간 지방증 평가를 위한 3D 재구성을 통한 형광 염색 지질 방울 분석

요약

여기에서 우리는 간 조직의 지질 액적 특성 분석을 위해 최적화된 BODIPY 493/503 형광 기반 프로토콜을 입증합니다. 직교 투영 및 3D 재구성의 사용을 통해 형광단은 미세소포와 대소포성 지방증 사이의 성공적인 구별을 가능하게 하고 간 지방증 평가를 위한 고전적인 조직학적 프로토콜에 대한 보완적인 접근 방식을 나타낼 수 있습니다.

초록

지질 액적(LD)은 지질 저장을 매개하고 지방 독성을 억제하고 유리 지방산(FA)으로 인한 기능 장애를 예방하는 데 매우 중요한 역할을 하는 특수 세포 기관입니다. 간은 신체의 지방 대사에 중요한 역할을 하기 때문에 미세소포성 및 대수포성 간 지방증의 형태로 LD의 세포 내 축적에 의해 지속적으로 위협을 받고 있습니다. LD의 조직학적 특성 분석은 일반적으로 ORO(Oil Red O) 염색과 같은 지용성 디아조 염료를 기반으로 하지만 여러 가지 단점이 간 표본에서 이 분석을 사용하는 것을 지속적으로 방해합니다. 보다 최근에, 친유성 형광단 493/503은 중성 지질 액적 코어로의 빠른 흡수 및 축적으로 인해 LD를 시각화하고 위치를 찾는 데 널리 사용되었습니다. 대부분의 응용 분야가 세포 배양에서 잘 설명되어 있지만 조직 샘플에서 LD 이미징 도구로서 친유성 형광단 프로브의 신뢰할 수 있는 사용을 입증하는 증거는 적습니다. 여기에서 우리는 고지방 식이(HFD) 유발 간 지방증의 동물 모델에서 간 표본의 LD를 평가하기 위해 최적화된 BODIPY(boron dipyromethene) 493/503 기반 프로토콜을 제안합니다. 이 프로토콜은 간 샘플 준비, 조직 절개, BODIPY 493/503 염색, 이미지 획득 및 데이터 분석을 다룹니다. 우리는 HFD 수유 시 간 LD의 증가된 수, 강도, 면적 비율 및 직경을 보여줍니다. 직교 투영과 3D 재구성을 사용하여 LD 코어에서 중성 지질의 전체 함량을 관찰할 수 있었으며, 이는 거의 구형의 물방울로 나타났습니다. 또한, 형광단 BODIPY 493/503을 사용하여 미세소포(1μm 9μm)를 구별할 수 있어 미세소포 및 대수포성 지방증을 성공적으로 구별할 수 있었습니다. 전반적으로, 이 BODIPY 493/503 형광 기반 프로토콜은 간 LD 특성 분석을 위한 신뢰할 수 있고 간단한 도구이며 고전적인 조직학적 프로토콜에 대한 보완적인 접근 방식을 나타낼 수 있습니다.

서문

지질 방울(LD)은 일반적으로 에너지 저장소로 간주되며, 지질 저장을 매개하는 특수 세포 소기관이며, 인지질 단층 ^1,2,3에 의해 캡슐화된 콜레스테롤 에스테르와 트리글리세리드(TG)를 주로 포함하는 소수성 중성 지질 코어로 구성됩니다.

LD 생물 발생은 트리 아실 글리세롤 (TAG)과 스테롤 에스테르의 합성으로 시작하여 소포체 (ER)에서 발생합니다. 중성 지질은 낮은 농도에서 ER 이중층의 소엽 사이에서 확산되지만 세포 내 농도가 증가하면 ER 막에서 거의 구형의 물방울로 자라서 싹이 트는 오일 렌즈로 합쳐집니다⁴. 그 후, ER 이중층 및 세포질의 단백질, 특히 페리핀(PLIN) 단백질 패밀리는 LD의 표면으로 전위되어 출아를 촉진합니다 ^5,6,7,8,9.

