Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, karaciğer dokusunda lipid damlacık karakterizasyonu için optimize edilmiş bir BODIPY 493/503 floresan tabanlı protokol gösterilmektedir. Ortogonal projeksiyonların ve 3D rekonstrüksiyonların kullanılmasıyla, florofor mikro-veziküler ve makroveziküler steatoz arasında başarılı bir ayrım yapılmasına izin verir ve hepatik steatoz değerlendirmesi için klasik histolojik protokollere tamamlayıcı bir yaklaşımı temsil edebilir.

Özet

Lipid damlacıkları (LD'ler), lipid depolanmasına aracılık eden ve lipotoksisiteyi baskılamada ve serbest yağ asitlerinin (FA'lar) neden olduğu işlev bozukluğunu önlemede çok önemli bir rol oynayan özel organellerdir. Karaciğer, vücudun yağ metabolizmasındaki kritik rolü göz önüne alındığında, LD'lerin hem mikro-veziküler hem de makroveziküler hepatik steatoz şeklinde hücre içi birikimi ile sürekli tehdit altındadır. LD'lerin histolojik karakterizasyonu tipik olarak Yağ Kırmızısı O (ORO) boyaması gibi lipitte çözünür diazo boyalarına dayanır, ancak bir dizi dezavantaj bu analizin karaciğer örnekleriyle kullanımını sürekli olarak engellemektedir. Daha yakın zamanlarda, lipofilik floroforlar 493/503, nötr lipit damlacık çekirdeğine hızlı alımları ve birikimleri nedeniyle LD'leri görselleştirmek ve bulmak için popüler hale gelmiştir. Çoğu uygulama hücre kültürlerinde iyi tanımlanmış olsa da, doku örneklerinde LD görüntüleme aracı olarak lipofilik florofor problarının güvenilir kullanımını gösteren daha az kanıt vardır. Burada, yüksek yağlı diyet (HFD) kaynaklı hepatik steatozun bir hayvan modelinden karaciğer örneklerinde LD'lerin değerlendirilmesi için optimize edilmiş bir bor dipirometen (BODIPY) 493/503 tabanlı protokol öneriyoruz. Bu protokol karaciğer örneği hazırlama, doku kesitleme, BODIPY 493/503 boyama, görüntü elde etme ve veri analizini kapsamaktadır. HFD beslenmesinde hepatik LD'lerin sayısının, yoğunluğunun, alan oranının ve çapının arttığını gösteriyoruz. Ortogonal projeksiyonlar ve 3D rekonstrüksiyonlar kullanarak, neredeyse küresel damlacıklar olarak görünen LD çekirdeğindeki nötr lipitlerin tam içeriğini gözlemlemek mümkündü. Dahası, florofor BODIPY 493/503 ile, mikro-parçacıkları (1 μm < d ≤ 3 μm), ara vezikülleri (3 μm < d ≤ 9 μm) ve makro-parçacıkları (d > 9 μm) ayırt edebildik ve mikro-veziküler ve makroveziküler steatozun başarılı bir şekilde ayırt edilmesini sağladık. Genel olarak, bu BODIPY 493/503 floresan tabanlı protokol, hepatik LD karakterizasyonu için güvenilir ve basit bir araçtır ve klasik histolojik protokollere tamamlayıcı bir yaklaşımı temsil edebilir.

Giriş

Klasik olarak enerji depoları olarak görülen lipit damlacıkları (LD'ler), lipit depolanmasına aracılık eden özel hücresel organellerdir ve esas olarak bir fosfolipid monokatmanı 1,2,3 tarafından kapsüllenen kolesterol esterleri ve trigliseritler (TG'ler) içeren hidrofobik nötr bir lipit çekirdeği içerirler.

LD biyogenezi, triasilgliserol (TAG) ve sterol esterlerinin sentezi ile başlayan endoplazmik retikulumda (ER) meydana gelir. Nötr lipitler, düşük konsantrasyonlarda ER çift katmanlı broşürler arasında dağılır, ancak hücre içi konsantrasyonları4 arttığında ER membranından neredeyse küresel damlacıklar halinde büyüyen ve tomurcuklanan yağ lenslerine birleşir. Daha sonra, ER çift katmanlı ve sitosolden proteinler, özellikle perilipin (PLIN) protein ailesi, tomurcuklanmayı kolaylaştırmak için LD'lerin yüzeylerine translokasyon yapar 5,6,7,8,9.

Yeni yağ asidi sentezi ve LD füzyonu veya birleşmesi yoluyla, LD'ler farklı boyutlarda büyür. Buna göre, LD'lerin boyutu ve sayısı farklı hücre tipleri arasında önemli ölçüde farklılık gösterir. İlk LD'ler (iLD'ler) olarak bilinen küçük damlacıklar (300-800 nm çapında), neredeyse tüm hücreler tarafından oluşturulabilir4. LD oluşumunda daha sonra, çoğu hücre bazı iLD'leri daha büyük olanları genişleten LD'lere (eLD'ler >1 μm çapında) dönüştürebilir. Bununla birlikte, adipositler ve hepatositler gibi sadece spesifik hücre tipleri, dev veya süper boyutlu LD'ler (onlarca mikron çapına kadar) oluşturma kapasitesine sahiptir4,10.

