자가 잘 확립하기가 어렵습니다. 따라서 안정적이고 효율적인 동물모델은 아토피성 피부염의 발병기전을 더 연구하는데 큰 의미가 있다. 이 연구에서는 1-플루오로-2,4-디니트로벤젠(DNFB)을 사용하여 생쥐의 귀에 ACD 유사 증상을 유도하는 모델링 방법을 자세히 설명하고 모델링 중 피부염의 중증도를 평가하는 몇 가지 방법을 설명합니다. 이 실험 프로토콜은 일부 실험에 성공적으로 적용되었으며 ACD 연구 분야에서 특정 판촉 역할을 합니다.

서문

알레르기성 접촉성 피부염(ACD)은 접촉 부위의 습진과 유사한 증상, 중등도의 경우 부종 및 홍반, 심한 경우 구진, 미란, 삼출 또는 다량의 흉터를 특징으로 하는 흔한 피부 질환입니다¹. 인구의 최대 20%에 영향을 미치며 모든 연령대의 사람들에게 영향을 미칠 수 있습니다². ACD는 알레르겐에 반복적으로 노출된 사람에게서 자주 발생하며, 가정이나 직장에서 하나 이상의 알레르겐에 대한 개인의 면역 반응으로 인해 발생할 수 있다³. IV형 지연성 과민증은 ACD⁴에서 주요 유형의 면역 반응으로 간주됩니다. 알레르겐에 반복적으로 노출된 피부 부위에서는 순환 기억 T 세포가 다량으로 축적되어 면역 및 염증 반응을 유도한다 ^3,5,6. 이 연구의 목적은 ACD 발병에서 면역학적 및 염증 반응에 대한 추가 조사를 위한 신뢰할 수 있는 실험실 기술을 제안하는 것입니다.

ACD의 발병은 일반적으로 화학 물질에 반복적으로 노출되어 발생하는 접촉 과민증으로 인한 것입니다. 많은 연구자들이 질병의 발병을 시뮬레이션하기 위해 지난 수십 년 동안 집 쥐 ^7,8, 기니피그 ^9,10 및 기타 동물에서 다양한 ACD 동물 모델을 개발했습니다. 대부분의 실험 방법은 복부 감작 (유도)과 등 또는 귓불에 자극 제공 (자극)의 두 단계로 구성됩니다. 일반적으로 사용되는 화학 물질은 주로 1-플루오로-2,4-디니트로벤젠(DNFB)/1-클로로-2,4-디니트로벤젠(DNCB)8,9,11, 옥사졸론^12, 우루시올 ¹³ 등을 포함합니다. 그 중 DNFB와 DNCB가 가장 널리 사용되며 1958년 10월¹⁰일에 처음 보고되었습니다. 니켈 감작 모델(¹⁴)과 광알레르기성 접촉 피부염 모델⁽¹⁵)도 자주 사용된다.

ACD 모델을 구축하기 위한 실험적 방법을 제시한다. 이 방법은 이전 연구 및 여러 실험과의 비교를 기반으로 요약되고 최적화됩니다. 다른 ACD 모델과 비교할 때 이 모델은 작은 개인차, 짧은 실험 기간, 소량의 화학적 자극 등과 같은 몇 가지 장점이 있습니다. 또한, 이 연구는 경제적일 뿐만 아니라 유전자 녹아웃 또는 형질전환 마우스 준비에 대한 더 많은 옵션을 가지고 있는 마우스에 적용할 수 있다¹⁶. 또한 귀 두께 측정, 염증 삼출물 측정을 위한 Evans blue 염료 사용 등과 같이 실험에서 ACD 진행을 모니터링하는 데 사용되는 다양한 방법을 설명합니다. 이 모델은 ACD의 발병기전을 탐색하기 위해 실험실 수단으로 마우스 귀, 혈액, 비장 및 기타 샘플을 분석할 수 있을 뿐만 아니라 특정 판촉 의미가 있는 새로운 치료 방법의 전임상 평가에도 적용할 수 있습니다.

