تحليل قطرات الدهون الملطخة بالفلورسنت مع إعادة بناء 3D لتقييم التنكس الدهني الكبدي

Summary

هنا ، نعرض بروتوكولا محسنا قائما على مضان BODIPY 493/503 لتوصيف قطرات الدهون في أنسجة الكبد. من خلال استخدام الإسقاطات المتعامدة وإعادة البناء 3D ، يسمح الفلوروفور بالتمييز الناجح بين التنكس الدهني الحويصلي الدقيق والكبير وقد يمثل نهجا تكميليا للبروتوكولات النسيجية الكلاسيكية لتقييم التنكس الدهني الكبدي.

Abstract

قطرات الدهون (LDs) هي عضيات متخصصة تتوسط في تخزين الدهون وتلعب دورا مهما للغاية في قمع السمية الدهنية ومنع الخلل الوظيفي الناجم عن الأحماض الدهنية الحرة (FAs). الكبد ، نظرا لدوره الحاسم في استقلاب الدهون في الجسم ، مهدد باستمرار من خلال تراكم LDs داخل الخلايا في شكل تنكس دهني كبدي حويصلي وكبير. يعتمد التوصيف النسيجي ل LDs عادة على أصباغ ديازو القابلة للذوبان في الدهون ، مثل تلطيخ Oil Red O (ORO) ، ولكن هناك عددا من العيوب التي تعيق باستمرار استخدام هذا التحليل مع عينات الكبد. في الآونة الأخيرة ، أصبحت الفلوروفورات المحبة للدهون 493/503 شائعة لتصور وتحديد موقع LDs بسبب امتصاصها السريع وتراكمها في قلب قطرات الدهون المحايدة. على الرغم من أن معظم التطبيقات موصوفة جيدا في مزارع الخلايا ، إلا أن هناك أدلة أقل تثبت الاستخدام الموثوق لتحقيقات الفلوروفور المحبة للدهون كأداة تصوير LD في عينات الأنسجة. هنا ، نقترح بروتوكولا محسنا قائما على ثنائي بيروميثين البورون (BODIPY) 493/503 لتقييم LDs في عينات الكبد من نموذج حيواني لنظام غذائي عالي الدهون (HFD) الناجم عن تنكس دهني كبدي. يغطي هذا البروتوكول تحضير عينات الكبد ، وتقسيم الأنسجة ، وتلطيخ BODIPY 493/503 ، والحصول على الصور ، وتحليل البيانات. لقد أظهرنا زيادة في عدد وشدة ونسبة المساحة وقطر LDs الكبدية عند تغذية HFD. باستخدام الإسقاطات المتعامدة وإعادة البناء 3D ، كان من الممكن مراقبة المحتوى الكامل للدهون المحايدة في قلب LD ، والتي ظهرت على شكل قطرات كروية تقريبا. علاوة على ذلك ، مع الفلوروفور BODIPY 493/503 ، تمكنا من التمييز بين الحويصلات الدقيقة (1 ميكرومتر < د ≤ 3 ميكرومتر) ، والحويصلات الوسيطة (3 ميكرومتر < د ≤ 9 ميكرومتر) ، والحويصلات الكبيرة (د > 9 ميكرومتر) ، مما يسمح بالتمييز الناجح للتنكس الدهني الحويصلي الدقيق والكبير . بشكل عام ، يعد هذا البروتوكول القائم على مضان BODIPY 493/503 أداة موثوقة وبسيطة لتوصيف LD الكبدي وقد يمثل نهجا تكميليا للبروتوكولات النسيجية الكلاسيكية.

Introduction

قطرات الدهون (LDs) ، التي ينظر إليها تقليديا على أنها مستودعات للطاقة ، هي عضيات خلوية متخصصة تتوسط في تخزين الدهون ، وهي تتألف من نواة دهنية محايدة كارهة للماء ، والتي تحتوي بشكل أساسي على استرات الكوليسترول والدهون الثلاثية (TGs) ، مغلفة بطبقة أحادية فوسفوليبيد¹،^2،3.