LD'ler, hücresel lipit metabolizmasının düzenlenmesinde, lipotoksisitenin baskılanmasında ve ER stresinin, mitokondriyal disfonksiyonun ve nihayetinde serbest yağ asitlerinin (FA'lar) neden olduğu hücre ölümünün önlenmesinde çok önemli bir rol oynamaktadır11,12,13,14. Ayrıca, LD'ler ayrıca gen ekspresyonunun, viral replikasyon proteini tutulmasının ve membran kaçakçılığının ve sinyalizasyonunun düzenlenmesinde de rol oynamıştır15,16,17. Bu nedenle, LD biyogenezinin yanlış düzenlenmesi, metabolik sendrom, obezite, tip 2 diabetes mellitus (T2DM) ve / veya arteriyoskleroz ile ilişkili kronik hastalıkların bir işaretidir.

Karaciğer, metabolik bir merkez olarak, lipitleri depolayarak ve işleyerek lipit metabolizmasından çoğunlukla sorumludur ve bu nedenle, lipotoksisite21 tarafından sürekli tehdit edilmektedir. Hepatik steatoz (HS), bir dizi ilerleyici karaciğer hastalığının ortak bir özelliğidir ve sonuçta karaciğer metabolik disfonksiyonuna, inflamasyona ve alkolsüz yağlı karaciğer hastalığının ileri formlarına yol açabilen sitozolik LD'ler şeklinde aşırı hücre içi lipid birikimi ile karakterizedir22,23,24,25. HS, çok düşük yoğunluklu lipoproteinler (VLDL'ler) içindeki yağ asidi oksidasyonu ve trigliseritler olarak ihracat hızı, plazmadan hepatik yağ asidi alım hızından ve de novo yağ asidi sentezinden26 daha düşük olduğunda ortaya çıkar. Lipidlerin hepatik birikimi sıklıkla iki formda ortaya çıkar - mikro-veziküler ve makroveziküler steatoz- ve bunlar farklı sitoarkitektonik özellikler gösterir27. Tipik olarak, mikro-veziküler steatoz, çekirdeğin merkezi olarak yerleştirildiği hepatosit boyunca dağılmış küçük LD'lerin varlığı ile karakterize edilirken, makroveziküler steatoz, hepatositin büyük bölümünü kaplayan ve çekirdeği çevreye iten tek bir büyük LD'nin varlığı ile karakterize edilir28,29. Özellikle, bu iki tip steatoz sıklıkla birlikte bulunur ve bu iki LD paterninin hastalık patogenezini nasıl etkilediği belirsizliğini korumaktadır, çünkü kanıtlar hala tutarsızdır31,32,33,34. Bununla birlikte, bu tür analizler genellikle LD'lerin dinamik davranışını anlamak ve hepatik steatozukarakterize etmek için klinik öncesi ve klinik çalışmalarda bir "referans standardı" olarak kullanılır 29,34,35,36.

HS tanısı ve derecelendirilmesinde altın standart olan karaciğer biyopsileri, H&E boyalı karaciğer bölümlerinde lipid damlacıklarının lekelenmemiş vakuoller olarak değerlendirildiği histolojik hematoksilin ve eozin (H&E) analizi ile rutin olarak değerlendirilmektedir37. Makroveziküler steatoz değerlendirmesi için kabul edilebilir olsa da, bu tip boyama genellikle mikro-veziküler steatoz38'in değerlendirmesini daraltır. Yağ Kırmızısı O (ORO) gibi lipitte çözünür diazo boyaları, hücre içi lipit depolarını analiz etmek için klasik olarak parlak alan mikroskobu ile birleştirilir, ancak bunların hala bir takım dezavantajları vardır: (i) boyama işleminde etanol veya izopropanol kullanımı, bu da genellikle doğal LD'lerin bozulmasına ve hücrelerin sabitlenmesine rağmen ara sıra füzyona neden olur39; (ii) ORO çözeltisi, sınırlı raf ömrü nedeniyle taze tozun çözülmesini ve filtrelenmesini gerektirdiğinden, zaman alıcı doğa, böylece daha az tutarlı sonuçlara katkıda bulunur; (iii) ve ORO'nun sadece lipit damlacıklarından daha fazlasını boyadığı ve sıklıkla hepatik steatoz38'i abarttığı gerçeği.

Sonuç olarak, Nil Kırmızısı gibi hücre geçirgen lipofilik floroforlar, yukarıda belirtilen sınırlamaların bazılarının üstesinden gelmek için canlı veya sabit numunelerde kullanılmıştır. Bununla birlikte, hücresel lipid organel etiketlemesinin spesifik olmayan doğası, LD değerlendirmelerini tekrar tekrar daraltır40. Dahası, Nil Kırmızısı'nın spektral özellikleri, çevrenin polaritesine göre değişir ve bu da genellikle spektral kaymalara yol açabilir41.

