Análisis de gotitas de lípidos teñidas con fluorescencia con reconstrucción 3D para la evaluación de la esteatosis hepática

Resumen

En este documento, demostramos un protocolo optimizado basado en fluorescencia BODIPY 493/503 para la caracterización de gotas de lípidos en el tejido hepático. Mediante el uso de proyecciones ortogonales y reconstrucciones 3D, el fluoróforo permite una discriminación exitosa entre esteatosis microvesicular y macrovesicular y puede representar un enfoque complementario a los protocolos histológicos clásicos para la evaluación de esteatosis hepática.

Resumen

Las gotitas de lípidos (LD) son orgánulos especializados que median el almacenamiento de lípidos y desempeñan un papel muy importante en la supresión de la lipotoxicidad y la prevención de la disfunción causada por los ácidos grasos libres (FA). El hígado, dado su papel crítico en el metabolismo de las grasas del cuerpo, está persistentemente amenazado por la acumulación intracelular de LD en forma de esteatosis hepática microvesicular y macrovesicular. La caracterización histológica de los LD se basa típicamente en colorantes diazo solubles en lípidos, como la tinción Oil Red O (ORO), pero una serie de desventajas dificultan consistentemente el uso de este análisis con muestras de hígado. Más recientemente, los fluoróforos lipofílicos 493/503 se han vuelto populares para visualizar y localizar LD debido a su rápida absorción y acumulación en el núcleo de gotas de lípidos neutros. Aunque la mayoría de las aplicaciones están bien descritas en cultivos celulares, hay menos evidencia que demuestre el uso confiable de sondas de fluoróforos lipofílicos como una herramienta de imagen LD en muestras de tejido. En este documento, proponemos un protocolo optimizado basado en diprometeno de boro (BODIPY) 493/503 para la evaluación de LD en muestras de hígado de un modelo animal de esteatosis hepática inducida por dieta alta en grasas (HFD). Este protocolo cubre la preparación de muestras de hígado, la sección de tejidos, la tinción BODIPY 493/503, la adquisición de imágenes y el análisis de datos. Demostramos un aumento del número, la intensidad, la relación de área y el diámetro de LD hepáticas al alimentarse con HFD. Usando proyecciones ortogonales y reconstrucciones 3D, fue posible observar el contenido completo de lípidos neutros en el núcleo LD, que aparecieron como gotitas casi esféricas. Además, con el fluoróforo BODIPY 493/503, pudimos distinguir microvesículas (1 μm < d ≤ 3 μm), vesículas intermedias (3 μm < d ≤ 9 μm) y macrovesículas (d > 9 μm), permitiendo la discriminación exitosa de esteatosis microvesicular y macrovesicular. En general, este protocolo basado en fluorescencia BODIPY 493/503 es una herramienta fiable y sencilla para la caracterización hepática de LD y puede representar un enfoque complementario a los protocolos histológicos clásicos.

Introducción

Las gotas de lípidos (LD), clásicamente vistas como depósitos de energía, son orgánulos celulares especializados que median el almacenamiento de lípidos, y comprenden un núcleo lipídico neutro hidrófobo, que contiene principalmente ésteres de colesterol y triglicéridos (TG), encapsulados por una monocapa de fosfolípidos ^1,2,3.

La biogénesis de LD ocurre en el retículo endoplásmico (RE), comenzando con la síntesis de triacilglicerol (TAG) y ésteres de esteroles. Los lípidos neutros se difunden entre las valvas de la bicapa ER a bajas concentraciones....

Protocolo

Todos los procedimientos con animales realizados en este estudio fueron aprobados por el Instituto Coimbra de Investigación Clínica y Biomédica (iCBR) Organismo de Bienestar Animal (ORBEA, # 9 / 2018) y cumplieron con las Directivas Nacionales y Europeas de Cuidado de Animales y con las directrices ARRIVE.

1. Diseño experimental

1. Parejas de ratas Wistar macho de 13 semanas de edad en jaulas ventiladas en condiciones ambientales controladas de temperatura (22 °C ± 1 °C), humedad (50%-60%) y luz (ciclo luz-oscuridad de 12 h) y con acceso ad libitum al agua del grifo y comida estándar para roedores.

Discusión

Este protocolo basado en fluorescencia BODIPY 493/503 para la evaluación de LD tuvo como objetivo desarrollar un nuevo enfoque de imagen para la evaluación de la esteatosis hepática. Dada la fuerte correlación entre la obesidad y la enfermedad del hígado graso, se utilizó la dieta alta en grasas al estilo occidental para establecer un modelo animal de esteatosis hepática²⁶. Un aumento robusto en el contenido de TG hepática fue confirmado por un kit de ensayo colorimétrico cuantitativo de .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set	Fisher Scientific
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	D3922
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR	D1306
70% ethanol	Honeywell	10191455
Adobe Illustrator CC	Adobe Inc.	Used to design the figures
Automatic analyzer Hitachi 717	Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany	8177-30-0010
Barrier pen (Liquid blocker super pap pen)	Daido Sangyo Co., Ltd, Japon	_
Blade	Leica	221052145	Used in the cryostat
Cell Profiler version 4.2.5	https://cellprofiler.org/releases/	Used to analyse the acquired images
Coverslips	Menzel-Glaser, Germany	_
Cryomolds	Tissue-Tek	_
Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S	Leica Biosystems	_
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	D-8418	Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Dry ice container (styrofoam cooler)	Novolab	A26742
Dumont forceps	Fine Science Tools, Germany	11295-10
Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm)	Thermo Scientific	150318	Used to weigh the liver after dissection
Glycergel	DAKO Omnis	S303023
GraphPad Prism software, version 9.3.1	GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA
High-fat diet	Envigo, Barcelona, Spain	MD.08811
Ketamine (Nimatek  100 mg/mL)	Dechra	791/01/14DFVPT	Used at a final concentration of 75 mg/kg
Laser scanning confocal microscope  (QUASAR detection unit; )	Carl Zeiss, germany	LSM 710 Axio Observer Z1 microscope
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL)	Dechra	1838 ESP / 020/01/07RFVPT	Used at a final concentration of 1 mg/kg
Needle	BD microlance	300635
No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade	Swann-Morton	205
Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)	Carl Zeiss, Germany
Paint brushes	Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X	Used to handle cryosections
Peristaltic pump (Minipuls 3)	Gilson	1004170
Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	P3813
Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3	Swann-Morton	0208
Slide staining system StainTray	Simport Scientific	M920
Standard diet	Mucedola	4RF21
Superfrost Plus microscope slides	Menzel-Glaser, Germany	J1800AMNZ
Tissue-Tek OCT mounting media	VWR CHEMICALS	361603E
Triglycerides colorimetric assay kit	Cayman Chemical	10010303
Ultrasonic bath	Bandelin Sonorex	TK 52
Vannas spring scissors - 3 mm cutting edge	Fine Science Tools, Germany	15000-00
ZEN Black software	Zeiss