프로토콜

이 연구에서 수행된 모든 동물 절차는 코임브라 임상 및 생물 의학 연구 연구소(iCBR) 동물 복지 기구(ORBEA, #9/2018)의 승인을 받았으며 동물 관리 국가 및 유럽 지침과 ARRIVE 지침을 준수했습니다.

1. 실험 설계

1. 온도(22°C ± 1°C), 습도(50%-60%) 및 빛(12시간 명암 주기)의 통제된 환경 조건에서 통풍이 잘되는 케이지에 있는 페어 하우스 13주 된 수컷 Wistar 쥐와 수돗물 및 표준 설치류 차우에 대한 임의적 접근.
2. 2 주간의 순응 기간 후, 쥐를 임의로 두 그룹으로 나눕니다.
3. 대조군(CTRL, n = 6)과 고지방 식단 그룹(HFD, n = 6)에 각각 표준 차우와 고지방 식단(45% kcal/지방)을 24주 동안 공급합니다.
4. 매주 체중(BW)을 모니터링합니다. 케이지 당 매일 음식 및 음료 소비량을 기록하십시오.

2. 간 시료 전처리

1. 간 해부
   1. 연동 펌프 준비: 튜브를 통해 70% 에탄올을 흐르게 하고 27G 바늘을 튜브의 출구 끝에 연결한 다음 얼음처럼 차가운(4....

토론

LD 평가를 위한 이 BODIPY 493/503 형광 기반 프로토콜은 간 지방증 평가를 위한 새로운 이미징 접근 방식을 개발하는 것을 목표로 했습니다. 비만과 지방간 질환 사이의 강한 상관관계를 감안할 때, 간지방증의 동물 모델을 확립하기 위해 서양식 고지방 식단이 사용되었다²⁶. 간 TG 함량의 강력한 증가는 정량적 트리글리세리드 비색 분석 키트에 의해 확인되었으며, 이는 HFD를 먹인 동.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set	Fisher Scientific
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	D3922
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR	D1306
70% ethanol	Honeywell	10191455
Adobe Illustrator CC	Adobe Inc.	Used to design the figures
Automatic analyzer Hitachi 717	Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany	8177-30-0010
Barrier pen (Liquid blocker super pap pen)	Daido Sangyo Co., Ltd, Japon	_
Blade	Leica	221052145	Used in the cryostat
Cell Profiler version 4.2.5	https://cellprofiler.org/releases/	Used to analyse the acquired images
Coverslips	Menzel-Glaser, Germany	_
Cryomolds	Tissue-Tek	_
Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S	Leica Biosystems	_
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	D-8418	Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Dry ice container (styrofoam cooler)	Novolab	A26742
Dumont forceps	Fine Science Tools, Germany	11295-10
Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm)	Thermo Scientific	150318	Used to weigh the liver after dissection
Glycergel	DAKO Omnis	S303023
GraphPad Prism software, version 9.3.1	GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA
High-fat diet	Envigo, Barcelona, Spain	MD.08811
Ketamine (Nimatek  100 mg/mL)	Dechra	791/01/14DFVPT	Used at a final concentration of 75 mg/kg
Laser scanning confocal microscope  (QUASAR detection unit; )	Carl Zeiss, germany	LSM 710 Axio Observer Z1 microscope
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL)	Dechra	1838 ESP / 020/01/07RFVPT	Used at a final concentration of 1 mg/kg
Needle	BD microlance	300635
No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade	Swann-Morton	205
Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)	Carl Zeiss, Germany
Paint brushes	Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X	Used to handle cryosections
Peristaltic pump (Minipuls 3)	Gilson	1004170
Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	P3813
Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3	Swann-Morton	0208
Slide staining system StainTray	Simport Scientific	M920
Standard diet	Mucedola	4RF21
Superfrost Plus microscope slides	Menzel-Glaser, Germany	J1800AMNZ
Tissue-Tek OCT mounting media	VWR CHEMICALS	361603E
Triglycerides colorimetric assay kit	Cayman Chemical	10010303
Ultrasonic bath	Bandelin Sonorex	TK 52
Vannas spring scissors - 3 mm cutting edge	Fine Science Tools, Germany	15000-00
ZEN Black software	Zeiss