Lipofilik floresan prob 1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4adiaza-s-indacene (uyarma dalga boyu: 480 nm; emisyon maksimum: 515 nm; BODIPY 493/503), hücre içi LD'ler tarafından hızlı bir şekilde alınmasına izin veren, lipit damlacık çekirdeğinde biriken ve daha sonra parlak yeşil floresan12 yayan hidrofobiklik özellikleri sergiler. Nil Kırmızısı'nın aksine, BODIPY 493/503 çevre polaritesine duyarsızdır ve LD görüntüleme için yüksek parlaklık gösterdiği için daha seçici olduğu gösterilmiştir. Nötr LD'leri boyamak için, bu boya canlı veya sabit hücrelerde kullanılabilir ve diğer boyama ve / veya etiketleme yöntemleriyle başarıyla birleştirilebilir42. Boyanın bir diğer avantajı, bir çözeltiye yerleştirmek için çok az çaba gerektirmesi ve kararlı olmasıdır, böylece her deney için taze olarak hazırlama ihtiyacını ortadan kaldırır42. BODIPY 493/503 probu, hücre kültürlerinde LD'lerin lokalizasyonunu ve dinamiklerini görselleştirmek için başarıyla kullanılmış olsa da, bazı raporlar bu boyanın insan vastus lateralis kası43, sıçan soleus kası 42 ve fare bağırsağı44 dahil olmak üzere dokularda LD görüntüleme aracı olarak güvenilir bir şekilde kullanıldığını göstermiştir.

Burada, hepatik steatozun bir hayvan modelinden karaciğer örneklerinde LD sayısının, alanının ve çapının değerlendirilmesi için alternatif bir analitik yaklaşım olarak optimize edilmiş bir BODIPY 493/503 tabanlı protokol öneriyoruz. Bu prosedür karaciğer örneği hazırlama, doku kesitleme, boyama koşulları, görüntü elde etme ve veri analizini kapsar.

Protokol

Bu çalışmada gerçekleştirilen tüm hayvan prosedürleri, Coimbra Klinik ve Biyomedikal Araştırma Enstitüsü (iCBR) Hayvan Refahı Kurumu (ORBEA, # 9 / 2018) tarafından onaylanmıştır ve Hayvan Bakımı Ulusal ve Avrupa Direktiflerine ve ARRIVE kılavuzlarına uygundur.

1. Deneysel tasarım

  1. Sıcaklık (22 °C ± 1 °C), nem (%50-%60) ve ışık (12 saat açık-karanlık döngüsü) kontrollü çevresel koşullar altında havalandırılan kafeslerde ve musluk suyuna ve standart kemirgen chow'a ad libitum erişimi olan 13 haftalık erkek Wistar sıçanları.
  2. 2 haftalık bir iklimlendirme periyodundan sonra, sıçanları keyfi olarak iki gruba ayırın.
  3. Kontrol (CTRL, n = 6) ve yüksek yağlı diyet gruplarını (HFD, n = 6) 24 hafta boyunca sırasıyla standart chow ve yüksek yağlı bir diyetle (% 45 kcal / yağ) besleyin.
  4. Vücut ağırlığını (BW) haftalık olarak izleyin. Yiyecek ve içecek tüketimini kafes başına günlük olarak kaydedin.

