Hepatik Steatoz Değerlendirmesi için Floresan Boyalı Lipit Damlacıklarının 3D Rekonstrüksiyon ile Analizi

Özet

Burada, karaciğer dokusunda lipid damlacık karakterizasyonu için optimize edilmiş bir BODIPY 493/503 floresan tabanlı protokol gösterilmektedir. Ortogonal projeksiyonların ve 3D rekonstrüksiyonların kullanılmasıyla, florofor mikro-veziküler ve makroveziküler steatoz arasında başarılı bir ayrım yapılmasına izin verir ve hepatik steatoz değerlendirmesi için klasik histolojik protokollere tamamlayıcı bir yaklaşımı temsil edebilir.

Özet

Lipid damlacıkları (LD'ler), lipid depolanmasına aracılık eden ve lipotoksisiteyi baskılamada ve serbest yağ asitlerinin (FA'lar) neden olduğu işlev bozukluğunu önlemede çok önemli bir rol oynayan özel organellerdir. Karaciğer, vücudun yağ metabolizmasındaki kritik rolü göz önüne alındığında, LD'lerin hem mikro-veziküler hem de makroveziküler hepatik steatoz şeklinde hücre içi birikimi ile sürekli tehdit altındadır. LD'lerin histolojik karakterizasyonu tipik olarak Yağ Kırmızısı O (ORO) boyaması gibi lipitte çözünür diazo boyalarına dayanır, ancak bir dizi dezavantaj bu analizin karaciğer örnekleriyle kullanımını sürekli olarak engellemektedir. Daha yakın zamanlarda, lipofilik floroforlar 493/503, nötr lipit damlacık çekirdeğine hızlı alımları ve birikimleri nedeniyle LD'leri görselleştirmek ve bulmak için popüler hale gelmiştir. Çoğu uygulama hücre kültürlerinde iyi tanımlanmış olsa da, doku örneklerinde LD görüntüleme aracı olarak lipofilik florofor problarının güvenilir kullanımını gösteren daha az kanıt vardır. Burada, yüksek yağlı diyet (HFD) kaynaklı hepatik steatozun bir hayvan modelinden karaciğer örneklerinde LD'lerin değerlendirilmesi için optimize edilmiş bir bor dipirometen (BODIPY) 493/503 tabanlı protokol öneriyoruz. Bu protokol karaciğer örneği hazırlama, doku kesitleme, BODIPY 493/503 boyama, görüntü elde etme ve veri analizini kapsamaktadır. HFD beslenmesinde hepatik LD'lerin sayısının, yoğunluğunun, alan oranının ve çapının arttığını gösteriyoruz. Ortogonal projeksiyonlar ve 3D rekonstrüksiyonlar kullanarak, neredeyse küresel damlacıklar olarak görünen LD çekirdeğindeki nötr lipitlerin tam içeriğini gözlemlemek mümkündü. Dahası, florofor BODIPY 493/503 ile, mikro-parçacıkları (1 μm < d ≤ 3 μm), ara vezikülleri (3 μm < d ≤ 9 μm) ve makro-parçacıkları (d > 9 μm) ayırt edebildik ve mikro-veziküler ve makroveziküler steatozun başarılı bir şekilde ayırt edilmesini sağladık. Genel olarak, bu BODIPY 493/503 floresan tabanlı protokol, hepatik LD karakterizasyonu için güvenilir ve basit bir araçtır ve klasik histolojik protokollere tamamlayıcı bir yaklaşımı temsil edebilir.

Giriş

Klasik olarak enerji depoları olarak görülen lipit damlacıkları (LD'ler), lipit depolanmasına aracılık eden özel hücresel organellerdir ve esas olarak bir fosfolipid monokatmanı ^1,2,3 tarafından kapsüllenen kolesterol esterleri ve trigliseritler (TG'ler) içeren hidrofobik nötr bir lipit çekirdeği içerirler.