يحدث التكوين الحيوي LD في الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، بدءا من تخليق ثلاثي الجلسرين (TAG) واسترات الستيرول. تنتشر الدهون المحايدة بين وريقات الطبقة المزدوجة ER بتركيزات منخفضة ولكنها تتجمع في عدسات زيتية تنمو وتنبت في قطرات كروية تقريبا من غشاء ER عندما يزيد تركيزها داخل الخلايا

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية التي أجريت في هذه الدراسة من قبل هيئة رعاية الحيوان التابعة لمعهد كويمبرا للبحوث السريرية والطبية الحيوية (iCBR) (ORBEA ، # 9/2018) وامتثلت للتوجيهات الوطنية والأوروبية لرعاية الحيوان ومع إرشادات ARRIVE.

1. التصميم التجريبي

1. ذكور فئران Wistar البالغة من العمر 13 أسبوعا في أقفاص جيدة التهوية في ظل ظروف بيئية خاضعة للرقابة لدرجة الحرارة (22 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية) والرطوبة (50٪ -60٪) والضوء (12 ساعة دورة الضوء والظلام ) ومع الوصول إلى مياه الصنبور وتشاو القوارض القياسية.
2. بعد فترة 2 أسبوع من التأقلم ، تعيين الفئران بشكل تعسفي إلى مجموعتين.
3. قم بت....

النتائج

يجب أن يؤدي التنفيذ الناجح لهذه التقنية إلى تلطيخ واضح لقطرات الدهون للتوصيف المتزامن لمورفولوجيا LD (الشكل وكثافة لب الدهون بناء على إعادة البناء ثلاثية الأبعاد) جنبا إلى جنب مع توزيعها المكاني ، والعدد لكل مساحة إجمالية ، ومتوسط الحجم (تم تقييمه باستخدام خط الأنابيب الموصوف أعلاه ،

Discussion

يهدف هذا البروتوكول القائم على مضان BODIPY 493/503 لتقييم LD إلى تطوير نهج تصوير جديد لتقييم التنكس الدهني الكبدي. نظرا للعلاقة القوية بين السمنة وأمراض الكبد الدهنية ، تم استخدام النظام الغذائي عالي الدهون على النمط الغربي لإنشاء نموذج حيواني للتنكس الدهني الكبدي²⁶. تم تأكيد زيادة ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set	Fisher Scientific
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	D3922
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR	D1306
70% ethanol	Honeywell	10191455
Adobe Illustrator CC	Adobe Inc.	Used to design the figures
Automatic analyzer Hitachi 717	Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany	8177-30-0010
Barrier pen (Liquid blocker super pap pen)	Daido Sangyo Co., Ltd, Japon	_
Blade	Leica	221052145	Used in the cryostat
Cell Profiler version 4.2.5	https://cellprofiler.org/releases/	Used to analyse the acquired images
Coverslips	Menzel-Glaser, Germany	_
Cryomolds	Tissue-Tek	_
Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S	Leica Biosystems	_
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	D-8418	Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Dry ice container (styrofoam cooler)	Novolab	A26742
Dumont forceps	Fine Science Tools, Germany	11295-10
Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm)	Thermo Scientific	150318	Used to weigh the liver after dissection
Glycergel	DAKO Omnis	S303023
GraphPad Prism software, version 9.3.1	GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA
High-fat diet	Envigo, Barcelona, Spain	MD.08811
Ketamine (Nimatek  100 mg/mL)	Dechra	791/01/14DFVPT	Used at a final concentration of 75 mg/kg
Laser scanning confocal microscope  (QUASAR detection unit; )	Carl Zeiss, germany	LSM 710 Axio Observer Z1 microscope
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL)	Dechra	1838 ESP / 020/01/07RFVPT	Used at a final concentration of 1 mg/kg
Needle	BD microlance	300635
No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade	Swann-Morton	205
Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)	Carl Zeiss, Germany
Paint brushes	Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X	Used to handle cryosections
Peristaltic pump (Minipuls 3)	Gilson	1004170
Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	P3813
Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3	Swann-Morton	0208
Slide staining system StainTray	Simport Scientific	M920
Standard diet	Mucedola	4RF21
Superfrost Plus microscope slides	Menzel-Glaser, Germany	J1800AMNZ
Tissue-Tek OCT mounting media	VWR CHEMICALS	361603E
Triglycerides colorimetric assay kit	Cayman Chemical	10010303
Ultrasonic bath	Bandelin Sonorex	TK 52
Vannas spring scissors - 3 mm cutting edge	Fine Science Tools, Germany	15000-00
ZEN Black software	Zeiss