2. Karaciğer örneği hazırlama

  1. Karaciğer diseksiyonu
    1. Peristaltik pompayı hazırlayın: Borudan %70 etanol çalıştırın, borunun çıkış ucuna 27 G'lık bir iğne bağlayın ve boruyu buz gibi soğuk (4 °C) 1x fosfat tamponlu salin (PBS, pH ~ 7,4) ile astarlayın (örneğin, 1,6 mm ID silikon borulu, IV mini damlama setli peristaltik bir pompada 200 rpm). Vücut ağırlığına göre ayarlayın (örneğin, 100-150 g'lık bir sıçan için, yaklaşık 10-12 mL / dak'lık bir akış hızı kullanın).
    2. Bir anestezi protokolü kullanarak sıçanı intraperitoneal enjeksiyonla uyuşturun (ketamin nihai konsantrasyonu = 75 mg / kg ve son medetomidin konsantrasyonu = 1 mg / kg).
      NOT: Sıçanın ayak parmağı çimdikleme yanıtı yöntemi kullanılarak tamamen uyuşturulduğundan emin olun.
    3. Sıçanı diseksiyon tepsisine yerleştirin.
    4. Kürkü% 70 etanol ile iyice sterilize edin ve bir kağıt havluyla kurulayın.
    5. Makas kullanarak, deriden "U" şeklinde bir kesi yapın ve diyaframın altında kesin. Ardından, kalbi açığa çıkarmak için göğüs kafesini kenarlardan rostral olarak kesin.
    6. 1x PBS çalışırken, iğneyi sol ventrikülden yükselen aort içine geçirin ve kelepçeleyin. Daha sonra, perfüzyon başladıktan sonra drenaja izin vermek için sağ atriyum kesilir.
      NOT: Kan PBS ile değiştirildiği için karaciğer ağartmaya başlamalıdır.
    7. Makas ve Dumont forseps kullanarak, karaciğeri dikkatlice çıkarın ve 1x PBS ile durulayın.
    8. Karaciğeri bir Petri kabına aktarın ve tartın.
    9. Bir neşter kullanarak, gömme işlemi için karaciğerin sol lobunun lateral tarafından (kenardan 1 cm) 5 mm kalınlığında hepatik doku örnekleri toplayın.
      NOT - Kalan doku uzun süreli depolama için -80 °C'de saklanabilir.
  2. Karaciğer dokusu gömme
    1. Kuru bir buz kabı hazırlayın ve kriyomoldları numune kimliği ve oryantasyonu ile uygun şekilde etiketleyin.
    2. Optimum kesme sıcaklığını (OCT) elde etmek için kriyomolün merkezine birkaç damla kriyo gömme matrisi yerleştirin.
    3. Doku örneğinin enine bir kesit için uygun şekilde yönlendirildiğinden emin olun.
      NOT: Kriyomoldun dibine temas eden tarafın ilk önce bölümlenecek taraf olduğundan emin olun.
    4. Tamamen kaplanana kadar kriyomold üzerine dikkatlice daha fazla OCT bırakın. Hava kabarcıklarının oluşumunu önlemeye çalışın. Gerekirse, düz forsepslerle, OCT içindeki kabarcıkları çıkarın.
    5. Kriyomoldu OCT kaplı numune ile birlikte kuru bir buz kabına hızla yerleştirin.
      NOT: Dokular 3 yıl boyunca -80 °C'de saklanabilir.

3. Dondurulmuş doku kesitleme

  1. Kriyostat sıcaklığını ayarlayın (hazne: -21 °C; numune: -18 °C) ve yeni bir steril bıçak takın.
  2. Sıcaklığın dengelenmesine izin vermeden önce numuneleri kriyostata 30 dakika bekletin.
  3. Numunenin yapışmasına izin vermek için numune diski üzerinde tek bir OCT tabakası yapın. OCT'nin donmasına izin verin ve doku örneğini istenen yönde monte edin.
    NOT: Kesme yüzeyi bıçağa paralel olmalıdır. İyi yapışmayı korumak için, ısı çıkarıcıyı numunenin üstüne yerleştirin. Önceki adımlar, kuru buzlu kuru bir buz kabında da gerçekleştirilebilir.
  4. Numuneyi numune kafasına yerleştirin ve dokunun yüzeyini kesin (birkaç 30 μm doku örneği bölümü).
  5. İlgilenilen bölge kesitleme için erişilebilir olduğunda, 12 μm kalınlığında kesitleri kesin ve bunları oda sıcaklığında (RT) tutulan etiketli mikroskop slaytlarına yerleştirin.
    NOT: Kesiti toplamak için, slaytı yavaşça doku bölümüne doğru hareket ettirin. Her slayt iki karaciğer bölümü toplayabilir.
  6. RT'de slaytların 10 dakika kurumasını bekleyin.
    NOT: Slaytlar 6-12 ay boyunca -20 °C'de veya 3 yıla kadar -80 °C'de saklanabilir.

4. BODIPY boyama

  1. Slaytları RT'de bir slayt boyama sisteminde 30 dakika boyunca çözün.
  2. 1x PBS ile yıkayın (her biri 5 dakika boyunca 3x).
  3. Bir bariyer kalemi kullanarak bölümü hidrofobik bir tabaka ile daire içine alın.
  4. 500 μg/mL BODIPY 493/503 stok çözeltisi hazırlayın: 1 mg BODIPY 493/503'ü 2 mL çözücü içinde çözün (%90 DMSO; %10 1x PBS). Işıktan koruyun. 37 ° C'de 1 saat (9.5-10 W) ultrasonik bir banyoda sonikasyon.
    NOT: Çözelti en az 30 gün boyunca -20 ° C'de saklanabilir.
  5. 997,9 μL 1x PBS'ye 2 μL BODIPY 493/503 stok çözeltisi ve 0,1 μL DAPI stok çözeltisi (5 mg/mL) ekleyerek BODIPY boyama çözeltisini (1 μg/mL) hazırlayın.
  6. Slaytları (75 μL/slayt) BODIPY 493/503 (1 μg/mL) ve DAPI (0,1 μg/mL) ile RT'de 40 dakika boyunca inkübe edin.
    NOT: Bu adımdan itibaren slaytları karanlıkta tutun.
  7. Slaytları 1x PBS ile yıkayın (her biri 5 dakika boyunca 3x).
  8. Slaytları bir floresan montaj ortamı kullanarak kapaklarla monte edin, 30 dakika kurumasını bekleyin ve oje ile kapatın.
    NOT: Slaytlar görüntülemeye kadar 4 °C'de saklanabilir.