프로토콜

생쥐의 모든 관리 및 치료는 Yangzhou University의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 수립한 지침에 따라 이루어졌으며 프로젝트 라이선스 SYXK(SU)2022-0044에 따라 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 이 연구에는 6-8주령의 BALB/c 수컷 및 암컷 마우스가 사용되었습니다. 각 그룹은 6마리의 마우스로 구성되었습니다( 재료 표 참조). 케이지는 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있는 온도 조절 챔버(22 ± 2 °C, 12시간 명암 주기)에 배치되었습니다. 실험 흐름도는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 동물 준비

1. 환경에 순응 한 지 1 주일 후에 모델링을 시작하십시오.
2. 마우스를 조작하기 전에 자외선 램프와 75% 알코올 소독제를 사용하여 환경과 조리대를 청소하고 소독하십시오.
   알림: 외부 요인의 영향을 피하기 위해 마우스 귀에 식별을 위해 마우스를 표시할 수 없습니다. 뒷면이나 꼬리 부분의 얼룩을 대안으로 사용할 수 있습니다.
3. 작은 면봉을 사용하여 생쥐의 복부에 비눗물을 바릅니다 (약 1-2cm² 크기). 모델링 시작(0일)에 면도날이나 면도기( 재료 표 참조)로 모발이 자라는 방향으로 해당 부위를 면도합니다. 그림 2A).
   알림: 제모를 위해 직선 면도날을 사용하려면 숙련된 작업자가 필요합니다. 올바르게 수행하지 않으면 피부에 자극을 줄 수 있습니다. 제모를 위해 제모 크림, 클리퍼 또는 안전 면도기를 사용하는 것이 좋습니다.
4. 마우스의 체중을 측정하고 각 그룹 간의 체중 변화를 비교합니다.

2. 복부 감작 자극

1. 면도로 인한 복부 피부의 경미한 손상이 완전히 회복되도록 하십시오. 면도 후 2 일 (2 일째)에 복부 감작을 적용하십시오.
2. 0.5% DNFB 용액 준비: DNFB를 아세톤:올리브 오일 혼합물로 4:1 비율로 희석합니다(예: 400μL의 아세톤과 100μL의 올리브 오일을 혼합, 표 참조). 피펫 건을 사용하여 불고 20회 혼합하여 DNFB 용액을 완전히 혼합합니다. DNFB 용액을 마우스에 투여하기 전에 3-5회 불어서 혼합한다.
   알림: 사용하기 전에 용액을 준비하고 알루미늄 호일로 싸서 직사광선으로부터 보호하십시오.
3. 25μL의 0.5% DNFB 용액을 피펫터를 사용하여 생쥐 복부의 면도한 부위의 피부에 도포합니다(그림 2B).
4. 복부 면도 부위 중앙에 DNFB 용액을 드리블하고 피펫 팁의 매끄러운 면으로 가볍게 펴서 균일하게 분산시킵니다.
5. DNFB 자극 후 30초에 마우스를 침구가 없는 빈 케이지에 넣어 DNFB 용액을 문지르지 않도록 합니다. DNFB 용액이 완전히 건조되면(약 2분) 마우스를 원래 케이지로 되돌립니다.
6. DNFB 용액은 사람의 피부를 강하게 자극하므로 취급 시 장갑을 착용하십시오.

3. 귀 감작 자극

1. 위와 같이 0.2% DNFB 용액, 비히클 용액(아세톤과 올리브 오일의 4:1 혼합물) 및 순수한 물을 준비합니다.
2. DNFB 자극 중에 용액이 외이도로 들어가는 것을 방지하기 위해 전체 수술 동안 마우스 몸체의 방향을 향하고 귓바퀴의 바깥쪽 경계가 아래를 향하도록 합니다.
3. 4일, 6일, 8일 및 10일에 피펫터를 사용하여 0.2% DNFB 용액 또는 비히클 용액 20μL를 마우스의 왼쪽 귓바퀴 내부 표면에 천천히 균일하게 도포합니다. DNFB 용액이 외이도로 들어가는 것을 방지하려면 피펫 팁의 매끄러운 면을 사용하여 투여 중에 DNFB 용액을 부드럽게 분배하십시오. 오른쪽 귀를 치료하지 않고 그대로 두십시오 (그림 2C).
4. DNFB 용액이 마를 때까지 기다렸다가 마우스를 케이지에 다시 넣습니다 (약 30 초).
5. DNFB 용액을 취급할 때는 장갑을 착용하십시오.

4. 마우스 체중 및 ACD 증상 기록

1. 매일 마우스의 무게를 측정하고 1일째부터 시작하여 0일째의 해당 체중과 비교합니다. 마우스의 체중에 대한 ACD의 효과를 체중 변화(g) ± 평균의 표준 오차(SEM)로 평가하였다.
2. 마우스 귀의 고해상도 사진을 찍어 1일째부터 2일마다 ACD 임상 증상을 기록합니다.

