Analyse de gouttelettes lipidiques colorées par fluorescence avec reconstruction 3D pour l’évaluation de la stéatose hépatique

Résumé

Ici, nous démontrons un protocole optimisé basé sur la fluorescence BODIPY 493/503 pour la caractérisation des gouttelettes lipidiques dans le tissu hépatique. Grâce à l’utilisation de projections orthogonales et de reconstructions 3D, le fluorophore permet une discrimination réussie entre la stéatose microvésiculeuse et macrovésiculeuse et peut représenter une approche complémentaire aux protocoles histologiques classiques pour l’évaluation de la stéatose hépatique.

Résumé

Les gouttelettes lipidiques (LD) sont des organites spécialisés qui interviennent dans le stockage des lipides et jouent un rôle très important dans la suppression de la lipotoxicité et la prévention du dysfonctionnement causé par les acides gras libres (AG). Le foie, compte tenu de son rôle essentiel dans le métabolisme des graisses du corps, est constamment menacé par l’accumulation intracellulaire de LD sous forme de stéatose hépatique microvésiculaire et macrovésiculaire. La caractérisation histologique des LD est généralement basée sur des colorants diazoélectriques liposolubles, tels que la coloration Oil Red O (ORO), mais un certain nombre d’inconvénients entravent systématiquement l’utilisation de cette analyse avec des échantillons de foie. Plus récemment, les fluorophores lipophiles 493/503 sont devenus populaires pour visualiser et localiser les LD en raison de leur absorption et de leur accumulation rapides dans le noyau de gouttelettes lipidiques neutres. Même si la plupart des applications sont bien décrites dans les cultures cellulaires, il y a moins de preuves démontrant l’utilisation fiable des sondes fluorophores lipophiles comme outil d’imagerie LD dans les échantillons de tissus. Nous proposons ici un protocole optimisé basé sur le dipyrrométène de bore (BODIPY) 493/503 pour l’évaluation des LD dans des échantillons de foie à partir d’un modèle animal de stéatose hépatique induite par un régime riche en graisses (HFD). Ce protocole couvre la préparation des échantillons de foie, la section des tissus, la coloration BODIPY 493/503, l’acquisition d’images et l’analyse des données. Nous démontrons une augmentation du nombre, de l’intensité, du rapport de surface et du diamètre des LD hépatiques lors de l’alimentation HFD. En utilisant des projections orthogonales et des reconstructions 3D, il a été possible d’observer la teneur complète en lipides neutres dans le noyau LD, qui apparaissait comme des gouttelettes presque sphériques. De plus, avec le fluorophore BODIPY 493/503, nous avons pu distinguer des microvésicules (1 μm < j ≤ 3 μm), des vésicules intermédiaires (3 μm < d ≤ 9 μm) et des macrovésicules (d > 9 μm), permettant la discrimination réussie de la stéatose microvésiculaire et macrovésiculaire. Dans l’ensemble, ce protocole basé sur la fluorescence BODIPY 493/503 est un outil fiable et simple pour la caractérisation hépatique de la LD et peut représenter une approche complémentaire aux protocoles histologiques classiques.

Introduction

Les gouttelettes lipidiques (LD), classiquement considérées comme des dépôts d’énergie, sont des organites cellulaires spécialisés qui interviennent dans le stockage des lipides, et elles comprennent un noyau lipidique neutre hydrophobe, qui contient principalement des esters de cholestérol et des triglycérides (TG), encapsulés par une monocouche phospholipide ^1,2,3.

La biogenèse de la LD se produit dans le réticulum endoplasmique (RE), en commençant par la synthèse du triacylglycérol (TAG) et des esters stéroliques. Les lipides neutres sont diffus....

Protocole

Toutes les procédures animales effectuées dans cette étude ont été approuvées par l’organisme de protection des animaux de l’Institut de recherche clinique et biomédicale de Coimbra (IBRC) (ORBEA, #9/2018) et étaient conformes aux directives nationales et européennes sur les soins aux animaux et aux directives ARRIVE.

1. Conception expérimentale

1. Couple de rats Wistar mâles âgés de 13 semaines dans des cages ventilées dans des conditions environnementales contrôlées de température (22 °C ± 1 °C), d’humidité (50 % à 60 %) et de lumière (cycle lumière-obscurité de 12 h) et avec accès ad libitum à l’eau du ro....

Discussion

Ce protocole BODIPY 493/503 basé sur la fluorescence pour l’évaluation de la LD visait à développer une nouvelle approche d’imagerie pour l’évaluation de la stéatose hépatique. Compte tenu de la forte corrélation entre l’obésité et la stéatose hépatique, le régime alimentaire riche en graisses de style occidental a été utilisé pour établir un modèle animal de stéatose^{hépatique 26}. Une forte augmentation de la teneur en TG hépatique a été confirmée par un kit de dosa.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set	Fisher Scientific
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	D3922
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR	D1306
70% ethanol	Honeywell	10191455
Adobe Illustrator CC	Adobe Inc.	Used to design the figures
Automatic analyzer Hitachi 717	Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany	8177-30-0010
Barrier pen (Liquid blocker super pap pen)	Daido Sangyo Co., Ltd, Japon	_
Blade	Leica	221052145	Used in the cryostat
Cell Profiler version 4.2.5	https://cellprofiler.org/releases/	Used to analyse the acquired images
Coverslips	Menzel-Glaser, Germany	_
Cryomolds	Tissue-Tek	_
Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S	Leica Biosystems	_
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	D-8418	Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Dry ice container (styrofoam cooler)	Novolab	A26742
Dumont forceps	Fine Science Tools, Germany	11295-10
Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm)	Thermo Scientific	150318	Used to weigh the liver after dissection
Glycergel	DAKO Omnis	S303023
GraphPad Prism software, version 9.3.1	GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA
High-fat diet	Envigo, Barcelona, Spain	MD.08811
Ketamine (Nimatek  100 mg/mL)	Dechra	791/01/14DFVPT	Used at a final concentration of 75 mg/kg
Laser scanning confocal microscope  (QUASAR detection unit; )	Carl Zeiss, germany	LSM 710 Axio Observer Z1 microscope
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL)	Dechra	1838 ESP / 020/01/07RFVPT	Used at a final concentration of 1 mg/kg
Needle	BD microlance	300635
No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade	Swann-Morton	205
Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)	Carl Zeiss, Germany
Paint brushes	Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X	Used to handle cryosections
Peristaltic pump (Minipuls 3)	Gilson	1004170
Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	P3813
Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3	Swann-Morton	0208
Slide staining system StainTray	Simport Scientific	M920
Standard diet	Mucedola	4RF21
Superfrost Plus microscope slides	Menzel-Glaser, Germany	J1800AMNZ
Tissue-Tek OCT mounting media	VWR CHEMICALS	361603E
Triglycerides colorimetric assay kit	Cayman Chemical	10010303
Ultrasonic bath	Bandelin Sonorex	TK 52
Vannas spring scissors - 3 mm cutting edge	Fine Science Tools, Germany	15000-00
ZEN Black software	Zeiss