5. Lipid ölçümü

  1. Serum total kolesterol ve TG düzeylerini otomatik, doğrulanmış bir yöntem ve ekipman kullanarak ölçün.
  2. Hepatik TG seviyelerini, üreticinin protokolüne göre bir trigliserit kolorimetrik tahlil kiti (Malzeme Tablosu) kullanarak ölçün.

6. Görüntü alma

  1. Slaydı lazer taramalı konfokal mikroskop slayt tutucusuna yerleştirin.
  2. Görüntü görselleştirme ve elde etme için, 20x objektif lensli bir konfokal mikroskop kullanın (plan-apokromat: 20x / 0.8).
  3. BODIPY 493/503 ve DAPI arasındaki karşılıklı konuşmayı önlemek için, konfokal yazılımdaki sıralı (en iyi sinyal) tarama modunu kullanın.
  4. 488 nm argon lazer hattını kullanarak BODIPY 593/503'ü ve 405 nm lazer hattını kullanarak DAPI'yi heyecanlandırın. BODIPY 493/503 için emisyon aralıklarını 493-589 nm ve DAPI için 410-464 nm olarak ayarlayın.
  5. Şu ayarları kullanın: iğne deliği: 1 AU, çözünürlük: 1.024 piksel x 1.024 piksel, bit derinliği: 12, piksel boyutu: 0,415 μm, çift yönlü mod, tarama hızı: 7 (20x reklam verme amacı için ~1,58 μs/piksel), çizgi ortalaması: 2x ve dijital yakınlaştırma: 1.
    NOT: Yukarıda belirtilen tarama parametreleri, kullanılan her konfokal mikroskop ve amaç için optimize edilmelidir.
  6. Kazancı ve dijital kazancı, aralık göstergesinde doygun piksel algılanmayacak şekilde uygun şekilde ayarlayın.
    NOT: Ofseti ayarlayarak arka plan sinyalini düzeltin.
  7. LD'ler doğru bir şekilde tanımlandıktan sonra, görüntüyü BODIPY ve DAPI kanallarıyla alın.
    NOT: Tüm resimler, her renk kanalı için aynı koşullarda (pozlama ve genel ayarlar) alınmalıdır.
  8. Geniş alan görüntüleri oluşturmak için (Şekil 2), hedefi a10x objektif lens olarak değiştirin (plan-neofluar: 10x/0.3).
  9. Döşeme Tarama modunu seçin ve 5 görüntü başına 5'lik mozaikler yapın.
    NOT: Bu çalışmada, karoları analiz için uygun şekilde birleştirmek için her bir karo% 10'luk bir örtüşme vardı.
  10. 3B ve ortogonal görünümler oluşturmak için (Şekil 3A), kapak camının üstüne bir damla daldırma yağı yerleştirin ve hedefi 40x objektif lensle değiştirin (plan-neofluar: 40x/1.30 yağ).
  11. Z-Stack modunu seçin ve Z düzlemini ayarlayarak, tüm damlacıkların yakalandığından emin olmak için optimum kalınlıkta (~0,5 μm) bir optik dilimle elde edilecek ilk ve son konumları tanımlayın.
    NOT: Görüntü alımını hızlandırmak ve ağartmayı önlemek için, optik dilim optimal olmayan bir boyuta ayarlanabilir ve iyi bir 3D rekonstrüksiyon için en az% 30 aşırı örnekleme sağlanır.
  12. Orto modülünü seçin ve ortogonal görünümler oluşturun.
  13. Konfokal mikroskop yazılımı ile Saydamlık İşleme Modu'nu takip eden 3B modülü seçerek 3B görüntüler elde edin.