5. 귓바퀴 두께 측정

1. 1일째부터 2일마다 귓바퀴 두께를 측정합니다. 양쪽 귀를 자세히 측정하고 기록합니다.
2. 버니어 캘리퍼스( 재료 표 참조)를 사용하여 정확한 결과를 위해 매일 같은 시간에 귓바퀴 두께를 측정합니다(그림 3A). 버니어 캘리퍼스가 안쪽으로 계속 고정되는 것을 막으십시오.amp마우스 귀의 조직 손상을 방지하기 위해 약간의 막힘이 있을 때. 위치를 고정하고 데이터를 기록합니다.
3. 각 귓바퀴의 세 가지 다른 위치에서 두께를 수집합니다(그림 3B). 세 데이터의 평균을 유효한 값으로 기록합니다. 평균의 표준 오차(SEM)± 마이크로미터(μm) 단위로 귀 부종을 평가합니다.

6. 염증성 부종 정도 평가

1. 0.5% 에반스 블루 염료( 재료 표 참조) 용액 준비: 11일째에 에반스 블루 염료를 인산염 완충 식염수(PBS)로 희석합니다. 에반스 블루 염료는 인간에게 약간 독성이 있으므로 항상 실험복과 장갑을 착용하십시오.
2. 고정 장치로 마우스를 고정하십시오 : 고정 장치의 뚜껑을 열고 ( 재료 표 참조) 마우스 꼬리를 잡고 마우스 머리가 고정 장치를 향하게하고 마우스가 본능적으로 고정 장치에 올라 가게합니다. 뚜껑을 덮고 뚜껑의 구멍에서 마우스 꼬리가 나오도록 하고 고정 장치의 길이를 조정하여 마우스 꼬리 전체가 노출되도록 합니다.
3. 알코올 면봉으로 꼬리를 반복해서 닦거나 따뜻한 물에 30 초 동안 담가 두었다가 꼬리의 뿌리를 부드럽게 꼬집어 양쪽의 정맥을 채우고 확장하십시오. 차가운 광원을 조사하여 주입하십시오.
4. 1mm 인슐린 바늘을 사용하여 Evans blue 염료 용액을 마우스 꼬리 정맥에 천천히 주입합니다. 15분 동안 기다린 다음 마우스 귀 사진을 찍습니다.
   알림: 마우스를 테이블 위에 놓고 부드럽게 잡고 이미지 획득을 위해 귀 영역이 노출되도록 합니다. Evans blue 염료 용액을 주사하고 해당 적응증을 관찰한 직후 자궁경부 탈구를 사용하여 마우스를 안락사시킵니다.

결과

반복적인 DNFB 자극 하에서 DNFB 그룹의 마우스 귀는 ACD에 필적하는 명백한 임상 증상을 보였으며 민감한 부위는 발적, 건조, 심지어 미란 및 삼출의 전형적인 증상을 보였습니다. 그러나 순수(대조군) 또는 용매 대조군(비히클 그룹)의 귀 투여는 유사한 증상을 나타내지 않았습니다(그림 4).

한편, DNFB 그룹에서는 치료되지 않은 오른쪽 귀에 비해 DNFB 자극 ?...

토론

마우스의 귀에서 ACD 유사 증상을 유도하기 위해 여기에 설명된 프로토콜은 ACD의 병태생리학을 연구하고 신약 개발을 위한 스크리닝 도구로 사용할 수 있습니다.

ACD 모델을 확립하는 데는 초기 감작과 후속 자극의 두 가지 주요 단계가 있습니다. 복부는 일반적으로 초기 감작 부위이지만 후속 자극 부위는 약간 다르게 선택되었습니다. 이전 연구에 따르면 대부분의 학자들은 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB)	Merck	200-734-3	1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene, ≥99%
Acetone	Sinopharm Chemical Reagent Co. LTD	10000418	≥99.5%
Aluminum foil	Cleanwrap	CF-2
Evans blue dye	Solarbio	314-13-6	Dye content approx. 80%
Mouse fixator	ZHUYANBANG	GEGD-SM1830
Olive oil	Solarbio	8001-25-0	500 ml
Pipet tip	Biofount	FT-200	10 - 200 μl
Pipettor	Eppendorf AG	3123000250	20 - 200 μl
Razor blade	Shanghai Gillette Co. LTD	74-S
Vernier calipers	Delixi Electric	DECHOTVCS1200