荧光染色脂滴分析与3D重建，用于肝脂肪变性评估

摘要

在本文中，我们展示了一种优化的基于BODIPY 493 / 503荧光的方案，用于肝组织中的脂滴表征。通过使用正交投影和3D重建，荧光团可以成功区分微泡和大泡脂肪变性，并且可能代表用于肝脂肪变性评估的经典组织学方案的补充方法。

摘要

脂滴（LDs）是介导脂质储存的特化细胞器，在抑制脂毒性和预防游离脂肪酸（FAs）引起的功能障碍方面起着非常重要的作用。鉴于肝脏在人体脂肪代谢中的关键作用，肝脏一直受到微泡和大泡肝脂肪变性形式的LDs细胞内积累的威胁。LD的组织学表征通常基于脂溶性重氮染料，例如油红O（ORO）染色，但许多缺点一直阻碍了该分析在肝脏标本中的使用。最近，亲脂性荧光团 493/503 因其快速吸收和积累到中性脂滴核心中而变得流行用于可视化和定位 LD。尽管大多数应用在细胞培养中都有很好的描述，但很少有证据表明亲脂性荧光团探针在组织样品中可靠地用作LD成像工具。在本文中，我们提出了一种优化的基于硼二吡咯甲烷（BODIPY）493/503的方案，用于评估来自高脂肪饮食（HFD）诱导的肝脂肪变性动物模型的肝脏标本中的LD。该协议涵盖肝脏样本制备、组织切片、BODIPY 493/503 染色、图像采集和数据分析。我们证明了HFD喂养时肝LD的数量，强度，面积比和直径增加。使用正交投影和3D重建，可以观察到LD核心中性脂质的全部含量，这些脂质显示为近球形液滴。此外，使用荧光团BODIPY 493/503，我们能够区分微囊泡（1μm9μm），从而成功区分微泡和大泡脂肪变性。总体而言，该基于荧光的BODIPY 493/503方案是肝LD表征的可靠且简单的工具，可能是经典组织学方案的补充方法。

引言

脂滴（LDs），通常被视为能量库，是介导脂质储存的特化细胞器，它们包括疏水性中性脂质核心，主要含有胆固醇酯和甘油三酯（TG），由磷脂单层^封装1，^2，3。

LD生物发生发生在内质网（ER）中，从三酰基甘油（TAG）和甾醇酯的合成开始。中性脂质以低浓度在ER双层的小叶之间扩散，但聚结成油状体，当其细胞内^{浓度增加时}，油状体从ER膜生长并芽成近球形液滴4。随后，来自ER双层和细胞质的蛋白质，特别是脂周（PLIN）蛋白家族，易位到LD的表面以促进出芽⁵，⁶，⁷，^8，9。

通过新的脂肪酸合成和LD融合或聚结，LD长成不同的大小。因此，不同细胞类型中LD的大小和数量差异很大。小液滴（直径300-800nm），被称为初始LD（iLDs），几乎可以由所有细胞形成

研究方案

本研究中执行的所有动物程序均已获得科英布拉临床和生物医学研究所（iCBR）动物福利机构（ORBEA，#9 / 2018）的批准，并符合动物护理国家和欧洲指令以及ARRIVE指南。

1. 实验设计

1. 在温度（22°C±1°C），湿度（50%-60%）和光照（12小时明暗循环）的受控环境条件下，在通风笼中配对13周龄雄性Wistar大鼠，并 随意 获得自来水和标准啮齿动物食物。
2. 在适应2周后，将大鼠任意分为两组。
3. 分别用标准食物和高脂肪饮食（45% kcal/脂肪）喂养对照组（CTRL，n = 6）和高脂肪饮食组（HFD，n = 6），持续 24 周。
4. 每周监测体重（BW）。记录每个笼子每天的食物和饮料消耗量。

2. 肝脏样本制备

1. 肝脏清扫
   1. 准备蠕动泵：通过管路运行70%乙醇，将27 G针头连接到管子的出口端，并用冰冷（4°C）1x磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH ~7.4）灌注管子（例如，在蠕动泵上200 rpm，内径为1.6毫米硅管，IV迷你滴注组）。调整体重（例如，对于100-150g大鼠，使用约10-12mL / min的流速）。
   2. 使用麻醉方案通过腹膜内注射麻醉大鼠（氯胺酮的终浓度= 75mg....

讨论

这种基于荧光的 BODIPY 493/503 LD 评估方案旨在开发一种用于评估肝脂肪变性的新型成像方法。鉴于肥胖与脂肪肝之间的强相关性，采用西式高脂肪饮食建立肝脂肪变性动物模型²⁶。定量甘油三酯比色测定试剂盒证实了肝TG含量的强劲增加，这表明HFD喂养的动物的肝脏脂质沉积情况增加。随后，在低放大倍率下，用荧光探针BODIPY 493/503观察LD积累的程度。正如预期的那样，BODIPY 493/503 ?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set	Fisher Scientific
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	D3922
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR	D1306
70% ethanol	Honeywell	10191455
Adobe Illustrator CC	Adobe Inc.	Used to design the figures
Automatic analyzer Hitachi 717	Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany	8177-30-0010
Barrier pen (Liquid blocker super pap pen)	Daido Sangyo Co., Ltd, Japon	_
Blade	Leica	221052145	Used in the cryostat
Cell Profiler version 4.2.5	https://cellprofiler.org/releases/	Used to analyse the acquired images
Coverslips	Menzel-Glaser, Germany	_
Cryomolds	Tissue-Tek	_
Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S	Leica Biosystems	_
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	D-8418	Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Dry ice container (styrofoam cooler)	Novolab	A26742
Dumont forceps	Fine Science Tools, Germany	11295-10
Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm)	Thermo Scientific	150318	Used to weigh the liver after dissection
Glycergel	DAKO Omnis	S303023
GraphPad Prism software, version 9.3.1	GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA
High-fat diet	Envigo, Barcelona, Spain	MD.08811
Ketamine (Nimatek  100 mg/mL)	Dechra	791/01/14DFVPT	Used at a final concentration of 75 mg/kg
Laser scanning confocal microscope  (QUASAR detection unit; )	Carl Zeiss, germany	LSM 710 Axio Observer Z1 microscope
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL)	Dechra	1838 ESP / 020/01/07RFVPT	Used at a final concentration of 1 mg/kg
Needle	BD microlance	300635
No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade	Swann-Morton	205
Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)	Carl Zeiss, Germany
Paint brushes	Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X	Used to handle cryosections
Peristaltic pump (Minipuls 3)	Gilson	1004170
Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	P3813
Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3	Swann-Morton	0208
Slide staining system StainTray	Simport Scientific	M920
Standard diet	Mucedola	4RF21
Superfrost Plus microscope slides	Menzel-Glaser, Germany	J1800AMNZ
Tissue-Tek OCT mounting media	VWR CHEMICALS	361603E
Triglycerides colorimetric assay kit	Cayman Chemical	10010303
Ultrasonic bath	Bandelin Sonorex	TK 52
Vannas spring scissors - 3 mm cutting edge	Fine Science Tools, Germany	15000-00
ZEN Black software	Zeiss