7. Görüntülerin analizi

  1. CellProfiler (sürüm 4.2.5) ile tek düzlemli görüntüleri (20x büyütme) işleyin ve analiz edin.
    NOT: Bu çalışmada kullanılan boru hattı Adomshick ve ark.'dan uyarlanmıştır.45.
  2. CellProfiler penceresinin sol üst köşesindeki Görüntüler modülüne tıklayın ve görüntüleri .tiff dosyaları olarak yükleyin.
  3. Dosya adlarına göre BODIPY- (damlacık) ve DAPI- (çekirdek) lekeli görüntüleri sıralamak için NamesAndTypes modülünü kullanın. LD analizini yalnızca BODIPY boyalı görüntülerle gerçekleştirin.
  4. İşlem hattı yapılandırmasını başlatmak için Modülleri Ayarla'ya tıklayın ve görüntüleri gri tonlamalı görüntülere dönüştürmek için ColorToGray modülünü seçin.
    NOT: Nesneleri tanımlamak için gri tonlamalı görüntüler gereklidir.
  5. Gri tonlamalı görüntüyü kullanarak IdentifyPrimaryObjects modülünü kullanarak damlacıkları tanımlayın.
    NOT: Bu modüldeki parametreler, iyi LD tanımlaması yapmak için ayarlanmalıdır. Bu çalışmada, boyutu 6 piksel ile 300 piksel arasında olan LD'lerin ve eşik düzeltme faktörünün 1.0 olarak tanımlanması en doğru tanımlamaya yol açmıştır.
  6. Tanımlanan lipit damlacıklarının piksel yoğunluğunu ölçmek için bir MeasureObjectIntensity modülü ekleyin.
  7. Son lipit damlacık analizinden daha az yoğun sinyaller hariç tutulurken yalnızca en güçlü sinyallerin ölçülmesini sağlamak için ek bir FilterObjects modülü ekleyin (minimum yoğunluk: 0,15; maksimum yoğunluk:1 rastgele birim).
  8. Çıktı verileriyle ilgili LD'leri ölçmek için MeasureObjectSizeShape modülünü ekleyin.
  9. Tanımlanan damlacığı orijinal görüntüye bindirmek için bu noktada bir OverlayOutlines modülü ekleyin ve böylece segmentasyonun işlenmemiş görüntüde de doğru görünmesini sağlayın.
    NOT: Bu isteğe bağlı (kalite kontrol) bir adımdır.
  10. Sonuna bir ExportToSpreadsheet modülü ekleyin ve sol alt köşedeki Görüntüleri Analiz Et düğmesine tıklayın.

8. İstatistiksel analiz

  1. Herhangi bir istatistiksel analiz yazılımı uygulamasını kullanarak sonuçları ortalamanın (S.E.M.) ortalama ± standart hatası olarak ifade edin.
    NOT: Bu çalışmada istatistiksel analiz için GraphPad yazılımı kullanılmıştır.
  2. Normallikten önemli sapmaları değerlendirmek için Kolmogorov-Smirnov testini kullanarak değerlerin dağılımını analiz edin. Öğrencinin eşlenmemiş t-testini kullanarak parametrik verileri analiz edin.
    NOT: p < 0,05 değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Sonuçlar

Bu tekniğin başarılı bir şekilde uygulanması, LD morfolojisinin (3D rekonstrüksiyona dayalı şekil ve lipit çekirdek yoğunluğu) eşzamanlı karakterizasyonu için açık lipit damlacık boyaması ile uzamsal dağılımları, toplam alan başına sayı ve ortalama büyüklükleri (yukarıda tarif edilen boru hattı ile değerlendirilmiştir, Şekil 1) ile sonuçlanmalıdır.

Tartışmalar

LD değerlendirmesi için bu BODIPY 493/503 floresan tabanlı protokol, hepatik steatozun değerlendirilmesi için yeni bir görüntüleme yaklaşımı geliştirmeyi amaçlamıştır. Obezite ve yağlı karaciğer hastalığı arasındaki güçlü korelasyon göz önüne alındığında, Batı tarzı yüksek yağlı diyet, hepatik steatoz26'nın bir hayvan modelini oluşturmak için kullanılmıştır. Hepatik TG içeriğinde sağlam bir artış, HFD ile beslenen hayvanlarda artmış bir hepatik l...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu araştırma, Portekiz Bilim ve Teknoloji Vakfı (FCT), Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (FEDER) ve Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020 (CIBB) ve POCI-01-0145-FEDER-007440 aracılığıyla Ulusal ve Avrupa Fonları tarafından finanse edilmiştir. Yazarlar, Coimbra Üniversitesi Tıp Fakültesi'nin bir tesisi ve ulusal altyapı PPBI-Portekiz BiyoGörüntüleme Platformu'nun (POCI-01-0145-FEDER-022122) bir üyesi olan iLAB - Mikroskopi ve Biyogörüntüleme Laboratuvarı'nın desteğine ve FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142'nin desteğine teşekkür eder.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip setFisher Scientific
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)Sigma-Aldrich, Lyon, FranceD3922
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, ORD1306
70% ethanolHoneywell10191455
Adobe Illustrator CCAdobe Inc.Used to design the figures
Automatic analyzer Hitachi 717Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany8177-30-0010
Barrier pen (Liquid blocker super pap pen)Daido Sangyo Co., Ltd, Japon_
BladeLeica221052145Used in the cryostat
Cell Profiler version 4.2.5https://cellprofiler.org/releases/Used to analyse the acquired images
CoverslipsMenzel-Glaser, Germany_
CryomoldsTissue-Tek_
Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 SLeica Biosystems_
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich, Lyon, FranceD-8418Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic
and flammable. Vapors may cause
irritation. Manipulate in a fume
hood. Avoid direct contact with skin.
Wear rubber gloves, protective eye
goggles.
Dry ice container (styrofoam cooler)NovolabA26742
Dumont forcepsFine Science Tools, Germany11295-10
Glass Petri dish (H 25 mm, ø
150 mm)		Thermo Scientific150318Used to weigh the liver after dissection
GlycergelDAKO OmnisS303023
GraphPad Prism software, version 9.3.1GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA
High-fat dietEnvigo, Barcelona, SpainMD.08811
Ketamine (Nimatek  100 mg/mL)Dechra791/01/14DFVPTUsed at a final concentration of 75 mg/kg
Laser scanning confocal microscope  (QUASAR detection unit; )Carl Zeiss, germanyLSM 710 Axio Observer Z1 microscope
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL)Dechra1838 ESP / 020/01/07RFVPTUsed at a final concentration of 1 mg/kg
NeedleBD microlance300635
No 15 Sterile carbon steel scalpel
Blade		Swann-Morton205
Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil) Carl Zeiss, Germany
Paint brushesVan Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X Used to handle cryosections
Peristaltic pump (Minipuls 3)Gilson1004170
Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4)Sigma-Aldrich, Lyon, FranceP3813
Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3Swann-Morton0208
Slide staining system StainTraySimport ScientificM920
Standard diet Mucedola4RF21
Superfrost Plus microscope slidesMenzel-Glaser, GermanyJ1800AMNZ
Tissue-Tek OCT mounting mediaVWR CHEMICALS361603E
Triglycerides colorimetric assay kitCayman Chemical10010303
Ultrasonic bathBandelin Sonorex TK 52
Vannas spring scissors - 3 mm
cutting edge		Fine Science Tools, Germany15000-00
ZEN Black softwareZeiss