LD biyogenezi, triasilgliserol (TAG) ve sterol esterlerinin sentezi ile başlayan endoplazmik retikulumda (ER) meydana gelir. Nötr lipitler, düşük konsantrasyonlarda ER çift katmanlı broşürler arasında dağılır, ancak hücre içi konsantrasyonları

Protokol

Bu çalışmada gerçekleştirilen tüm hayvan prosedürleri, Coimbra Klinik ve Biyomedikal Araştırma Enstitüsü (iCBR) Hayvan Refahı Kurumu (ORBEA, # 9 / 2018) tarafından onaylanmıştır ve Hayvan Bakımı Ulusal ve Avrupa Direktiflerine ve ARRIVE kılavuzlarına uygundur.

1. Deneysel tasarım

1. Sıcaklık (22 °C ± 1 °C), nem (%50-%60) ve ışık (12 saat açık-karanlık döngüsü) kontrollü çevresel koşullar altında havalandırılan kafeslerde ve musluk suyuna ve standart kemirgen chow'a ad libitum erişimi olan 13 haftalık erkek Wistar sıçanları.
2. 2 haftalık bir iklimlendirme periyodundan sonra, sıçanları keyfi olarak iki....

Tartışmalar

LD değerlendirmesi için bu BODIPY 493/503 floresan tabanlı protokol, hepatik steatozun değerlendirilmesi için yeni bir görüntüleme yaklaşımı geliştirmeyi amaçlamıştır. Obezite ve yağlı karaciğer hastalığı arasındaki güçlü korelasyon göz önüne alındığında, Batı tarzı yüksek yağlı diyet, hepatik steatoz^26'nın bir hayvan modelini oluşturmak için kullanılmıştır. Hepatik TG içeriğinde sağlam bir artış, HFD ile beslenen hayvanlarda artmış bir hepatik l.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set	Fisher Scientific
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	D3922
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR	D1306
70% ethanol	Honeywell	10191455
Adobe Illustrator CC	Adobe Inc.	Used to design the figures
Automatic analyzer Hitachi 717	Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany	8177-30-0010
Barrier pen (Liquid blocker super pap pen)	Daido Sangyo Co., Ltd, Japon	_
Blade	Leica	221052145	Used in the cryostat
Cell Profiler version 4.2.5	https://cellprofiler.org/releases/	Used to analyse the acquired images
Coverslips	Menzel-Glaser, Germany	_
Cryomolds	Tissue-Tek	_
Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S	Leica Biosystems	_
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	D-8418	Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Dry ice container (styrofoam cooler)	Novolab	A26742
Dumont forceps	Fine Science Tools, Germany	11295-10
Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm)	Thermo Scientific	150318	Used to weigh the liver after dissection
Glycergel	DAKO Omnis	S303023
GraphPad Prism software, version 9.3.1	GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA
High-fat diet	Envigo, Barcelona, Spain	MD.08811
Ketamine (Nimatek  100 mg/mL)	Dechra	791/01/14DFVPT	Used at a final concentration of 75 mg/kg
Laser scanning confocal microscope  (QUASAR detection unit; )	Carl Zeiss, germany	LSM 710 Axio Observer Z1 microscope
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL)	Dechra	1838 ESP / 020/01/07RFVPT	Used at a final concentration of 1 mg/kg
Needle	BD microlance	300635
No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade	Swann-Morton	205
Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)	Carl Zeiss, Germany
Paint brushes	Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X	Used to handle cryosections
Peristaltic pump (Minipuls 3)	Gilson	1004170
Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	P3813
Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3	Swann-Morton	0208
Slide staining system StainTray	Simport Scientific	M920
Standard diet	Mucedola	4RF21
Superfrost Plus microscope slides	Menzel-Glaser, Germany	J1800AMNZ
Tissue-Tek OCT mounting media	VWR CHEMICALS	361603E
Triglycerides colorimetric assay kit	Cayman Chemical	10010303
Ultrasonic bath	Bandelin Sonorex	TK 52
Vannas spring scissors - 3 mm cutting edge	Fine Science Tools, Germany	15000-00
ZEN Black software	Zeiss