Referanslar

  1. Klemm, R. W., Ikonen, E. The cell biology of lipid droplets: More than just a phase. Seminars in Cell & Developmental Biology. 108, 1-3 (2020).
  2. Martin, S., Parton, R. G. Lipid droplets: A unified view of a dynamic organelle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 373-378 (2006).
  3. Thiele, C., Penno, A., Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. Lipid droplets. Encyclopedia of Cell Biology. , 273-278 (2016).
  4. Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. Lipid droplets and liver disease: From basic biology to clinical implications. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).
  5. Bickel, P. E., Tansey, J. T., Welte, M. A. PAT proteins, an ancient family of lipid droplet proteins that regulate cellular lipid stores. Biochimica et Biophysica Acta. 1791 (6), 419-440 (2009).
  6. Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
  7. Wang, L., Liu, J., Miao, Z., Pan, Q., Cao, W. Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937 (2021).
  8. Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
  9. Jackson, C. L. Lipid droplet biogenesis. Current Opinion in Cell Biology. 59, 88-96 (2019).
  10. Onal, G., Kutlu, O., Gozuacik, D., Dokmeci Emre, S. Lipid droplets in health and disease. Lipids in Health and Disease. 16 (1), 128 (2017).
  11. Wang, H., Quiroga, A. D., Lehner, R., Yang, H., Li, P. Lipid Droplets. Methods in Cell Biology. , 107-127 (2013).
  12. Listenberger, L. L., Brown, D. A. Fluorescent detection of lipid droplets and associated proteins. Current Protocols in Cell Biology. , (2007).
  13. Welte, M. A., Gould, A. P. Lipid droplet functions beyond energy storage. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1260-1272 (2017).
  14. Roberts, M. A., Olzmann, J. A. Protein quality control and lipid droplet metabolism). Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 115-139 (2020).
  15. Filali-Mouncef, Y., et al. The ménage à trois of autophagy, lipid droplets and liver disease. Autophagy. 18 (1), 50-72 (2022).
  16. Bandyopadhyay, D., et al. Lipid droplets promote phase separation of Ago2 to accelerate Dicer1 loss and decelerate miRNA activity in lipid exposed hepatic cells. bioRxiv. , (2020).
  17. Farías, M. A., Diethelm-Varela, B., Navarro, A. J., Kalergis, A. M., González, P. A. Interplay between lipid metabolism, lipid droplets, and DNA virus infections. Cells. 11 (14), 2224 (2022).
  18. Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: Lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
  19. Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. The Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).
  20. Xu, S., Zhang, X., Liu, P. Lipid droplet proteins and metabolic diseases. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (5), 1968-1983 (2018).
  21. Herms, A., et al. Cell-to-cell heterogeneity in lipid droplets suggests a mechanism to reduce lipotoxicity. Current Biology. 23 (15), 1489-1496 (2013).
  22. Hooper, A. J., Adams, L. A., Burnett, J. R. Genetic determinants of hepatic steatosis in man. Journal of Lipid Research. 52 (4), 593-617 (2011).
  23. Parafati, M., Kirby, R. J., Khorasanizadeh, S., Rastinejad, F., Malany, S. A nonalcoholic fatty liver disease model in human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes, created by endoplasmic reticulum stress-induced steatosis. Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2018).
  24. Nassir, F., Rector, R. S., Hammoud, G. M., Ibdah, J. A. Pathogenesis and prevention of hepatic steatosis. Gastroenterology & Hepatology. 11 (3), 167-175 (2015).
  25. Starekova, J., Reeder, S. B. Liver fat quantification: Where do we stand. Abdominal Radiology. 45 (11), 3386-3399 (2020).
  26. Fabbrini, E., Sullivan, S., Klein, S. Obesity and nonalcoholic fatty liver disease: Biochemical, metabolic, and clinical implications. Hepatology. 51 (2), 679-689 (2010).
  27. Kristiansen, M. N. B., Veidal, S. S., Christoffersen, C., Jelsing, J., Rigbolt, K. T. G. Molecular characterization of microvesicular and macrovesicular steatosis shows widespread differences in metabolic pathways. Lipids. 54 (1), 109-115 (2019).
  28. Tsutsumi, V., Nakamura, T., Ueno, T., Torimura, T., Aguirre-García, J., Muriel, P. Chapter 2: Structure and ultrastructure of the normal and diseased liver. Liver Pathophysiology. , 23-44 (2017).
  29. Tandra, S., et al. Presence and significance of microvesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 55 (3), 654-659 (2011).
  30. Nascimbeni, F., et al. Clinical relevance of liver histopathology and different histological classifications of NASH in adults. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 351-367 (2018).
  31. Yerian, L. Histopathological evaluation of fatty and alcoholic liver diseases. Journal of Digestive Diseases. 12 (1), 17-24 (2011).
  32. Stöppeler, S., et al. Gender and strain-specific differences in the development of steatosis in rats. Laboratory Animals. 47 (1), 43-52 (2013).
  33. Hübscher, S. G., Saxena, R. Alcohol-induced liver disease. Practical Hepatic Pathology: A Diagnostic Approach (Second Edition). , 371-390 (2018).
  34. Sethunath, D., et al. Automated assessment of steatosis in murine fatty liver. PLoS One. 13 (5), e0197242 (2018).
  35. Sinton, M. C., et al. Macrovesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease is a consequence of purine nucleotide cycle driven fumarate accumulation. bioRxiv. , (2020).
  36. de Conti, A., et al. Characterization of the variability in the extent of nonalcoholic fatty liver induced by a high-fat diet in the genetically diverse collaborative cross mouse model. The FASEB Journal. 34 (6), 7773-7785 (2020).
  37. Virarkar, M., Szklaruk, J., Jensen, C. T., Taggart, M. W., Bhosale, P. What's new in hepatic steatosis. Seminars in Ultrasound, CT and MRI. 42 (4), 405-415 (2021).
  38. Le, T. T., Ziemba, A., Urasaki, Y., Brotman, S., Pizzorno, G. Label-free evaluation of hepatic microvesicular steatosis with multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. PLoS One. 7 (11), e51092 (2012).
  39. Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials. 11 (9), 1768 (2018).
  40. Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8 (1), 42 (2015).
  41. Daemen, S., van Zandvoort, M. A. M. J., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2015).
  42. Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 598358 (2011).
  43. Prats, C., et al. An optimized histochemical method to assess skeletal muscle glycogen and lipid stores reveals two metabolically distinct populations of type I muscle fibers. PLoS One. 8 (10), e77774 (2013).
  44. Nakano, T., et al. Ezetimibe impairs transcellular lipid trafficking and induces large lipid droplet formation in intestinal absorptive epithelial cells. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1865 (12), 158808 (2020).
  45. Adomshick, V., Pu, Y., Veiga-Lopez, A. Automated lipid droplet quantification system for phenotypic analysis of adipocytes using CellProfiler. Toxicology Mechanisms and Methods. 30 (5), 378-387 (2020).
  46. Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
  47. Martinez-Lopez, N., Singh, R. Autophagy and lipid droplets in the liver. Annual Review of Nutrition. 35, 215-237 (2015).
  48. Collot, M., et al. Ultrabright and fluorogenic probes for multicolor imaging and tracking of lipid droplets in cells and tissues. Journal of the American Chemical Society. 140 (16), 5401-5411 (2018).
  49. Selvais, C. M., De Cock, L. L., Brichard, S. M., Davis-Lopez de Carrizosa, M. A. Fiber type and subcellular-specific analysis of lipid droplet content in skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: Jove. (184), e63718 (2022).
  50. Zhuang, H., et al. Long-term high-fat diet consumption by mice throughout adulthood induces neurobehavioral alterations and hippocampal neuronal remodeling accompanied by augmented microglial lipid accumulation. Brain, Behavior, and Immunity. 100, 155-171 (2022).
  51. Chen, J., Yue, F., Kuang, S. Labeling and analyzing lipid droplets in mouse muscle stem cells. STAR Protocols. 3 (4), 101849 (2022).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyokimyaSay 196Lipid damlac klarBODIPY 493 503floroforn tr lipitlerlazer taramal konfokal analizmikro vezik lermakrovezik lerhepatik steatoz

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır